一种提高宇佐美曲霉甘露聚糖酶(AuMan5A)催化活性的方法
【专利摘要】本发明提出了一种提高β-甘露聚糖酶催化活性方法，结合基因工程技术构建一种催化效率高的宇佐美曲霉甘露聚糖酶(AuMan5A)突变酶，其核苷酸序列为SEQ ID NO:1，氨基酸序列为SEQ ID NO:2，相应的基因命名为Auman5ALoop。本发明还公开了突变酶工程菌的构建、高效表达和纯化的方法，制备的突变酶具有底物亲和力强、催化效率高的特性，具有较大的工业化应用潜力和经济价值。
【专利说明】一种提高宇佐美曲霉甘露聚糖酶（AUMan5A)催化活性的方 法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及宇佐美曲霉甘露聚糖酶（AuMan5A)的酶活性定向改造，甘露聚糖酶突 变酶基因的构建和表达，以及该酶的性质研究，属于生物工程【技术领域】。
【背景技术】
[0002] 0 -1，4-D-甘露聚糖酶（0 -1，4-D-mannan mannohydrolase ;EC 3. 2. 1. 78)，简称 3 -甘露聚糖酶（3 -mannanase)，是指一类能够水解含有3 -1，4-D-甘露糖苷键的甘露聚 糖和异甘露聚糖的内切水解酶，它在动植物和微生物中均广泛存在。由于甘露聚糖酶 具有降解生物质和生产功能性低聚糖的作用，使得其在食品、饲料、医药、制浆造纸、石油开 采等多种行业都具有广泛的应用前景，受到很多研究者的青睐。
[0003] 目前研究报道的甘露聚糖酶多数来源于细菌真菌等微生物，根据序列同源 性和空间结构分析，甘露聚糖酶都属于糖苷水解酶第5、26和113家族。目前，关于 第5家族0 -甘露聚糖酶的报道较多，它们的最适pH值为3. 0?7. 5,最适温度在45? 92°C。根据三维结构，所有的甘露聚糖酶都属于糖苷水解酶超家族A(clan A)，它 们的催化域采用相同的折叠方式，是由八个0折叠和八个a螺旋交替排列组成的（3/ a)8_TIM(triosephosphate isomerase)桶状结构。由于甘露聚糖酶具有复杂对称的 三维结构，使得对其结构与功能的研究一直处于滞后状态。
[0004] 虽然甘露聚糖酶具有广阔的应用前景，但目前已商品化的甘露聚糖酶，尤 其是国内公司开发出的一些产品，在酶学性质和生产水平等方面尚存在一定的缺陷，例如 较低的底物亲和力和比酶活，以及较差的对极端环境的耐受性等，这些都限制了它们在工 业生产中广泛和有效的应用。如何筛选和改造出底物亲和力强、比酶活高、极端环境耐受性 好的优良酶并有效地应用于工业生产中，已成为现在0-甘露聚糖酶的应用面临的最大挑 战。
[0005] 目前，虽已有一些有关0 -甘露聚糖酶基因的克隆和表达的文献和专利报道，但 有关甘露聚糖酶的分子改造，尤其是基于理性设计的甘露聚糖酶的分子改造更是 鲜有报道。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是提供一种提高0 -甘露聚糖酶催化活性方法，使得宇佐美曲霉甘 露聚糖酶（AuMan5A)的酶活性有了很大的提高，有较大的工业化生产和应用潜力以及经济 价值。
[0007] 本发明的技术方案：将位于宇佐美曲霉甘露聚糖酶（GeneBank accession No. ADZ99027)分子中的反应沟槽内的一段非保守性Loop结构（第316至322位，共 7个氨基酸KSTOGGN)替换为与之对应的哈茨木霉甘露聚糖酶（GeneBank accession No. AGH62580)分子中的Loop (第343至350位，共8个氨基酸氨基酸AQSNSDPY)，突变酶的 氨基酸序列为SEQ ID N0:2,相应的核苷酸序列为SEQ ID N0:1，并命名为Auman5AL°°p。
[0008] 携带有宇佐美曲霉P -甘露聚糖酶基因的重组质粒pUCm-T_Auman5A由江南大学 构建和保藏（专利申请号：201010550927. 4)。
[0009] 所述的突变酶的活性测定方法：
[0010] 于两个25mL的具塞试管A和B中，分别加入用pH 3. 6、柠檬酸-磷酸二氢钠缓冲 液配制的质量浓度为0. 5%的角豆胶溶液2. 4mL，于50°C恒温水浴中预热lOmin后，在A管 中加入用缓冲液适当稀释的〇. lmL酶液，于65°C中准确反应lOmin ;立即在A和B两管中各 加入2. 4mL 3, 5-二硝基水杨酸（DNS)试剂，在B管中再补加0. lmL灭活的酶液，A和B管 同时煮沸7min ;立即冷却后各加去离子水5mL，摇匀；以B管为空白对照，于540nm处测定A 管吸光度值，并从甘露糖标准曲线上查出相应的还原糖（以甘露糖计）含量并折算成酶活 性单位。酶活性单位定义：在本测定条件下，以每分钟产生1 U mol还原糖所需的酶量定义 为1个0 -甘露聚糖酶活性单位（U)。
[0011] 所述的突变酶基因的设计、克隆及表达：
[0012] (1)突变酶基因及其表达质粒的构建：基于上述设计的突变酶对应的基因序列， 设计三条引物：
【权利要求】
1. 一种催化活性提高的宇佐美曲霉甘露聚糖酶突变体AuMan5A^p，其核苷酸和氨基酸 序列分别为 SEQ ID N0:1 和 SEQ ID N0:2。
2. 甘露聚糖酶酶突变体的构建和表达方法： (1) 突变酶的设计：将位于宇佐美曲霉甘露聚糖酶（GeneBank accession No. ADZ99027)分子中的反应沟槽内的一段非保守性Loop结构（第316至322位，共 7个氨基酸KSTOGGN)替换为与之对应的哈茨木霉甘露聚糖酶（GeneBank accession No. AGH62580)分子中的Loop (第343至350位，共8个氨基酸氨基酸AQSNSDPY); (2) 突变酶基因及其表达质粒的构建：基于上述设计的突变酶对应的基因序列，设计 三条引物： Auman5A-F:5' -GAATTCTCCTTCGCCAGCACCTC-3'，含 EcoR I 酶切位点， Auman5A-R: 5 ' -GCGGCCGCTTAGGCACTATCAATAG-3，，含 Not I 酶切位点， Thman5A-Loop:5，-TTGAGTACCGGGGCTCAATCCAACTCCGACCCATACACTATCTACTATGG-3，，含 突变位点， 采用大引物PCR的方法构建突变酶基因，分别以Thman5A-L〇〇p和Auman5A-R为上下 游引物，以pUCm-T-Auman5A为模板进行第一轮PCR ;以第一轮PCR产物和Auman5A-F为引 物，以pUCm-T-Auman5A为模板进行第二轮PCR，PCR产物采用1 %琼脂糖凝胶电泳分析， 割胶回收目的条带并与pUCm-T连接（pUCm-T-Auman5Al°°p)转化JM109,经菌液PCR鉴定 正确后送上海生工测序；测序正确的pUCm-T-Auman5AL°°p与pPIC9Za质粒均用EcoR I 和Not I进行双酶切，回收的酶切产物在T4DNA连接酶的作用下进行连接，得到重组质粒 pPICZ a -Auman5At°°p，并对重组表达质粒进行序列测定； (3) GS115/Auman5Al°°p的构建、表达、产物纯化及酶学性质测定：用Sac I对 pPICZ a -AumanSA^15进行线性化，按照毕赤酵母表达手册进行电转化、筛选，得到高拷贝的 毕赤酵母重组子GS115/Auman5Al°°p ;该基因工程菌用1. 0%甲醇诱导表达96h，采用DNS法 测得发酵上清液中甘露聚糖酶活性可达350U/mL，是原酶发酵上清液酶活性的7倍；发酵液 经离心后的上清液为突变酶的粗酶液，该粗酶液经70%硫酸铵盐析，再经S印hadex G-75 凝胶过滤层析和DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换层析纯化，纯化后经SDS-PAGE检测 为单一条带；该突变酶的最适作用温度70°C，最适作用pH 4. 0,在最适反应条件下的比酶 活高达1870U/mg。
【文档编号】C12N15/81GK104450652SQ201410759253
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2014年12月10日 优先权日:2014年12月10日
【发明者】李剑芳, 董运海, 王春娟, 邬敏辰, 唐诗涵, 赵梅 申请人:江南大学