Hrm技术检测氯吡格雷用药相关基因多态性的方法
【专利摘要】本发明公开了一种HRM技术检测氯吡格雷用药相关基因多态性的方法，其特征在于所述方法包括以下步骤：采用硅胶吸附法抽提被测者口腔上皮细胞/外周血细胞样本的基因组DNA，设计包含目标位点的检测引物，根据HRM技术对PCR扩增后的基因序列进行位点分型。本发明灵敏度高、特异性好，检测速度快，可用于评估患者使用氯吡格雷治疗的有效性，从而达到合理有效地个体化用药。
【专利说明】HRM技术检测氯吡格雷用药相关基因多态性的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及氯吡格雷用药相关基因多态性的检测方法，属于分子生物学【技术领域】。
【背景技术】
[0002]联合应用氯卩比格雷和阿司匹林是急性冠脉综合征(Acutecoronary syndrome,ACS )或经皮冠状动脉介入术(Percutaneous coronary intervent 1n，PCI)后的常规治疗方案。但氯吡格雷疗效在不同个体间存在巨大差异，即使给予标准剂量治疗，仍有部分患者出现氯卩比格雷无反应或是低反应，称之为氯卩比格雷抵抗(clopidogrel resistance，CR)，从而造成不良心血管事件的发生。虽然目前尚不能完全阐明氯吡格雷抵抗的机制，但越来越多的研宄表明，遗传因素可能是氯吡格雷抵抗的首要因素。
[0003]氯吡格雷是一种血小板二磷酸腺苷-受体拮抗剂，为不具有活性的前体药，在体内需要经过肠内的吸收和肝脏的代谢才能发挥其抗血小板作用。氯吡格雷在小肠内的吸收受到ABCBl基因编码的肠道外排泵P糖蛋白的调控；在肝脏主要依赖于CYP2C19代谢转化为活性硫醇类衍生物才具有抗血小板活性。
[0004]ABCBl转运蛋白家族是一类跨膜蛋白，其主要功能是利用ATP水解产生的能量将与其结合的底物等主动转出质膜，ABCBl基因在人类多药耐药基因族中起主导作用，其表达受各种因素的影响，属于可调控基因。ABCBl定位于7q21.1，其cDNA全长4669bp，由28个外显子组成，可转录得到4.5kb的mRNA，编码一个170kDa的跨膜糖蛋白-P糖蛋白。实验研宄P糖蛋白对氯吡格雷吸收的影响时发现，含有两个ABCBl C3435T等位基因变异体可降低氯吡格雷的血药浓度，并首次报道了的基因多态性与氯吡格雷药代动力学之间的关系。在法国入选的2208例急性心肌梗死患者，给予氯吡格雷治疗并随访I年，评估氯吡格雷吸收代谢过程中的基因多态性与心血管事件(非致死性卒中、心肌梗死或死亡)风险的关系，结果发现ABCBl C3435T影响到氯吡格雷在肠道的吸收，突变型(TT型)肠道吸收减少，生物利用度降低，心血管事件发生率显著高于野生型(CC型)；同时携带ABCBl变异等位基因和CYP2C19功能缺失等位基因与携带ABCBl和CYP2C19野生型等位基因相比，其心血管事件发生风险比达到5.31。另一项研宄纳入TRIT0N-HMI38实验中的2932例拟行PCI的急性冠脉综合征患者，随机分组给予氯吡格雷或普拉格雷治疗，随访15个月评估ABCBl C3435T与主要终点事件(心血管死亡、心肌梗死及卒中)的关系，结果显示在氯吡格雷治疗组中，ABCBl C3435T基因型与主要终点事件风险呈显著相关(p=0.0064 )。与ABCBl CT/CC基因型携带者相比，TT纯合子携带者主要终点事件风险增加72%;在健康人群中，TT纯合子携带者在服用氯吡格雷后血小板最大聚集率出现绝对下降，但降幅较CT/CC携带者减少了7.3%。ABCBl TT基因型携带者降低了对血小板的抑制，且在氯吡格雷治疗期间复发性缺血事件的风险有所增加。
[0005]氯吡格雷在肝脏的代谢须经两次氧化的过程，分别有44.9%和20.6%的作用受CYP2C19基因编码的蛋白质介导。CYP2C19等位基因功能缺失突变体通过抑制氯吡格雷的代谢，导致血小板高残余的反应性。中国汉族人群中CYP2C19基因常见的两个功能缺失等位基因是CYP2C19*2和CYP2C19*3，即G681A和G636，突变率分别为30%和8%左右，这两个等位基因突变均导致不能翻译出完整活性酶。一项大型Meta分析研宄了 11959例患者，发现携带CYP2C19*2功能缺失等位基因比野生型携带者主要心血管不良事件高30%，CYP2C19*2单独也可引起死亡率增加和支架内血栓，这种风险在纯合子和杂合子携带者中均增加。在接受氯吡格雷治疗的2208例急性心肌梗死患者中，携带任意2个CYP2C19功能缺失等位基因者(*2、*3、*4、*5) I年内心血管事件发生率显著高于非携带者；在住院期间接受PCI治疗的1535例患者中，携带2个CYP2C19功能缺失等位基因的患者发生心血管事件风险是非携带者的3.58倍。大样本的对照研宄显示，携带CYP2C19功能缺失等位基因的病人，氯吡格雷活性代谢产物的血药浓度更低，发生不良心血管事件的风险更高。2010年8月，美国心脏病学会基金会和美国心脏学会共同发布了美国FDA关于氯吡格雷的黑框警告，针对医师和病人，建议通过基因检测明确病人氯吡格雷的代谢变化，预测病人不良反应的风险。
[0006]目前普遍应用的基因分型检测方法为Taqman探针法和DNA直接测序法。Taqman荧光探针两端分别标记报告基团和淬灭基团，探针在未与目标序列结合保持完整时，荧光报告基团和淬灭基团没有分离，荧光信号被淬灭基团吸收，不能受激发出荧光；PCR扩增时，完全互补配对后由Taq酶所具有的5 ’ -3 ’外切酶活性将探针酶切降解，荧光报告基团和淬灭基团分离，荧光检测系统可以接到荧光信号，实现荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。如果探针与目标序列存在错配碱基，就会大大减少探针与目标序列结合的紧密度及Taq酶5’端外切酶的活性，影响探针的荧光释放量，使带有不同碱基的DNA序列得以鉴定。这种方法步骤少，不易污染，便于对大样本进行分型；但对引物设计有一定的限制，对于SNP附近的序列有一定要求，受突变碱基位点与类型局限。DNA直接测序法能直接提供准确的碱基信息，被当成突变检测的金标准，但存在费时费力，成本较昂贵，不适用于对大量样本进彳丁检测等缺点。
[0007]本发明应用一种全新的突变扫描和基因分型的遗传分析方法——高分辨熔解曲线(High resolut1n melting，HRM)分析技术。通过实时监测升温过程中双链DNA荧光染料与PCR产物的结合情况，SNP位点碱基不同会使双链DNA的TM值发生变化从而双链DNA在升温过程中先后解开，形成不同的熔解曲线形状，荧光染料从局部解链的DNA分子上释放，从荧光强度与时间曲线上就可以判断是否存在SNP，而且不同SNP位点、杂合子与纯合子等都会影响熔解曲线的峰形，能够有效区分不同SNP位点与不同基因型。HRM不受突变碱基位点与类型局限，无需序列特异性探针，采用新型饱和染料更易于检测单碱基突变、小片段插入或缺失。该方法与其他遗传分型技术相比，操作简单，具有灵敏度高、特异性好、成本低、快速、高通量检测等优点，结果准确，且实现了真正的闭管操作。
【发明内容】
[0008]本发明的目的是提供一种简单易行的氯吡格雷用药相关基因多态性的检测方法。
[0009]为了达到上述目的，本发明提供一种利用HRM技术检测氯吡格雷用药相关基因(CYP2C19、ABCBl)多态性的方法，其特征在于，具体步骤为:
第一步:采用硅胶吸附法抽提被测者口腔上皮细胞/外周血细胞样本的基因组DNA，采用电泳凝胶成像法对DNA的浓度和纯度作检测，待测样本浓度标化到lOng/ul。
[0010]第二步:采用在线软件Primer 3设计HRM引物，确定最佳引物为18_25bp大小，PCR产物长度80-150bp。相关引物信息如下:
CYP2C19 G681A 引物序列:
G681A-F:TGCAATTTTCCCACTATCATTG
G68IA-R:TTGGTGTTCTTTTACTTTCTCCAA
CYP2C19 G636A 引物序列:
G636A -F:CGTTTCGATTATAAAGATCAGCA
G636A -R:AAAGACTGTAAGTGGTTTCTCAGGA
ABCBl C3435T引物序列:
C3435T-F:CCTGTTTGACTGCAGCATTG
C3435T-R:GCTCCCAGGCTGTTTATTTG
第三步:在每一个PCR反应孔中依次加入Type-1t HRM PCR Mix 7.5ul，正、反向引物溶液各0.5ul(10umol/L)，检测样品2ul，用灭菌重蒸馏水补足15ul ;在Rotor-Gene Q上进行反应，PCR反应条件为92-97 °C变性5-15分钟，92-97 °C变性10-30秒，57-65 °C退火10-30秒，70-75°C延伸10-30秒，30-50个循环；HRM反应条件:92_97°C变性I分钟，40°C复性I分钟，初始熔解温度60-65°C开始程序升温熔解至95°C，过程中实时监测荧光信号，30-50次每秒。
[0011]第四步:应用Rotor-Gene Q软件分析HRM结果，通过标准曲线基于曲线偏移(纯合子)和曲线形状变化(杂合子)展现不同的基因型。定义已知样本基因型后，软件会自动调出所有检测样本的基因型。
[0012]本发明对CYP2C19、ABCBl的三个位点的基因型进行检测，评估患者使用氯吡格雷治疗的有效性，从而达到合理有效地个体化用药。
[0013]本发明基于HRM分析技术，无需序列特异性探针，采用新型饱和染料，操作简单，不仅具有灵敏度高、特异性好、成本低、检测速度快、高通量等优点，而且分辨率高，全部反应在封闭的反应管中完成，有效避免了交叉污染。
[0014]
【专利附图】
【附图说明】
[0015]图1为本发明实施例大样本的HRM标准曲线图；
图2为本发明实施例大样本的HRM差异曲线图。
【具体实施方式】
[0016]以下结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
实施例
[0017]1、采用硅胶吸附法抽提被测者口腔上皮细胞基因组DNA，电泳凝胶成像法对DNA的浓度和纯度作检测，待测样本浓度标化到10ng/ul ；
阴性对照DNA符合以下条件时视为合格:0D值A260/A280在1.8-2.0之间；电泳条带清晰；测序鉴定CYP2C19 G636A位点基因型为GG ；
阳性对照DNA符合以下条件时视为合格:0D值A260/A280在1.8-2.0之间；电泳条带清晰；测序鉴定CYP2C19 G636A位点基因型为AG。
[0018]2、采用在线软件Primer 3设计引物，确定最佳引物为18_24bp大小，PCR产物长度70-150bp，目标位点周边位置避免其他SNP位点(由生工生物工程(上海)股份有限公司合成)。用无菌水配制浓度为lOumol/L的CYP2C19 G636A正向引物溶液以及浓度为lOumol/L的CYP2C19 G636A反向引物溶液；正向引物的序列为:5 '-CGTTTCGATTATAAAGATCAGCA-3 '，反向引物的序列为:5' - AAAGACTGTAAGTGGTTTCTCAGGA_31 ο
[0019]3、在每一个PCR反应孔中依次加入Type-1t HRM PCR Mix 7.5ul (QIAGEN公司生产，包括2 X HRM PCR Master ]\^1、10\?0?缓冲液、0-801111:;[0114￥36代611 Dye、HotStarTaqDNA聚合酶)和步骤2所得的CYP2C19 G636A基因正向引物溶液0.5ul、反向引物溶液0.5ul，然后在不同的PCR反应孔中分别加入步骤I得到的检测样品、阴性对照品及阳性对照品各2ul，用灭菌重蒸馏水补足15ul ;在1?於01-66116 Q上进行反应，PCR反应条件为95°C变性10分钟，95 °C变性10秒，57 °C退火10秒，72 °C延伸10秒，40个循环；HRM反应条件:95°C变性I分钟，40°C复性I分钟，初始熔解温度65°C开始程序升温熔解至95°C，过程中实时监测荧光信号，40次每秒。
[0020]4、应用Rotor-Gene Q软件分析HRM结果，如图1、图2所示，在10例口腔粘膜上皮细胞提取的DNA检测中，有I例CYP2C19 G636A位点基因型为AG，9例基因型为GG。
【权利要求】
1.一种！！應分析技术检测氯吡格雷用药相关基因多态性的方法，其特征在于，具体步骤为: 第一步:采用硅胶吸附法抽提被测者口腔上皮细胞/外周血细胞样本的基因组0嫩，电泳凝胶成像法对0嫩的浓度和纯度作检测，待测样本浓度标化到10叩/化； 第二步:采用在线软件？3设计皿1引物，确定最佳引物为18-25?)大小，？⑶产物长度80-150?)，相关引物信息如下: 01？2019 6681八引物序列:
668
6681^-1？: 01？2019 6636六引物序列:
6636^ -?: 6636^ -1？:^6^0161^6166111010^66^ ^8081 ?:3435！'引物序列:
034351-？:00161116^0160^60^116
034351-1？:601000^66016111^1116 第三步:在每一个？⑶反应孔中依次加入!'沖6-“只咖7.5111，正、反向引物溶液各0.5111( 101111101/1),检测样品21x1，用灭菌重蒸馏水补足151x1 ^在如如广化加0上进行反应，？⑶反应条件为92-971:变性5-15分钟，92-971:变性10-30秒，57-651:退火10-30秒，70-751:延伸10-30秒，30-50个循环；皿1反应条件:92-971变性1分钟，401:复性1分钟，初始熔解温度60-651:开始程序升温熔解至951，过程中实时监测荧光信号，30-50次每秒； 第四步:应用0软件分析!I咖结果，通过标准曲线基于曲线偏移(纯合子)和曲线形状变化(杂合子)展现不同的基因型；定义已知样本基因型后，软件会自动调出所有检测样本的基因型。
【文档编号】C12Q1/68GK104450935SQ201410815918
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2014年12月25日 优先权日:2014年12月25日
【发明者】张奕, 毛丹丹, 卞雪莲 申请人:上海中优医药高科技有限公司