一种基于dna条形码的四种飞虱科害虫鉴别方法
【专利摘要】本发明公开了一种基于DNA条形码的四种飞虱科害虫鉴别方法。首先提取待鉴别的褐飞虱，灰飞虱，白背飞虱和长绿飞虱基因组总DNA，以此为PCR模板，设计特异引物扩增线粒体 COI 前部区段作为标记，进行物种鉴别的序列特征比对。本发明具有快速、高效和便捷的特点，对鉴定人员的专业知识要求不高；且能对褐飞虱，灰飞虱，白背飞虱和长绿飞虱幼虫及残缺个体进行准确鉴定，比传统的依赖成虫的形态特征鉴别更准确可靠。
【专利说明】一种基于DNA条形码的四种飞虱科害虫鉴别方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物【技术领域】，具体涉及一种基于DNA条形码的四种飞虱科害虫鉴别 方法，可快速鉴别褐飞虱、灰飞虱、白背飞虱及长绿飞虱四种飞虱科害虫。
【背景技术】
[0002] 褐飞虱（Nilaparvata Iugens)、灰飞虱（Laodelphax striatelIus)、白背飞 虱（Sogatella furcifera)及长绿飞虱（Saccharosydne procerus)同属昆虫纲同翅目 (Homoptera)飞虱科（Delphacidae)害虫，以刺吸植株汁液和传播病毒等方式危害水稻、菱 白等重要经济作物。尽管四种飞虱都喜在水稻上取食、繁殖，但它们的寄主范围和致害性并 大不完全相同。如褐飞虱的食性单一，多被认为是水稻专食性害虫；白背飞虱和灰飞虱的危 害对象较褐飞虱多，能为害水稻、麦类、茭白、甘蔗等等禾本科植物，长绿飞虱则主要危害茭 白，对水稻的危害程度较前三种飞虱害虫较小。因此，针对它们的防治策略也不完全相同。
[0003] 快速而准确的物种鉴定是合理防治害虫的必要前提和基础。然而，基于形态特征 进行物种鉴定的传统方法不仅费时费力，而且对鉴定人员的专业知识要求较高，鉴定过程 常受主观因素的干扰，极易混淆出错。上述四种重要害虫同属飞虱科，其虫体型较小，形态 相似，特别是早期阶段（卵、幼虫、蛹）形态更为相似，传统的鉴定方法更难以鉴别。因此， 有必要建立一种经济、快速和准确的鉴别这四种害虫的方法，从而能采取及时的防治措施 和制定有效的防治策略来降低其给农业生产带来的危害。
[0004] DNA条形码是以便捷、低廉的DNA提取，扩增和测序技术为前提的一项新兴生物分 类技术，它是通过一个标准化的短基因片段（即"DNA条形码"）的序列变异来鉴定物种。以 线粒体细胞色素 C氧化酶亚基I(COI)基因的一部分（658bp)作为标准条形码序列，已经广 泛应用于动物的物种分类鉴定。在昆虫鉴定方面，DNA条形码技术可以不受虫体性别和发 育阶段的限制，通过卵，幼虫或残缺虫体就可以完成鉴定工作，可以大大缩短物种鉴定的时 间。因此DNA条形码技术在农林昆虫等节肢动物快速鉴定方面显示了良好的应用前景，但 目前针对我国尚无利用DNA条形码作为分子标记区别鉴定褐飞虱、灰飞虱、白背飞虱及长 绿飞虱的报道。本发明提供的基于DNA条形码技术的鉴定方法有利于实现飞虱科害虫的快 速鉴定及其危害的控制。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于，针对褐飞虱、灰飞虱、白背飞虱及长绿飞虱形态鉴定不准确， 科学鉴别手段缺乏的不足，提供一种基于DNA条形码的四种飞虱科害虫鉴别方法。
[0006] 本发明依次通过以下步骤实现：
[0007] (1)采用DNA抽提试剂盒提取褐飞虱、灰飞虱、白背飞虱及长绿飞虱的总基因组 DNA。为避免污染，舍去腹部，只从头胸部和腿部提取DNA。
[0008] (2)利用 COI 的通用引物 COI-F (5' -TCAACAAATCATAAAGATATTGG-3 ')和 COI-R C -TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATC-3')进行 PCR 扩增和测序。PCR 反应体系为 50 μ 1，其 中：2μ1 模板 DNA(约 20ng)，5yl 10XPCRbuffer，4yl 2.5mMMgCl2，lyl lOmMdNTPs， 各I μ I IOmM正、反向引物，0.5μ I 5U/μ I TaqDNA聚合酶，加去离子水调至终体积50μ I; PCR反应条件为：95 °C预变性3分钟，94°C变性30秒，50 °C退火30秒，72 °C延伸50秒；35个 循环后，72 °C再延伸7分钟。
[0009] (3)依据褐飞虱、灰飞虱、白背飞虱及长绿飞虱的核苷酸的序列特征变异位点进
[0010] 行物种鉴别，位点的序号以本片段核苷酸位置为基准。（如表1)
[0011] 表1:褐飞虱、灰飞虱、白背飞虱和长绿飞虱COI序列特异变异位点。
[0012]
【权利要求】
1. 一种基于DNA条形码的四种飞虱科害虫鉴别方法，其特征在于该方法按下述步骤进 行：（I) DNA抽提试剂盒法提取待鉴别飞虱科害虫总DNA ; (2)利用通用引物PCR扩增线粒体 COI前部序列；（3) 1. 5%琼脂糖凝胶电泳，试剂盒法割胶回收COI扩增片段，测序；（4)依据 害虫的部分COI序列特征变异位点进行物种快速鉴别。
2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（1)中为避免害虫共生菌的污 染，舍去腹部，只从其头、胸及腿部提取DNA。
3. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤⑵的PCR反应体系为50 y 1，其 中：2yl 模板 DNA，5yl 10 XPCR buffer，4yl 2.5mM MgCl2, Iyl IOmM dNTPs，Iyl IOmM 正、反向引物各，〇. 5yl 5U/yl的TaqDNA聚合酶，加去离子水调至终体积50y I ;PCR反应 条件如下：95°C预变性3分钟，94°C变性30秒，50°C退火30秒，72°C延伸50秒；35个循环 后，72°C再延伸7分钟，电泳后纯化并测序。
4. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤⑵中PCR所用的引物为：正向 引物COI-F如SEQ ID NO: 1所示；反向引物COI-R如SEQ ID NO: 2所示； SEQ ID N0:1 :5' -TCAACAAATCATAAAGATATTGG-3' SEQIDN0:2:5' -TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATC-3'。
5. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（3)中凝胶电泳采用1. 5%琼脂 糖凝胶电泳。
6. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（4)按下表1所示的核苷酸序列 特征变异位点进行物种鉴别； 表1 :褐飞虱、灰飞虱、白背飞虱和长绿飞虱COI序列特异变异位点
【文档编号】C12Q1/68GK104498603SQ201410759288
【公开日】2015年4月8日 申请日期:2014年12月11日 优先权日:2014年12月11日
【发明者】俞晓平, 王正亮, 李超 申请人:中国计量学院