兔源猪瘟脾淋苗与牛源猪瘟细胞苗的鉴别引物和鉴别方法
【专利摘要】本发明提供了一种兔源猪瘟脾淋苗和牛源猪瘟细胞苗的鉴别引物和鉴别方法，本发明利用兔和牛线粒体具有种属特异性的特点，筛选出特异性的4种引物序列，建立相应的PCR方法，鉴别方法如下：提取猪瘟疫苗样品的DNA；PCR反应体系为25μL，各种成分为Buffer、dNTP、Mg2+、4种引物、Taq、样品DNA，用双蒸水补齐到25μL，进行PCR；取PCR反应产物用琼脂糖凝胶电泳检测，观察、照相和记录，根据电泳结果与提供的标准图谱对比，进行鉴别。本发明所述鉴别方法无需依赖深厚的专业背景，也无需借助昂贵的精密仪器，具有准确快捷、客观公正、经济实用的特点。
【专利说明】兔源猪瘟脾淋苗与牛源猪瘟细胞苗的鉴别引物和鉴别方法
【技术领域】
[0001]本发明属于兽用生物制品【技术领域】，涉及兽用生物制品【技术领域】鉴别的引物和鉴别方法，具体涉及兔源猪瘟脾淋苗与牛源猪瘟细胞苗的鉴别引物和鉴别方法。
【背景技术】
[0002]猪痕(classicalswine fever, CSF)是由猪痕病毒(classical swine fevervirus，CSFV)引起的一种以稽留高热、出血和高死亡率为主要特征的高度接触性传染病。目前该病主要流行于亚洲、欧洲、南美洲，是影响我国猪群健康的最主要疫病，也是动物防疫的最重要疫病。我国自上世纪60年代发明和应用猪瘟兔化牛睾丸细胞苗以来，有效地改善了我国猪群的发病状态，特别是近年来猪瘟兔体脾淋苗的应用和推广，更进一步提高了动物的健康状况，有效提升了养猪场的经济效益。我国目前猪瘟疫苗的生产厂家有数十家之多，猪瘟疫苗的总产量可达20亿头份，生产的猪瘟疫苗主要有两种:猪瘟脾淋苗(兔源)与猪瘟细胞苗(牛源)。前者是将猪瘟疫苗毒株接种家兔，然后将家兔处死，取家兔的脾脏和淋巴结制备成猪瘟脾淋苗(兔源)；后者是将猪瘟疫苗毒株接种牛睾丸传代细胞，收获细胞液制备猪瘟细胞苗(牛源)。尽管猪瘟兔体脾淋苗的免疫效果优于猪瘟牛睾丸细胞苗，但其成本也相应地高于猪瘟牛睾丸细胞苗，因此有些不法厂家往往在猪瘟兔体脾淋苗中掺入大量牛睾丸细胞苗，导致猪瘟疫苗的有效滴度降低，由此造成临床免疫效果不佳。
[0003]目前国内外均没有可以鉴别两种不同猪瘟疫苗相互掺假的问题，难以对猪瘟脾淋苗中掺入猪瘟细胞苗的情况进行鉴定检测，这已成为目前影响动物防疫的一大难题，急需解决。
【发明内容】
[0004]针对上述【技术领域】的现状，本发明提供了一种兔源猪瘟脾淋苗与牛源猪瘟细胞苗的鉴别引物和鉴别方法，本发明的发明目的之一是从生产疫苗的兔源和牛源出发，根据动物线粒体基因组具有种属特异性的原理，通过大量试验筛选了 2对特异性的能够区别兔源猪瘟脾淋苗与牛源猪瘟细胞苗的鉴别引物。本发明的发明目的之二是利用上述鉴别引物建立了相应的PCR鉴别方法，依据特异性的PCR扩增结果判断某种猪瘟疫苗的来源，从而达到鉴别兔源猪瘟脾淋苗与牛源猪瘟细胞苗之目的。
[0005]为实现上述发明目的，本发明是通过如下技术方案实现的:
猪瘟脾淋苗(兔源)与猪瘟细胞苗(牛源)的鉴别引物，所述引物序列为:
针对牛源猪痕细胞苗的上游引物:BF1:5’ - accataaagaactccatcaacaag -3’ ；
针对牛源猪痕细胞苗的下游引物:BR1:5’ - acccgtaatataagcctcgtc -3’ ；
针对兔源猪痕脾淋苗的上游引物:RF1:5’ - tcagacattcaaattttcgcatca -3’ ；
针对兔源猪痕脾淋苗的下游引物:RR1:5’ - ttaatagaggtaggtttggttgtg _3，。
[0006]本发明与现有技术相比有许多优点和积极效果:本发明所建立的鉴别方法基于分子生物学技术原理建立的区别兔源猪瘟脾淋苗与牛源猪瘟细胞苗的新方法，它根据动物线粒体基因组具有种属特异性的原理，通过大量试验筛选了 2对特异性的能够区别兔源猪瘟脾淋苗与牛源猪瘟细胞苗的鉴别引物，并建立了相应的PCR鉴别方法。本发明所述鉴别方法无需依赖深厚的专业背景，也无需借助昂贵的精密仪器，具有准确快捷、客观公正、经济实用的特点。
【专利附图】
【附图说明】
[0007]图1是本发明中牛源猪瘟细胞苗用引物对BF1/BR1的PCR扩增结果。
[0008]图2是本发明中兔源猪瘟脾淋苗用引物对RF1/RR1的PCR扩增结果。
[0009]图3是用本发明中的引物对BF1/BR1对市场上销售的兔源猪瘟脾淋苗进行PCR扩增的掺假识别鉴定结果。
[0010]图4是用本发明中的引物对RF1/RR1对市场上销售的牛源猪瘟细胞苗进行PCR扩增的掺假识别鉴定结果。
【具体实施方式】
[0011]下面结合附图和实施例对本发明的技术方案作进一步详细的描述。
[0012]实施例1
本发明根据动物线粒体基因组具有种属特异性的原理，通过大量试验筛选了 2对特异性的能够区别兔源猪瘟脾淋苗与牛源猪瘟细胞苗的鉴别引物，所述2对引物序列为:
针对牛源猪痕细胞苗的上游引物:BF1:5’ - accataaagaactccatcaacaag -3’ ；
针对牛源猪痕细胞苗的下游引物:BR1:5’ - acccgtaatataagcctcgtc -3’ ；
针对兔源猪痕脾淋苗的上游引物:RF1:5’ - tcagacattcaaattttcgcatca -3’ ；
针对兔源猪痕脾淋苗的下游引物:RR1:5’ - ttaatagaggtaggtttggttgtg _3，。
[0013]本发明还提供了利用上述鉴别引物的兔源猪瘟脾淋苗与牛源猪瘟细胞苗的鉴别方法。利用所述引物和鉴别方法鉴别来源于某生物试剂公司制备的纯正兔源猪瘟脾淋苗和牛源猪瘟细胞苗(确保不相互掺假)。
[0014]按照常规方法采用酚/氯仿抽提法(参见黄培堂等译《分子克隆实验指南》(第三版)，科学出版社，2002年9月)提取所述兔源猪瘟脾淋苗与牛源猪瘟细胞苗的DNA，利用本发明中提供的4种引物，对其基因组进行两轮PCR扩增。
[0015]PCR反应体系为25yL，各种成分及终浓度为:Buffer 1mM, dNTP 0.2mM, Mg2+1.5mM，加入I对引物BF1/BR1 (或RF1/RR1) 0.2mM，Taq 1U,猪瘟脾淋苗(兔源)或猪瘟细胞苗(牛源)DNA 50ng，用双蒸水补齐到25yL。PCR反应程序是95 °C 5min, (95 °C30sec — 55°C 30sec — 72°C lmin) X 30 个循环—72°C 1min0
[0016]两轮PCR分别用BF1/BR1和RF1/RR1引物对待测样品进行PCR检测。除引物外，其PCR反应体系和反应程序均相同。
[0017]PCR反应结束后,取8 μ L扩增产物用琼脂糖凝胶电泳检测,加入Genefinder，然后在紫外透射反射分析仪下观察、照相和记录，根据电泳结果与提供的标准图谱对比。
[0018]实验结果如图1和2所示，图1为牛源猪瘟细胞苗用引物对BF1/BR1的PCR扩增结果，其中，泳道2-5为纯正牛源猪瘟细胞苗样品，泳道6为不含纯正牛源猪瘟细胞苗的阴性对照，其他组分与泳道2-5相同；泳道I为DL2000 Marker,自上向下，大小依次为:2000bp，lOOObp, 750bp, 500bp, 250bp, lOObp。泳道2_5均出现了 699bp,序列如序列表中序列1所示，此序列为牛源猪瘟细胞苗的线粒体基因组特异性序列，所以说明泳道2-5所对应的疫苗均为纯正未掺杂兔源猪瘟脾淋苗的牛源猪瘟细胞苗。
[0019]图2为兔源猪瘟脾淋苗用引物对RF1/RR1的PCR扩增结果，其中，泳道2_5为纯正兔源猪瘟脾淋苗样品，泳道6为不含纯正兔源猪瘟脾淋苗的阴性对照，其他组分与泳道2-5 相同；泳道 1 为 DL2000 Marker,自上向下，大小依次为:2000bp, lOOObp, 750bp, 500bp,250bp，lOObp。泳道2-5均出现了 345bp，序列如序列表中序列2所示，此序列为兔源猪瘟脾淋苗的线粒体基因组特异性序列，所以说明泳道2-5所对应的疫苗均为纯正未掺杂牛源猪瘟细胞苗的兔源猪瘟脾淋苗。
[0020]实施例2
从市场上购买市场上正在销售的48份猪瘟疫苗，其中，不同批次的兔源猪瘟脾淋苗24份，不同批次的牛源猪瘟细胞苗24份。按照实施例1所述酚/氯仿抽提法提取上述24份猪瘟脾淋苗和24份猪瘟细胞苗的DNA，利用本发明中提供的4种引物，对其基因组分别利用BF1/BR1和RF1/RR1两对引物进行两轮PCR扩增。
[0021]PCR反应体系为25μ L，各种成分及终浓度为Buffer 10mM, dNTP 0.2mM, Mg2+1.5mM，加入1对引物BF1/BR1 (或RF1/RR1) 0.2mM，Taq 1U，提取的所述猪瘟疫苗的DNA 50ng，用双蒸水补齐到 25μ L。PCR 反应程序是 95°C 5min, (95 °C 30sec — 55 °C30sec — 72°C lmin) X30 个循环—72°C lOmin。
[0022]PCR反应结束后，取8 μ L扩增产物用琼脂糖凝胶电泳检测，加入Genefinder,然后在紫外透射反射分析仪下观察、照相和记录，根据电泳结果与提供的标准图谱对比。
[0023]图3是用本发明中的BF1/BR1引物对市场上销售的兔源猪瘟脾淋苗进行PCR扩增的掺假识别鉴定结果，泳道1-8，10-25为上述猪瘟疫苗中选取的24份兔源猪瘟脾淋苗，其中泳道 9 为 DL2000 Marker,自上向下，大小依次为:2000bp, lOOObp, 750bp, 500bp, 250bp,100bp，其余泳道为样品检测的PCR结果，表明样品5，6，16，17和19掺入了牛源猪瘟细胞苗。
[0024]图4是用本发明中的RF1/RR1引物对市场上销售的牛源猪瘟细胞苗进行PCR扩增的掺假识别鉴定结果，泳道1-12，14-25为选取的24份牛源猪瘟细胞苗，泳道13为DL2000Marker,自上向下，大小依次为:2000bp，lOOObp, 750bp, 500bp, 250bp, lOObp,其余泳道为样品检测的PCR结果，表明除了样品1，2，22以外，其余样品均掺入了兔源脾淋苗。
[0025]在使用本发明所述引物和鉴别方法具体采样鉴别时，具体分以下情况判断: 如果待检测猪瘟疫苗第一轮PCR用引物对BF1/BR1扩增后仅出现一条大小为699bp片段，第二轮PCR用RF1/RR1引物扩增后均未出现一条大小为345bp片段的条带，表明待测猪瘟疫苗全部为牛源猪瘟细胞苗，没有掺入兔源猪瘟脾淋苗；
如果待检测猪瘟疫苗第一轮PCR用引物对BF1/BR1扩增后未出现一条大小为699bp片段，第二轮PCR用RF1/RR1引物扩增后均出现一条大小为345bp片段的条带，表明待测猪瘟疫苗全部为兔源猪瘟脾淋苗，没有掺入牛源猪瘟细胞苗；
如果第一轮PCR用引物对BF1/BR1扩增后出现一条大小为699bp片段，同时第二轮PCR用RF1/RR1引物扩增后出现一条大小为345bp片段的条带，则说明待测猪瘟疫苗中含有牛源猪瘟细胞苗和兔源猪瘟脾淋苗。
[0026]以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。
【权利要求】
1.兔源猪瘟脾淋苗与牛源猪瘟细胞苗的鉴别引物，其特征在于所述引物序列为: 针对牛源猪痕细胞苗的上游引物:BF1:5’ - accataaagaactccatcaacaag -3’ ； 针对牛源猪痕细胞苗的下游引物:BR1:5’ - acccgtaatataagcctcgtc -3’ ； 针对兔源猪痕脾淋苗的上游引物:RF1:5’ - tcagacattcaaattttcgcatca -3’ ； 针对兔源猪痕脾淋苗的下游引物:RR1:5’ - ttaatagaggtaggtttggttgtg _3，。
2.利用权利要求1所述鉴别引物的兔源猪瘟脾淋苗与牛源猪瘟细胞苗的鉴别方法，其特征在于所述鉴别方法的步骤如下: 1)提取待测猪瘟疫苗样品的DNA； 2)PCR扩增反应包括第一轮PCR反应和第二轮PCR反应，所述第一轮PCR反应所用引物对为BF1/BR1和RF1/RR1中的一种，第二轮PCR反应所用引物对为BF1/BR1和RF1/RR1中的另一种； 所述两轮PCR反应体系均为25 μ L:包括Buffer 1mM, dNTP 0.2mM, Mg2+ 1.5mM,每种引物0.2mM, Taq 1U，待测猪瘟疫苗样品的DNA 50ng，用双蒸水补齐到25 μ L ； 3)电泳染色对比图谱:取PCR扩增反应后的产物用琼脂糖凝胶电泳检测，加入Genefinder,然后在紫外透射反射分析仪下观察、照相和记录； 如果引物对BF1/BR1扩增的样品出现一条大小为699bp片段，同时引物对RF1/RR1扩增的样品未出现一条大小为345bp片段，则表明该样品为牛源猪瘟细胞苗； 如果引物对BF1/BR1扩增的样品未出现一条大小为699bp片段，同时引物对RF1/RR1扩增的样品出现一条大小为345bp片段，则表明该样品为兔源猪瘟脾淋苗； 如果引物对BF1/BR1扩增的样品出现一条大小为699bp片段，同时引物对RF1/RR1扩增的样品出现一条大小为345bp片段，则表明该样品中含有牛源猪瘟细胞苗和兔源猪瘟脾淋苗。
3.根据权利要求2所述的兔源猪瘟脾淋苗与牛源猪瘟细胞苗的鉴别方法，其特征在于，所述699bp片段序列如序列表中序列I所示。
4.根据权利要求2所述的兔源猪瘟脾淋苗与牛源猪瘟细胞苗的鉴别方法，其特征在于，所述345bp片段序列如序列表中序列2所示。
5.根据权利要求2所述的兔源猪瘟脾淋苗与牛源猪瘟细胞苗的鉴别方法，其特征在于，所述第一轮PCR反应和第二轮PCR反应的程序是95°C 5min ；95°C 30sec — 55°C30sec — 72°C lmin，30 个循环；之后 72°C 1min0
6.根据权利要求2所述的兔源猪瘟脾淋苗与牛源猪瘟细胞苗的鉴别方法，其特征在于，采用酚氯仿提取法提取待测猪瘟疫苗的DNA。
【文档编号】C12Q1/70GK104388596SQ201410754897
【公开日】2015年3月4日 申请日期:2014年12月11日 优先权日:2014年12月11日
【发明者】李晓成, 张志 , 吴发兴, 刘爽, 董雅琴, 邵卫星 申请人:中国动物卫生与流行病学中心