耐紫杉醇卵巢癌细胞模型的建立的制作方法
【专利摘要】本发明涉及耐紫杉醇卵巢癌细胞模型的建立，具体方法为：分别用PTX干预OVCAR-3细胞和SK-OV-3细胞，然后换无PTX培养基，至细胞生长恢复正常即细胞稳定生长、形态饱满、无漂浮死细胞、传代密度为30％的情况下3至5天可长至90％后再开始正常传代并提高PTX的浓度，每次干预时间为24小时，最终获得保藏号为CCTCC C2014203和CCTCC C2014204的耐紫杉醇卵巢癌细胞模型。本发明的方法是通过密切观测细胞生长状态选择干预时机，建立的细胞模型耐药系数均处于较高水平且耐药稳定性好，因此可用于卵巢癌耐药机制、卵巢癌耐药逆转、预防化疗耐药和提高化疗敏感性方面的研究。CCTCC C201420420141113CCTCC C201420320141113
【专利说明】耐紫杉醇卵巢癌细胞模型的建立 【【技术领域】】
[0001] 本发明涉及细胞模型的建立，具体地说，涉及耐紫杉醇卵巢癌细胞模型的建立。 【【背景技术】】
[0002] 卵巢癌是致女性死亡的首位生殖道恶性肿瘤，其治疗主要在肿瘤细胞减灭术的基 础上紫杉醇联合钼类化疗，此方案初治治疗效果好，但易发生耐药，而耐药后再化疗效果很 差。普通卵巢癌细胞株在研究卵巢癌耐药机制中存在局限性，而卵巢癌耐药细胞株更能从 分子生物学角度来研究其耐药机制，有助于进一步寻找卵巢癌耐药后的治疗方法。
[0003] 中国期刊《肿瘤》2006年第8期，刊出的论文"卵巢癌紫杉醇耐药细胞株0C3/ TAX300建立及基因表达谱分析"，采用反复大剂量紫杉醇冲击法，由亲本细胞0C3建立卵巢 癌紫杉醇耐药细胞株0C3/TAX300,耐药株历时10个月建成，耐药性稳定，耐药指数为6. 70。
[0004] 中国期刊《山东医药》2008年第48卷第6期，刊出的论文"卵巢癌紫杉醇耐药细 胞株的建立及其耐药机制研究"，选用卵巢癌细胞株SK0V3,以浓度为300 μ g/ml的TAX反复 大剂量冲击用药，培养8个月后建立了 TAX耐药细胞株，命名为SK0V3/TAX，该细胞已反复传 代3个月以上，结果SK0V3/TAX细胞耐药性稳定，耐药指数（RI)为10. 57。
[0005] 中国期刊《中国药师》2008年第10期，刊出的论文"不同方法建立卵巢癌紫杉醇耐 药细胞株对临床用药方案的启发"，用不同的诱导耐药方法培养紫杉醇耐药细胞株A2780/ Taxol，A278(V (DDP+Taxol)，A2780/Taxol-1，具体方法是：采用逐步增加药物浓度和大剂量 冲击两种方法处理细胞，直至细胞能在2. 5 μ g ?πιΓ1紫杉醇中稳定生长，MTT法检测A2780， A2780/DDP细胞对紫杉醇的药物半数抑制浓度（IC50)分别为（0. 23±0. 04) μ g · πιΓ1和 (0. 26±0. 02) μ g · πιΓ1，采用逐步增加药物浓度诱导法历经九个月时间建立A2780的紫杉 醇耐药细胞株A2780/Taxol-1，对紫杉醇的IC50为（6. 63±0. 31) μ g · πιΓ1，耐药倍数为 28.83。
[0006] 以上均通过逐步诱导的方法建立了耐紫杉醇卵巢癌细胞模型，然而其耐药指数仍 然较低，如果细胞模型要能用于耐药机制等研究，则要求具备良好的耐药稳定性。另外，目 前尚无耐紫杉醇的0VCAR-3卵巢癌细胞株。
[0007] 综上所述，建立耐药指数更高、耐药稳定性更好的细胞模型仍然是十分必要的。 【
【发明内容】
】
[0008] 本发明的第一个目的是针对现有技术中的不足，提供一种耐紫杉醇卵巢癌细胞模 型的建立方法。
[0009] 本发明的第二个目的是，提供一种耐紫杉醇卵巢癌细胞模型。
[0010] 本发明的第三个目的是，提供所述的耐紫杉醇卵巢癌细胞模型的用途。
[0011] 为实现上述第一个目的，本发明采取的技术方案是：
[0012] 一种耐紫杉醇卵巢癌细胞模型的建立方法，它包括以下步骤：
[0013] a)培养 0VCAR-3 细胞和 SK-0V-3 细胞；
[0014] b) 0VCAR-3细胞和SK-0V-3细胞分别用PTX开始干预，然后换无 PTX培养基，至细 胞生长恢复正常即细胞稳定生长、形态饱满、无漂浮死细胞、传代密度为30%的情况下3至 5天可长至90%后再开始正常传代并提高PTX的浓度，每次PTX的干预时间均为24小时；
[0015] c)对干预后的0VCAR-3细胞和SK-0V-3细胞进行检测，获得耐紫杉醇卵巢癌细胞 模型。
[0016] 所述的耐紫杉醇卵巢癌细胞模型的保藏号分别为CCTCC C2014203和CCTCC C2014204。
[0017] 实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是：
[0018] 作为本发明的一种技术方案，所述的耐紫杉醇卵巢癌细胞模型的保藏号为CCTCC C2014203,细胞株命名为0V3R-PTX。
[0019] 所述的保藏号为CCTCC C2014203耐紫杉醇卵巢癌细胞模型可用于研究卵巢癌耐 药机制、寻找卵巢癌耐药逆转的靶点、筛选治疗卵巢癌的药物。
[0020] 作为本发明的另一种技术方案，所述的耐紫杉醇卵巢癌细胞模型的保藏号为 CCTCC C2014204,细胞株命名为 SK3R-PTX。
[0021] 所述的保藏号为CCTCC C2014204耐紫杉醇卵巢癌细胞模型可用于研究卵巢癌耐 药机制、寻找卵巢癌耐药逆转的靶点、筛选治疗卵巢癌的药物。
[0022] 本发明优点在于：
[0023] 本发明通过科学的方法建立了两株耐紫杉醇卵巢癌细胞模型，建立细胞模型的过 程不是机械式设置药物浓度梯度和定期传代，最后筛选出存活的细胞系，而是密切观测细 胞生长状态，待达到细胞形态饱满，无漂浮死细胞，细胞密度为30%的情况下3至5天可长 至90%后再开始正常传代并提高PTX的浓度，通过该方法建立了两株耐紫杉醇卵巢癌细胞 模型，其耐药系数均显著高于现有的耐紫杉醇卵巢癌细胞模型，且耐药稳定性好。所以本发 明的第三个目的是此模型可用于卵巢癌耐药机制、卵巢癌耐药逆转、预防化疗耐药和提高 化疗敏感性方面的研究。 【【具体实施方式】】
[0024] 下面对本发明提供的【具体实施方式】作详细说明。
[0025] 实施例1
[0026] 一、材料
[0027] 0VCAR-3细胞、SK-0V-3细胞购自美国ATCC公司。
[0028] 紫杉醇（PTX)购自太极集团四川太极制药有限公司：30mg/5ml/支。
[0029] 紫杉醇工作液用细胞培养基（RPMI-1640+10% FBS，购自美国Gibco公司）配制。
[0030] 二、建株步骤
[0031] I) 0VCAR-3 细胞和 SK-0V-3 细胞用 RPMI-1640+10 % FBS+100U/ml 青霉素 +0· Img/ ml链霉素培养。
[0032] 2)两株细胞分别用PTX起始浓度为0. 01 μ M开始干预，给予PTX 24小时后换无药 培养基（RPMI-1640+10% FBS+100U/ml 青霉素 +0· lmg/ml 链霉素）。
[0033] 3)待细胞稳定生长、形态饱满、无漂浮死细胞、传代密度为30%的情况下3至5天 可长至90%后再开始正常传代（P)并提高PTX的浓度。
[0034] 母细胞0VCAR-3在第19代起（P19)到P20加0. ΟΙμΜ PTX干预，共3次，每次24小 时；在 Ρ21，加 0· ΙμΜ PTX 干预 1 次；在 Ρ22-Ρ32,加 0· 5μΜ PTX 干预，共 12 次；在 Ρ33-34， 加 ΙμΜ PTX干预，共2次；在Ρ34-Ρ38,加5μΜ PTX干预，共10次。细胞生长良好，-80°C 储存。
[0035] 母细胞 SK-0V-3在P18 起到 P19 加 Ο.ΟΙμΜ PTX 干预，共 3 次；在P20-P35,加 ΙμΜ PTX干预，共13次。细胞生长良好，-80°c储存。
[0036] 上述细胞每次干预24小时后更换无 PTX培养基，至细胞生长恢复正常（即细胞稳 定生长、形态饱满、无漂浮死细胞）后再进入下一轮PTX干预。历时5个月，最终在0VCAR-3 细胞株中PTX至5 μ M，标记为0V3R-PTX ;在SK-0V-3细胞株中PTX至1 μ M，标记SK3R-PTX。 0VCAR-3细胞共干预PTX 28次，SK-0V-3细胞共干预PTX 16次。耐药株建立过程中0VCAR-3 共传19代，SK-0V-3共传17代。耐药株已于2014年11月13日保藏于中国典型培养物保 藏中心（中国武汉大学，430072) ,0V3R-PTX保藏编号为CCTCC C2014203，SK3R-PTX保藏编 号为 CCTCC C2014204。
[0037] 4)计算半抑制浓度（IC50)和耐药系数（RI)。
[0038] 采用WST-I法（美国Roche公司）检测细胞存活率。每孔5000个0VCAR-3及 0V3R-PTX细胞和每孔3000个SK-0V-3及SK3R-PTX细胞分别接种至96孔培养板，24小时 后给予不同浓度的ΡΤΧ(0,0. 0001，0. 001，0. 01，0. 1，0. 5,1，5,10μ M)干预，48小时后每孔 加10 μ L WST-I试剂，在培养箱中37°C继续培养2小时，然后用酶标仪检测450nm波长的吸 光度。通过Graphpad Prism软件计算IC50。耐药系数（RI)=耐药株IC50/敏感株IC50。 耐药细胞建成后放_80°C冰柜冻存，1个月、6个月后复苏，再次检测耐药系数以确定其耐药 系数的稳定性。
[0039] 三、结果
[0040] 紫杉醇对各细胞株的IC50如表1所示。
[0041] 表1紫杉醇对各细胞株的IC50
[0042]
【权利要求】
1. 一种耐紫杉醇卵巢癌细胞模型的建立方法，其特征在于，它包括以下步骤： a) 培养0VCAR-3细胞和SK-0V-3细胞； b) 0VCAR-3细胞和SK-0V-3细胞分别用PTX开始干预，然后换无PTX培养基，至细胞生 长恢复正常即细胞稳定生长、形态饱满、无漂浮死细胞、传代密度为30%的情况下3至5天 可长至90%后再开始正常传代并提高PTX的浓度，每次PTX的干预时间均为24小时； c) 对干预后的OVCAR-3细胞和SK-OV-3细胞进行检测，获得耐紫杉醇卵巢癌细胞模型。
2. 根据权利要求1所述的建立方法，其特征在于，所述的耐紫杉醇卵巢癌细胞模型的 保藏号分别为 CCTCC C2014203 和 CCTCC C2014204。
3. -种耐紫杉醇卵巢癌细胞模型，其特征在于，所述的细胞模型的保藏号为CCTCC C2014203。
4. 权利要求3所述的耐紫杉醇卵巢癌细胞模型的用途，其特征在于，用于研究卵巢癌 耐药机制、寻找卵巢癌耐药逆转的靶点、筛选治疗卵巢癌的药物。
5. -种耐紫杉醇卵巢癌细胞模型，其特征在于，所述的细胞模型的保藏号为CCTCC C2014204。
6. 权利要求5所述的耐紫杉醇卵巢癌细胞模型的用途，其特征在于，用于研究卵巢癌 耐药机制、寻找卵巢癌耐药逆转的靶点、筛选治疗卵巢癌的药物。
【文档编号】C12Q1/02GK104388389SQ201410708515
【公开日】2015年3月4日 申请日期:2014年11月28日 优先权日:2014年11月28日
【发明者】许国雄, 张凌云 申请人:复旦大学附属金山医院