一种微生物生产光活性氯苯氯乙醇的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于制药工程技术领域，特别涉及到黄蓝状菌细胞生物催化制备手性医药 中间体（S)-2-氯-1- (4-氯-苯基）乙醇的技术。
【背景技术】
[0002] 手性（S)_2_氣-1- (4_氣-苯基）乙醇是合成手性药物、精细化学品、农药品和 其他特殊材料的重要中间体。生物催化不对称反应具有环境友好、条件温和、选择性高等优 点，作为绿色高效制备手性化合物的优先途径，被越来越多地应用于生产一些高附加值的 手性化合物。生物催化制备手性（S)-2-氯-1- (4-氯-苯基）乙醇具有很好的应用前景。
[0003] 生物催化具有催化效率高、选择性强、条件温和、环境友好等突出优点，是可持续 发展过程中替代和拓展传统有机化学合成的重要方法。其中手性拆分和不对称合成是生物 催化最具吸引力的应用领域。在作为生物催化剂的六大类酶中，水解酶能够催化动力学拆 分外消旋体得到手性产品，在工业生物催化中一直扮演着重要角色。近几年来，氧化还原 酶在工业上的应用得到了迅速增长。目前，采用水解酶动力学拆分法、生物还原法和生物 氧化法工业制备光学活性手性化合物的比例为4:2:1。
[0004] 生物还原法相对于动力学拆分法而言，最大的优势在于理论收率可达100%，原子 经济性好。然而生物还原反应需要辅酶或辅因子的参与，一定程度上限制了其应用。由于 辅酶依赖性的缘故，生物还原反应中多釆用整细胞作为催化剂，实现体内辅酶循环再生的 同时免去了酶的分离纯化步骤。
[0005] ⑶_2_氣_1-(4_氣-苯基)乙醇是合成手性药物、精细化学品、农药品的重要手 性砌块，。现有的方法普遍存在转化率低、反应时间长、需要添加昂贵辅酶、成本高等严重缺 陷，难于进行工业化生广。本发明将米用生物细胞催化制备（S) _2_氯-1- (4-氯-苯基） 乙醇。
【发明内容】
[0006] 本发明米用黄蓝状菌细胞催化制备（S) _2_氣-1- (4_氣-苯基）乙醇，反应式如 下：
2,4'_二氯苯乙酮（1)经黄蓝状菌催化反应，得到产物（S)-2-氯-1- (4-氯-苯基） 乙醇（2)。有多种微生物可以催化此反应，经过大量实验筛选，最终确定采用黄蓝状菌作为 催化剂，因为其催化反应的效果最好，反应收率、对映体过量率（ee%)均很高。
[0007] 许多黄蓝状菌都可以进行生物催化此反应，然而，其效果不同，相差很大，经实验， 本发明选用黄蓝状菌菌株为ATCC34594，其催化反应效果最佳。
[0008] 由于绝大多数氧化还原酶是辅酶NAD(P)H依赖型，而细胞本身所含有的辅酶量 可能较少，因此，进行氧化还原反应时，为促进辅酶再生，提高反应效率，在反应体系中 还添加辅助底物构成转化体系。常用的辅助底物种类较多，不同细胞所需的辅助底物不同， 效果差别很大，采用几种辅助底物组合，可以取得较好效果，需进行大量实验才能确定最佳 的辅助底物。本发明经过大量实验确定的辅助底物为：木糖15_17g/L、麦芽糖12_15g/L、异 丙醇5-6%V/V(体积浓度）。
[0009] 由于底物溶解度较低，所以，加入表面活性剂以增加底物的溶解度。
[0010] 培养介质： 1、种子培养基成份为：玉米浆（以干物质计）含量为35-45g/L，酵母提取物10g/L，葡萄糖20g/L，硫酸铵0. 5-0. 7g/L，硫酸镁0. 3-0. 4g/L，磷酸二氧钾1. 8-2. 3g/L;配制 固体培养基时添加15g/L的琼脂粉。
[0011] 2、培养液成份：玉米浆（以干物质计）含量为35-45g/L，黄豆粉3-4g/L，酵母浸 膏 8-10g/L，葡萄糖 18-22g/L，麦芽浸膏 20-25g，硫酸铵 0.5-0. 7g/L，硫酸镁 0.3-0. 4g/ L，磷酸二氧钾1.8-2. 3g/L，碳酸钙0.7g/L，硫酸亚铁0.18g/L，硫酸锰0.025g/L;pH 4. 4〇
[0012] 2、固体培养基成份：在液体培养基中加入2%的琼脂粉。
[0013] 黄蓝状菌细胞制备。黄蓝状菌经斜面、摇瓶、种子罐培养得到种子液；发酵罐加入 培养液，121°c高压灭菌30分钟，冷却至26-27°C，将黄蓝状菌种子液接种至发酵罐，接种 比例为9-10%，通气比为0.9-1￥八￥分钟），26-27°(：培养41-45小时，用过滤式离心机离心 得到湿黄蓝状菌细胞，用作生物催化反应催化剂。
[0014] 生物催化转化。底部通气搅拌反应罐中加入磷酸盐缓冲液，pH为5. 4,加入底 物2, 4'-二氯苯乙酮，使底物浓度为80-90g/L。其他成份：玉米浆（以干物质计）含 量为19-20g/L，山梨坦单月桂酸酯13-14g/L，木糖15-17g/L、麦芽糖12-15g/L、异丙醇 5-6%V/V(体积浓度），121°C高压灭菌30分钟；冷却至27-28°C时，加入湿黄蓝状菌细胞 使其浓度为71-75g/L，通气比为0. 15-0. 16V/ (V分钟），进行生物催化反应，反应时间 为67-70小时；反应结束后，滤出细胞，用乙酸乙酯萃取反应液，蒸出乙酸乙酯，得到产物 (S)-2-氯-1- (4-氯-苯基）乙醇，反应转化率98-99%，产品收率96-97%，对映体过量 率 98. 5-99%。
[0015] 本发明所开展工作包括菌株选择、催化反应条件优化(反应温度、通气量、pH)、反 应介质选择和浓度优化，包括底物浓度、辅助底物组合、表面活性剂种类及浓度等。
[0016] 实施例1 种子培养基成份为：玉米浆（以干物质计）含量为35-45g/L，酵母提取物10g/L，葡 萄糖20g/L，硫酸铵0. 5-0. 7g/L，硫酸镁0. 3-0. 4g/L，磷酸二氧钾1. 8-2. 3g/L;配制固体 培养基时添加15g/L的琼脂粉。
[0017] 培养液成份为：玉米浆（以干物质计）含量为35-45g/L，黄豆粉3-4 g/L，酵母浸 膏 8-10 g/L，葡萄糖 18-22 g/L，麦芽浸膏 20-25 g，硫酸铵 0.5-0. 7g/L，硫酸镁 0.3-0. 4g/ L，磷酸二氧钾1.8-2. 3g/L，碳酸钙0.7 g/L，硫酸亚铁0.18 g/L，硫酸锰0.025 g/L;pH 4. 4〇
[0018] 湿黄蓝状菌细胞制备过程如下：黄蓝状菌ATCC34594经斜面、摇瓶培养，得到种 子液。1L发酵罐加入培养液；发酵罐加入培养液，121°C高压灭菌30分钟，冷却至26-27°C， 将黄蓝状菌种子液接种至发酵罐，接种比例为接种比例为9-10%，通气比为0. 9-1V/ (V分 钟)，26-27°C培养41-45小时，用过滤式离心机离心得到湿黄蓝状菌细胞，用作生物催化反 应催化剂。
[0019] 生物催化转化：0. 5L底部通气搅拌反应器中加入磷酸盐缓冲液，pH为5. 4,加入 底物2, 4' -二氯苯乙酮，使其浓度为80g/L，玉米浆（以干物质计）含量为20g/L，山梨坦 单月桂酸酯13g/L，木糖15g/L、麦芽糖15g/L、异丙醇5%V/V(体积浓度），121°C高压灭菌30 分钟；冷却至27°C时，加入湿黄蓝状菌细胞使其浓度为71g/L，通气比为0. 15V/ (V分钟)， 进行生物催化反应，反应时间为70小时；反应结束后，滤出细胞，用乙酸乙酯萃取反应液， 蒸出乙酸乙酯，得到产物（S)-2-氯-1- (4-氯-苯基）乙醇，反应转化率99%，产品收率 97 %，对映体过量率98. 5 %。
[0020] 实施例2 种子培养基成份为：玉米浆（以干物质计）含量为35-45g/L，酵母提取物10g/L，葡 萄糖20g/L，硫酸铵0. 5-0. 7g/L，硫酸镁0. 3-0. 4g/L，磷酸二氧钾1. 8-2. 3g/L;配制固体 培养基时添加15g/L的琼脂粉。
[0021] 培养液成份为：玉米浆（以