一种多胎羊的检测方法

一种多胎羊的检测方法
【专利摘要】本发明公开了一种多胎羊的检测方法，具体步骤为：DNA的提取；引物和探针的设计；PCR-LDR反应；取1μLLDR连接产物与1μLABIGS500ROX荧光标记分子量标准和1μL去离子甲酰胺上样液混合，95℃加热变性2min，冰中骤冷，于含有5mol/L尿素的5%聚丙烯酰胺凝胶中电泳2.5h，进行数据收集、泳道线校正、迁移片段大小测量和校正内在分子量标准，进行数据分析和基因分型。本发明利用连接酶检测反应技术及生物信息学技术，以碱基错配为基础，使用特异性引物和探针对特定片段DNA进行识别，具有准确度高、通用性强、通量大、操作简单、成本低等优点。
【专利说明】一种多胎羊的检测方法

【技术领域】
[0001] 本发明涉及分子生物【技术领域】，具体是一种多胎羊的检测方法。

【背景技术】
[0002] 绵羊育种主要是改善其生长和繁殖性状。迄今为止已发现了一些控制这些生长和 繁殖性状的基因，比如，BMPR-IB、BMP15和⑶F9已被确认为绵羊的高繁殖力主效基因；黑素 皮质素受体-4 (melanocortin-4receptor，MC4R)是一类G-蛋白偶联受体，主要在下丘脑表 达，在体重、能量平稳和采食量的调控中发挥重要作用；钙蛋白酶抑制蛋白（calpastatin， CAST)是钙蛋白酶系统的主要成员之一，它是钙激活蛋白酶的抑制因子，可以通过激活钙蛋 白酶或降低钙蛋白酶抑制蛋白的活性来提高肌肉的嫩度，改善肉质。
[0003] 随着分子遗传学的发展，利用分子标记辅助选择育种技术可以快速提高一些单胎 品种双胎率，或者提高其胎产羔数，从而大幅度提高其繁殖力。分子标记辅助选择是通过分 子生物学技术直接分析DNA分子的一些突变位点，可以准确判断基因型，而且不受时间的 限制，可以做到早期选择。
[0004] 目前检测DNA突变位点的方法一般采用限制性片段长度多态性技术和单链构象 多态性技术，这两种方法依靠肉眼进行结果的观察，有时会出现判断错误，从而影响检测结 果的可靠性。


【发明内容】

[0005] 本发明的目的在于提供一种多胎羊的检测方法，利用连接酶检测反应技术及生物 信息学技术，检测绵羊繁殖候选基因在绵羊中的多态性，从而判断出多胎羊。
[0006] 为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
[0007] -种多胎羊的检测方法，具体步骤如下：
[0008] (I) DNA的提取：从羊的颈静脉采血2ml，EDTA抗凝，血液充分混匀后-20°C冻存后， 采用细胞裂解和蛋白去除液从冻存的抗凝全血中得到基因组DNA ;
[0009] (2)引物和探针的设计：根据基因序列设计引物，同时根据LDR探针设计原则设计 探针；
[0010] (3) PCR-LDR反应，分为PCR反应和LDR反应；
[0011] (4)数据分析和基因分型：取IyL LDR连接产物与IyL ABI GS 500 ROX荧光 标记分子量标准和1 μ L去离子甲酰胺上样液混合，95°C加热变性2min，冰中骤冷，于含有 5mol/L尿素的5%聚丙烯酰胺凝胶中电泳2. 5h，进行数据收集、泳道线校正、迁移片段大小 测量和校正内在分子量标准；进行数据分析和基因分型。
[0012] 作为本发明进一步的方案：所述步骤（1)还包括采用0. 8%的琼脂糖凝胶电泳检 测基因组DNA的完整性。
[0013] 作为本发明进一步的方案：所述PCR反应包括以下小步骤：
[0014] 1)准备 20uL 体系 PCR Master Mix
[0015] 在 I. 5ml 离心管中分别加入 10 X PCR-buffer200ul，IOOmM Mg2+60ul，20mM/each (11'011>20〇111，511/111139酶2〇111，4\(>)-8〇1111:;[011400111，5卩]\1。1'；[111640111，最后加入980111去 离子水，充分混匀后离心，再取19ul分装在200ul的PCR反应管中，最后再加入Iul基因组 DNA ；
[0016] 2)将PCR反应管放入PCR仪进行反应，反应程序为：95°C变性15m，35个循环，每 个循环有3个温度，94°C 30s，56°C lm，72°C lm，最后在72°C延伸7m;
[0017] 3)反应结束后，取2 μ I反应产物在3.0%琼脂糖胶，0.5XTBE中电泳，检测反应是 否成功；
[0018] 4)剩余样品保存于-20°C。
[0019] 作为本发明进一步的方案：所述LDR反应包括以下小步骤：
[0020] 1)准备IOul体系连接反应Mix
[0021] 在PCR反应产物中加入等体积ddH20稀释，作为连接反应的模板；
[0022] 2)在 I. 5ml 离心管中分别加入 lOXbufferlOOul，IOOul Probe Mix，5ul 连接酶， 695ul去离子水，充分混匀后离心，再取9ul分装在200ul的PCR反应管中，最后再加入 IulPCR反应产物；
[0023] 3)将PCR反应管放入PCR仪进行连接反应，反应程序为：95°C变性2m，35个循环， 每个循环有2个温度，94°C 30s，50°C 2m。
[0024] 作为本发明进一步的方案：所述基因序列包括但不限于BMPR-IB基因、BMP15基 因、⑶F9基因、MC4R基因和CAST基因。
[0025] 作为本发明进一步的方案：所述方法还包括卡方检验、遗传参数和最小二乘方差 分析。
[0026] 与现有技术相比，本发明的有益效果是：利用连接酶检测反应技术及生物信息学 技术，以碱基错配为基础，使用特异性探针对特定片段DNA进行识别，具有很高的准确性； 同时，靶序列由引物和探针双重控制，特异性好、假阳性低；具有准确度高、通用性强、通量 大、操作简单、成本低等优点。

【专利附图】

【附图说明】
[0027] 图1是全血基因组DNA抽提结果电泳图；
[0028] 图2是巴音布鲁克羊多羔小群谱系图；
[0029] 图3是巴音布鲁克羊单羔家系谱系图；
[0030] 图4是巴音布鲁克羊BMPRlB基因 FecB突变位点的荧光-构象敏感凝胶电泳图；
[0031] 图5是⑶F9基因 Gl突变位点的荧光-构象敏感凝胶电泳图。

【具体实施方式】
[0032] 下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述， 显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的 实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都 属于本发明保护的范围。
[0033] -、主要仪器和设备：
[0034] PCR仪；PERKIN ELMER Gene Amp PCR system 9600、MJ PTC-200Gradient Cycler， 爱普拜斯应用生物系统上海有限公司；
[0035] 测序仪；ABI PRISM 377DNA Sequencer、ABI PRISM 3100DNA Sequencer，爱普拜斯 应用生物系统上海有限公司；
[0036] 电泳系统：电泳仪型号：JY600+，北京君意东方电泳设备有限公司；FR-200A全自 动紫外与可见分析装置、生物电泳图像分析系统，上海复日科技有限公司；Agrose LE，上海 捷倍思基因技术有限公司；
[0037] 普通台式离心机、电热鼓风干燥箱；Axygene PCR microplate 96well ;Axygene PCR tubes (0· 2mL) ;Eppendorf 移液器（各量程）。
[0038] 二、主要试剂：
[0039] AxyPr印-96全血基因组DNA试剂盒（AXYGEN，美国）；
[0040] PCR 系统：Qiagen hotstar Taq 酶体系（酶 5u/ul，buffer，Q-solution，Mg2+), Qiagen Hotstar,德国；dNTP(promega,2mM/each),Promega,美国；
[0041] LDR 系统：NEB Taq DNA Iigase 酶体系（酶 5u/ul，buffer)，NEB，英国；
[0042] 10M NaOH :取40gNa0H于灭RNase处理的烧杯，加入约70ml无 RNase的ddH20，充 分搅拌溶解，定容到l〇〇ml，4°C保存；
[0043] IMTris-HCl (PH8. 0):取 12. IgTris 于灭 RNase 处理的烧杯，加入约 80ml 无 RNase 的ddH20,充分搅拌溶解，浓盐酸调PH8. 0,定容到100ml，4°C保存；
[0044] 0· 5M EDTA(PH8. 0):取 18. 61gEDTA 于灭 RNase 处理的烧杯，加入约 70ml 无 RNase 的ddH20,充分搅拌溶解，用10M NaOH调PH8. 0,定容到100ml，4°C保存；
[0045] TE 缓冲液：IOmM Tris-HCl，ImM EDTA，pH8. 0,4°C保存；
[0046] 75%乙醇：取新开瓶无水乙醇75ml，加入经过灭RNase处理的试剂瓶，加入 ddH2025ml，4°C 保存；
[0047] 5X上样缓冲液：溴酚兰0. 125g，32g甘油，灭菌水定容至50ml ;
[0048] EB (10mg/ml) :50mgEB，加 DEPC 水 5ml，分装成 0· 5ml 的包装，避光保存；
[0049] 5XTBE :Tris 54g，硼酸 27. 5g，20ml0. 5mol/L 的 EDTA(pH8. 0)，定容至 1000ml。
[0050] 三、检测对象
[0051] 将新疆巴州和静县八棵树乡牧民的巴音布鲁克羊多羔家系20只羊的亲缘小群标 记为群A，其谱系如图2所示，双羔率100%，将从新疆博湖县巴州种畜场的一个300多只巴 音布鲁克羊母羊群中随机选出的100只成年母羊标记为群B，其谱系如图3所示，均产单羔； 从内蒙古纯种德美种羊场选择2岁至7岁有产羔记录的德国肉用美利奴羊成年母羊254只 (产羔记录包括1-6胎的数据，双羔率150% )、成年公羊27只；在新疆巴州和静、焉耆、库 尔勒三个多浪羊养殖户中选择有产羔记录的多浪羊母羊83只（双羔率170% )。
[0052] 实施例IBMPR-IB基因检测
[0053] -种多胎羊的检测方法，具体步骤如下：
[0054] (I) DNA的提取：从羊的颈静脉采血2ml，EDTA抗凝，血液充分混匀后-20°C冻存后， 采用细胞裂解和蛋白去除液从冻存的抗凝全血中得到基因组DNA，采用0.8%的琼脂糖凝 胶电泳检测基因组DNA的完整性，如图1所示；
[0055] (2)引物和探针的设计：根据绵羊BMPR-IB基因序列（AF ;312016)设计1对引物 检测FecB突变，引物均采用Primer 5. O软件进行设计，同时根据LDR探针设计原则设计探 针，PCR反应引物序列及LDR反应探针序列，如表1-表2所示。所有引物与探针均由上海 生工生物工程有限公司合成。
[0056] 表IPCR反应引物序列 [00571

【权利要求】
1. 一种多胎羊的检测方法，其特征在于，具体步骤如下： (1) DNA的提取：从羊的颈静脉采血2ml，EDTA抗凝，血液充分混匀后-20°C冻存后，采 用细胞裂解和蛋白去除液从冻存的抗凝全血中得到基因组DNA ; (2) 引物和探针的设计：根据基因序列设计引物，同时根据LDR探针设计原则设计探 针； (3) PCR-LDR反应，分为PCR反应和LDR反应； (4) 数据分析和基因分型：取ly L LDR连接产物与liiL ABI GS 500 ROX荧光标记分 子量标准和1 U L去离子甲酰胺上样液混合，95°C加热变性2min，冰中骤冷，于含有5mol/L 尿素的5%聚丙烯酰胺凝胶中电泳2. 5h，进行数据收集、泳道线校正、迁移片段大小测量和 校正内在分子量标准；进行数据分析和基因分型。
2. 根据权利要求1所述的多胎羊的检测方法，其特征在于，所述步骤（1)还包括采用 0. 8%的琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA的完整性。
3. 根据权利要求1所述的多胎羊的检测方法，其特征在于，所述PCR反应包括以下小步 骤： 1) 准备 20uL 体系 PCR Master Mix 在 1. 5ml 离心管中分别加入 10XPCR-buffer200ul，100mM Mg2+ 60ul，20mM/each dNTP 200ul，5U/ul Taq 酶 20ul，4XQ_solution400ul，5pM primer40ul，最后加入 980ul 去离子 水，充分混匀后离心，再取19ul分装在200ul的PCR反应管中，最后再加入lul基因组DNA ; 2) 将PCR反应管放入PCR仪进行反应，反应程序为：95°C变性15m，35个循环，每个循 环有 3 个温度，94°C 30s，56°C lm，72°C lm，最后在 72°C延伸 7m ; 3) 反应结束后，取2 yl反应产物在3. 0%琼脂糖胶，0. 5 X TBE中电泳，检测反应是否成 功； 4) 剩余样品保存于_20°C。
4. 根据权利要求1所述的多胎羊的检测方法，其特征在于，所述LDR反应包括以下小步 骤： 1) 准备10ul体系连接反应Mix 在PCR反应产物中加入等体积ddH20稀释，作为连接反应的模板； 2) 在 1. 5ml 离心管中分别加入 10 XbufferlOOul，100ul Probe Mix，5ul 连接酶，695ul 去离子水，充分混匀后离心，再取9ul分装在200ul的PCR反应管中，最后再加入lulPCR反 应产物； 3) 将PCR反应管放入PCR仪进行连接反应，反应程序为：95°C变性2m，35个循环，每个 循环有2个温度，94°C 30s，50°C 2m。
5. 根据权利要求1所述的多胎羊的检测方法，其特征在于，所述基因序列包括但不限 于BMPR-IB基因、BMP15基因、⑶F9基因、MC4R基因和CAST基因。
6. 根据权利要求1所述的多胎羊的检测方法，其特征在于，所述方法还包括卡方检验、 遗传参数和最小二乘方差分析。
【文档编号】C12Q1/68GK104328214SQ201410710810
【公开日】2015年2月4日 申请日期:2014年11月29日 优先权日:2014年11月29日
【发明者】左北瑶 申请人:新疆巴音郭楞蒙古自治州畜牧工作站