一种双酶法不对称制备(r)-2-氯-1-(3-氯苯基)乙醇的应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种共表达羰基还原酶和葡萄糖脱氢酶的大肠杆菌系统在不对称还原制备(R)-2-氯-1-(3-氯苯基)乙醇中的应用。以含有羰基还原酶(SyS1)基因和葡萄糖脱氢酶(SyGDH)基因的共表达重组菌E.coil BL21(pETDuet-Sygdh-Sys1)为催化剂，并添加一定量的NADP+和葡萄糖，在缓冲溶液/二甲亚砜两相反应体系中实现不对称还原3-氯苯酰甲基氯高效制备(R)-2-氯-1-(3-氯苯基)乙醇。其收率为98％，产物的对映体过量(e.e.)>99％。
【专利说明】—种双酶法不对称制备(R)-2-氯-1-(3-氯苯基)乙酉孚的应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种共表达了羰基还原酶(SySl)基因和葡萄糖脱氢酶(Sy⑶H)基因的重组菌E.coli BL2UpETDuet-Sygdh-SysI)在不对称制备(R) _2_氯-1-(3-氯苯基)乙醇中的应用，属于生物工程【技术领域】。
【背景技术】
[0002](R) -2-氯-1-(3-氯苯基)乙醇分子式为C8H8Cl2O,英文名(R) -2-chloro-l- (3-chlorophenyl) ethanol ((R) -CCE)，与(S) ~2~ 氣-1- (3-氣苯基)乙醇互为对映异构体，是一种重要的手性化合物，能合成多种β3-肾上腺素能受体(AR)激动齐[J，包括 SR-58611A、TAK-677、CL-316243 等。
[0003]该类化合物的制备方法有拆分法和合成法。拆分法包括化学拆分和生物拆分，但其缺点是最大收率不超过50% ;合成法包括化学合成法和生物合成法，其中化学合成法的收率在70?90%，对映体过量(e.e.)值50?80%，其所用催化剂价格昂贵，产物的光学纯度不高，后期金属离子的去除不理想，且药物中对于金属离子的严格要求都限制着化学合成。生物催化法具有高效性，高立体选择性，反应条件温和等优点，近年来受到广大研究者的青睐。利用羰基还原酶不对称还原3-氯苯甲酰甲基氯(m-CPC)，将潜手性的底物m-CPC转化成具有手性的(?-(!^，有产率高和^值大等优势。前期的研究结果表明E.coliBL2KpETDuet-Sygdh-SysI)有催化m_CPC生成(R)-CCE的功能，但没有详细的研究。本专利的工作是利用此单菌共表达双酶偶联的重组菌E.coli BL2KpETDuet-Sygdh-SysI)不对称还原m-(CPC)来制备(R)-CCE，并对其中的反应条件进行优化，已达到最佳效果。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是提供一种共表达了羰基还原酶(SySl)基因和葡萄糖脱氢酶(Sy⑶H)基因的重组菌E.coli BL2 l(pETDuet-Sygdh-Sys I)来不对称还原m_CPC制备(R)-CCE的方法。
[0005]本发明的技术方案:
[0006]利用共表达了羰基还原酶(SySl)基因和葡萄糖脱氢酶(Sy⑶H)基因的重组菌E.coliBL21 (pETDuet-Sygdh-Sysl)为生物催化剂，并添加一定量的NADP+和葡萄糖，在缓冲溶液/ 二甲亚砜两相反应体系中实现不对称还原m-CPC来制备(R)-CCE。
[0007]上述所用的羰基还原酶基因(Sysl)和葡萄糖脱氢酶基因(Sygdh)共表达的E.coli BL21 (pETDuet-Sygdh-Sysl)由江南大学分子生物学实验室保藏。E.coliBL2KpETDuet-Sygdh-SysI)重组菌能不对称的制备(R)-CCE，且能够以葡萄糖为辅助底物，使得NADPH再生循环，因而加入一定量NADP+就能实现反应中NADPH的高效循环利用。
[0008]利用上述重组大肠杆菌不对称制备(R)-CCE的方法如下:
[0009]以m-CPC为底物，二甲亚砜为助溶剂，以葡萄糖为辅助底物，以NADP+为辅因子，由E.coli BL2KpETDuet-Sygdh-SysI)的重组大肠杆菌进行转化反应不对称制备(R)-CCE，具体反应流程见图1。
[0010]所述的底物m-CPC的初始反应浓度为5?90mmol/L，葡萄糖初始反应浓度20?lOOmmol/L、辅因子NADP+的初始浓度为0.2mmol/L，重组大肠杆菌用量以湿细胞计为50?100mg/mL。反应温度为20?55°C，反应转速为20?200rpm，反应时间12h。
[0011]所述的反应体系为缓冲溶液/有机溶剂双相体系转化法。在含有pH 4.5?8.0的缓冲溶液/有机溶剂双相体系进行生物转化。
[0012]产物的检测方法:水/有机溶剂双向体系反应结束后，12000rpm,离心5min，取600 μ L上清，加入ImL乙酸乙酯，剧烈振荡5min放置分离有机层和水层。吸取上层乙酸乙酯相，加入适量无水硫酸镁除去残余水分，所得有机相过滤膜后气相检测。采用CP-Chirasil-DEX CB手性色谱柱(25mX 0.25nmX 0.25 μ m)，检测器FID。分析条件:进样口和检测器温度分别为220°C和250°C。柱温145°C维持2min，以5°C /min升温至200°C维持5min，载气为氮气，流量为3mL/min，分流比1:50，底物和产物的气相检测见图2。
[0013]本发明的有益效果:本发明提供了一种共表达羰基还原酶(SySl)基因和葡萄糖脱氢酶(Sy⑶H)基因的重组菌E.coli BL2UpETDuet-Sygdh-SysI)在不对称还原m_CPC来制备(R)-CCE的方法。在添加较低成本的辅因子NADP+的情况下，高效的催化m-CPC生成(R) -CCE，光学纯度e.e.>99 %，对底物转化率达98 %，降低了生产成本。
【专利附图】
【附图说明】
[0014]图1: (R) _2_氯-1-(3_氯苯基)乙醇制备流程图
[0015]图2:底物和产物的气相色谱图
【具体实施方式】
[0016]以下结合具体实施例，进一步阐述本发明的操作方法。但是这些实施例仅用于详细说明本发明，而不用于限制本发明的范围。
[0017]实施例1 重组菌 E.coli BL21 (pETDuet-Sygdh-Sysl)的发酵
[0018]接种重组菌E.coli BL21 (pETDuet-Sygdh-Sysl)于 2mL 含有 100 μ g/mL 氨节青霉素的LB液体培养基，于37°C、220r/min振荡培养12h。取300 μ L培养液转接于30mL含有100 μ g/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中于37°C、220r/min振荡培养至OD6tltl为0.6?0.8时，向培养物中加至终浓度为1.0mmoI/L的IPTG，于25°C，220r/min振荡培养10h，离心收集菌体备用。
[0019]实施例2制备(R) -CCE的应用
[0020]取实施例1的菌体用磷酸钾缓冲液(lOOmmol/L，pH 7.0)洗涤两次，固定称取50 ?10mg(湿重)的重组菌 E.coli BL21 (pETDuet-Sygdh-Sysl)菌体于 ImL 缓冲液(100mmol/L, pH 7.0)体系中，加入 20 ?lOOmmol/L 葡萄糖,5 ?90mmol/L 的 m-CPCQS1^DMS0)，0.2mmol/L NADP+, 20 ?55°C，20 ?200rpm 下反应 12h 后结束，12000rpm,离心 5min,取600 μ L上清，加入ImL乙酸乙酯，剧烈振荡5min放置分离有机层和水层。吸取上层乙酸乙酯相，加入适量无水硫酸镁除去残余水分，所得有机相过滤膜后气相检测。测其产物含量与对映体过量值，测定其产率为98%，光学纯e.e.>99%。m_CPC的出峰时间为8.19min，(R) -CCE, (S)-CCE出峰时间分别为10.97min和11.18min。产率=[产物(R)-CCE的量(mol)]/[底物 m-CPC 的量(mol)]X100%。
[0021]实施例3不同底物浓度对产物生成的影响
[0022]取实施例1的菌体用磷酸钾缓冲液(lOOmmol/L，pH 7.0)洗涤两次，固定称取50mg (湿重)的重组菌E.coli BL21 (pETDuet-Sygdh-Sysl)菌体于ImL磷酸钾缓冲液(10mmoI/L，pH 7.0)中，加入 100mmol/L 葡萄糖，5 ?90mmol/L 的 m_CPC (15 % DMS0)，0.2mmol/L NADP+，40°C，200rpm下反应12h后，结果分析表明最佳底物浓度为30mmol/L。
[0023]实施例4不同湿菌体量对产物生成的影响
[0024]取实施例1的菌体用磷酸钾缓冲液(lOOmmol/L，pH 7.0)洗涤两次，固定称取 50 ?10mg(湿重)的重组菌 E.coli BL21 (pETDuet-Sygdh-Sysl)菌体于 ImL 缓冲液(100mmol/L, pH 7.0)体系中，加入 40mmol/L 葡萄糖,30mmol/L 的 m_CPC(15 % DMS0),0.2mmol/L NADP+, 40°C, 200rpm下反应12h后，结果分析表明最佳菌体浓度为70mg/mL。
[0025]实施例5不同pH对产物生成的影响
[0026]取实施例1的菌体用磷酸钾缓冲液(lOOmmol/L，pH 4.5?8.0)洗涤两次，固定称取70mg(湿重)的重组菌E.coli BL21 (pETDuet-Sygdh-Sysl)菌体于ImL磷酸钾缓冲液(100mmol/L, pH 4.5 ?8.0)中，加入 40mmol/L 葡萄糖，30mmol/L 的 m_CPC (15% DMS0)，NADP+0.2mmol/L，40°C，200rpm下反应12h后，结果分析表明最佳pH为7.0。
[0027]实施例6不同温度对产物生成的影响
[0028]取实施例1的菌体用磷酸钾缓冲液(lOOmmol/L，pH 7.0)洗涤两次，固定称取70mg(湿重)的重组菌E.coli BL21 (pETDuet-Sygdh-Sysl)菌体于ImL磷酸钾缓冲(100mmol/L, pH 7.0)中，加入 40mmol/L 葡萄糖，30mmol/L 的 m-CPC (15 % DMS0),NADP+0.2mmol/L,20?55°C，200rpm下反应12h后，结果分析表明最佳温度为40°C。
【权利要求】
1.一种不对称转化制备(R)-2-氯-1-(3-氯苯基)乙醇的方法，其特征是以重组菌E.coil BL21 (pETDuet-Sygdh-Sysl)为催化剂，并添加一定量的NADP+和葡萄糖，在缓冲溶液/ 二甲亚砜两相反应体系中实现不对称还原3-氯苯甲酰甲基氯高效制备(R) _2_氯-1-(3-氯苯基)乙醇。
2.根据权利要求1所述的不对称转化制备的应用，其特征在于以3-氯苯甲酰甲基氯为底物，二甲亚砜为助溶剂，以葡萄糖为辅助底物，以NADP+为辅因子，由E.coilBL21 (pETDuet-Sygdh-Sysl)重组大肠杆菌进行转化反应不对称制备0?)-2-氯-1-(3-氯苯基)乙醇，所述的底物3-氯苯甲酰甲基氯的初始反应浓度为5?90mmol/L，葡萄糖初始反应浓度20?lOOmmol/L、辅因子NADP+的初始浓度为0.2mmol/L，重组大肠杆菌的用量以湿细胞计为50?100mg/ml，反应温度为20?55°C，反应转速为20?200rpm，反应时间12h ；所述的反应体系为缓冲溶液/有机溶剂双相体系转化法；在含有pH 4.5?8.0的缓冲溶液/有机溶剂双相体系进行生物转化。
【文档编号】C12P7/22GK104450801SQ201410759167
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2014年12月10日 优先权日:2014年12月10日
【发明者】邬敏辰, 朱利娟, 何瑶, 李剑芳, 余涛, 吴芹 申请人:江南大学