一种隔断式真菌异核体快速检出培养基组及其制备方法
【专利摘要】一种隔断式真菌异核体快速检出培养基组，由贫泛培养基和增富培养基组成，装设在一个试管里。贫泛培养基位于试管的下部，增富培养基位于试管的上部，中间用3-6层高压聚丙烯薄膜隔开。所述贫泛培养基主要是由NH4CL 2-4g、NaNO3 2-4g、NH4H2PO4 2-3g、多维葡萄糖2-3g、KH2PO4 2-4g、MGSO42-4g、NaCL 2-4g、MnSO4 2-4g、CaCL2 2-4g、ZnSO4 2-4g、NaHCO3 1g、土豆150-300 g、琼脂20-30 g、维生素B1 10mg和维生素B2 10mg制备成。本发明能在千万个变异的异核体中，将具有优势的异核体迅速检出，减少了科研工作量，提高了工作效率。
【专利说明】一种隔断式真菌异核体快速检出培养基组及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明专利涉及一种微生物杂交技术，特别是一种真菌单孢杂交异核体快速检出的培养基组及其制备方法。
【背景技术】
[0002]目前，众所周知，利用生物技术进行孢子杂交是获得优质高产真菌特别是食用菌新品种的有效方法，尤其是在食用菌产业上尤为多见。
[0003]目前，我国食用菌产出已成为农业生产上的一个特色产业，有的地方已成为与支柱产业，我国的食用菌产量在全世界是第一位的，已成为全世界的食用菌生产大国。
[0004]我国虽然是世界上的食用菌生产大国，但不是食用菌生产强国，为什么说不是食用菌生产强国，其主要原因是单产较低，靠的是广种薄收，如白菇，荷兰的产量是每平方米产30公斤，而我国最高的产量只有15公斤，所以在技术上，我国急需培育高产品种。
[0005]培育一个高产品种最少要3-5年，而这其中单孢杂交虽然时间短，工作量确是最大的，主要工作量都用在异核体的检出上。
[0006]单孢杂交后，形成成千上万的异核体，而这些异核体中，按照微生物学的遗传规律，正相应变异的为极少数，多数是负相应变异的，只有正相应变异的(也称正能量)才有高产和优质及抗性强的特性，而负相应变异的就没有这些特性。
[0007]实践中，要把这些正相应变异的异核体检出来，工作量是相当大的，就象大海捞针一样。
【发明内容】
[0008]本发明的目的，是提供一种隔断式真菌异核体快速检出培养基组，本发明能在千万个变异的异核体中，将具有优势的异核体迅速检出，减少了科研工作量，提高了工作效率。
[0009]本发明的另一个目的，是提供一种隔断式真菌异核体快速检出培养基组的制备方法。
[0010]采用的技术方案是:
一种隔断式真菌异核体快速检出培养基组，由贫泛培养基和增富培养基组成，装设在一个试管里。贫泛培养基位于试管的下部，增富培养基位于试管的上部，中间用3-6层高压聚丙烯薄膜隔开。
[0011]所述贫泛培养基主要是由NH4CL 2-4g、NaNO3 2_4g、NH4H2PO4 2_3g、多维葡萄糖2-3g、KH2PO4 2-4g、MGS042-4g、NaCL 2_4g、MnSO4 2_4g、CaCL2 2_4g、ZnSO4 2_4g、NaHC03lg、土豆150-300 g、琼脂20-30 g、维生素B1 1mg和维生素B2 1mg制备成。
[0012]增富培养基主要是由5%的棉籽皮浸出液1000ml、土豆200 g、多维葡萄糖20g、琼脂 25g、MGS043g、KH2PO4 3g、NaCL 3g、MnS04 3g、CaCL2 3g、ZnSO4 3g、蛋白胨 5g、酵母膏 6g、维生素B1 10mg、维生素B2 1mg和NaHC03 Ig制备成。
[0013]上述贫泛培养基采用梯度法研制出；
上述增富培养基用拉丁正交实验法研制出。
[0014]贫泛培养基的制备方法，包括下述步骤:
1、土豆洗净去外皮，用刀切成5mmX 5mm的方块,称重取150-300 g,加水至1000ml,煮沸30分钟，然后用4层纱布过滤，水份不足1000ml，加水至1000ml，备用。
[0015]2、取步骤I制备的土豆滤液1000 ml，加入20_30g琼脂，加热，搅拌至琼脂全部溶化，过滤，定容1000 ml，然后在搅拌中加入NH4CL 2_4g、NaNO3 2_4g、NH4H2PO4 2_3g ;、多维葡萄糖 2-3g、MGS04 2-4g、KH2PO4 2_4g、NaCL 2_4g、MnS04 2_4g、CaCL2 2_4g ZnSO4 3g 和NaHC03 1-1.5g，待搅拌使无机盐充分溶化后，放入高压灭菌器中，在120°C、0.118mpa灭菌40分钟，即得。
[0016]增富培养基的制备方法，包括下述步骤:
1、土豆洗净去皮，切成5X5mm的方块，取200 g，加水至1000 ml，煮沸30分钟，然后用4层纱布过滤，滤液加水至1000 ml，备用；
2、取棉籽皮50g，加水1000 ml，在60°C水溶锅中60分钟，过滤，取滤液定容1000 ml,
备用;
3、合并步骤I和步骤2所得滤液2000ml，加入琼脂25 g，加热，搅拌，使琼脂全部溶化，过滤，定容为 1000 ml，然后加入 MGS043g、KH2PO4 3g、NaCL 3g、MnS04 3g、CaCL2 3g、ZnSO4 3g和NaHC03 l_g,搅拌,使无机盐全部溶化,再加入蛋白胨5g、酵母膏6g、维生素B1 10mg、维生素B2 1mg搅拌均勻，在120°C、0.118mpa下灭菌40分钟，即得。
[0017]制备好贫泛和增富培养基后,取20X200mm的试管,靠底部的一端装入贫泛培养基，堆成斜面在无菌条件下，用接种耙子在斜面中间，将上部培养基切除，需切成摆齐的横面。取无菌聚丙烯薄膜3-6片贴于贫泛培养基端面上，然后植入带有横断面的增富培养基，贴紧，贴实，即得隔断式真菌异核体快速检出培养机组。
[0018]本发明的优点:
本发明的一种隔断式真菌异核体快速检出培养基组，能在千万个变异的异核体中，将具有优势的异核体迅速检出，减少了科研工作量，提高了工作效率，为食用菌新品种培育创出了一条新路。
【具体实施方式】
[0019]本发明的一种隔断式真菌异核体快速检出培养基组，由装设在试管中的贫泛培养基和增富培养基，中间隔设高压聚丙烯薄膜构成。
[0020]在真菌单孢杂交中，异核体的检出是工作量较大的一个过程，而往往检出的也不知是正相应变量还是负相应变量的，这其中又有很大的盲目性。
[0021]本发明的贫泛培养基，将具有异核体的菌丝转接在此培养基上，只有少数正变相应变量的异核体才能萌发成初级菌丝。
[0022]本发明有利于将异核体中少数具有抗性强的初级菌丝的检出，具有正变相应的异核体在贫泛培养基上萌发后，这时如果用接种针去挑取，很可能无意中碰到其他异核体，会一同带过来，针对这种情况，本项发明在试验中研究出了一个试管装两种培养基的作法，其试验的结果是，正变相应的初级菌丝，具有一定抗性的，在贫泛培养基上也能萌发。
[0023]因为新形成异核体，来自两个亲本，并具有了生长优势，细胞分裂速率快，细胞内Emp生化途径中，酶的洁性高，同化作用较强，所以在表现型上，前端菌丝较旺盛，大部分能伸近过3层聚丙烯薄膜，长到增富培养基上，在增富培养基上初生菌丝扭结，形成肉眼可见的菌落。而那些未能形成优势的异核体，虽然也能形成初生菌丝，但由于细胞内Emp等生化途径中酶的洁性较低，在第一时间很难越过3层聚丙烯薄膜，这样两者就形成了时间差，抓住这个时间差，挑取前端菌丝，这样工作的目的性就增强了，大大减少了工作量。
[0024]贫泛培养基的研究
根据微生物生理原理，真菌孢子萌发需要N源，C源，无机盐，生长因素，适合的PH值，根据配方的不同，分为合成培养基及完全培养基，本贫泛培养是介于合成培养基和完全培养基过渡中间的一种培养基，使孢子即能萌发，又需要有一定的优势，即抗性强的，适应性强的异核体才能萌发，培养基的配方摸索采用梯度法摸索而成。
[0025]贫泛培养基的配方
将真菌孢子萌发所需要的N源，C源，无机盐分成三个梯度，分别称I号，2号，3号。
[0026]I号培养基
NH4CL 2g ；NaN03 2g ；NH4H2P04 2g ;多维葡萄糖 2g ; MGS04 2g ； KH2PO4 2g ； NaCL
2g ； MnSO4 2g ； CaCL2 2g ；ZnSO4 2g ；NaHC03 Ig
土豆150g ;琼脂20g
维生素B1 1mg ； 维生素B2 1mg
2号培养基配方土豆250g ； 琼脂25g
NH4CL 3g ；NaN03 3g ；NH4H2P04 3g ;多维葡萄糖 2.5g ;MGS04 3g ； KH2PO4 3g ； NaCL3g ； MnSO4 3g ； CaCL2 3g ；ZnSO4 3g ；NaHC03 Ig维生素B1 1mg ； 维生素B2 1mg
3号培养基
土豆300g ； 琼脂30g
NH4CL 4g ； NaNO3 4g ；NH4H2P04 3g ;多维葡萄糖 3g ;MGS04 4g ； KH2PO4 4g ； NaCL4g ； MnSO4 4g ； CaCL2 4g ；ZnSO4 4g ；NaHC03 Ig维生素B1 1mg ； 维生素B2 1mg0
[0027]贫泛培养基的制备方法
土豆洗净去外皮，用刀切成5mmX 5mm的方块,分别按配方称重，加水至1000ml,煮沸30分钟，然后用4层纱布过滤，水份不足1000ml，加水至1000ml。
[0028]取滤液1000ml，按各号配方的称取琼脂加入滤液中，用小火加热并用玻璃棒适时搅拌，至琼脂全部溶化后再过滤，定容100ml，然后再分别加入其它成份，加入过程中，要不断用玻璃棒搅拌，防止无盐类物质未充分溶化时沉淀。
[0029]待各种无机盐类充分溶化后将培养基分装20mm X 200mm的试管中，塞入棉塞,每5支I捆，用牛皮纸包好，放入高压灭菌器内，在120°C恒温高压0.1lSmpa进行高压灭菌，灭菌时间40分钟，灭菌完毕，就热摆成斜面备用。
[0030]贫泛培养基的培养试验
培养容器:取直径8cm的培养皿作培养容器材料与方法:分别取1、2、3号培养基作3个处理，每个处理7次重复。
[0031]在无菌条件下，将培养基倒入平皿中，凝固后，分别倒入10_5的孢子菌悬液，24°C恒温5天。
[0032]结果与分析:
恒温培养5天后，经数据统计分析，I号培养基平均孢子萌发数7个菌落；2号11个菌落；3号14个菌落。I号培养基菌落数最少，说明I号培养基起到贫泛作用，很多孢子在此培养基上不能萌发，只有相对比较抗性强的菌落才能萌发，I号培养基起到贫泛培养基的作用。可作为异核体检出培养基应用。
[0033]增富培养基的研究
增富培养基的作用，是让具有优势抗性强的菌丝爬过聚丙烯薄膜隔离带后，爬到增富培养基上，迅速生长，显现出来，以便在试管内形成的菌丝体，即能用60倍放大镜肉眼能见至IJ，又是独立的菌丝体扭结形成的。
[0034]增富培养基配方:增富培养基的配方是经拉丁正交实法摸索出来的，经生物统计差异明显的组合是:5%的棉籽皮浸出液100ml代替水份，土豆200g，多维葡萄糖20g，琼脂25g，MGS04 3g ；KH2PO4 3g ；NaCL 3g ；MnSO4 3g ； CaCL2 3g ；ZnSO4 3g ;蛋白胨 5g ;酵母膏6g ;维生素 B1 1mg ；维生素 B2 1mg NaHC03 lg。
[0035]增富培养基的制备方法，包括下述步骤:
1、土豆洗净去皮，切成5X5mm的方块，取200 g，加水至1000 ml，煮沸30分钟，然后用4层纱布过滤，滤液加水至1000 ml，备用；
2、取棉籽皮50g，加水1000 ml，在60°C水溶锅中60分钟，过滤，取滤液定容1000 ml,备用;
3、合并步骤I和步骤2所得滤液2000ml，加入琼脂25 g，加热，搅拌，使琼脂全部溶化，过滤，定容为 1000 ml，然后加入 MGS043g、KH2PO4 3g、NaCL 3g、MnS04 3g、CaCL2 3g、ZnSO4 3g和NaHC03 l_g,搅拌,使无机盐全部溶化,再加入蛋白胨5g、酵母膏6g、维生素B1 10mg、维生素B2 1mg搅拌均勻，在120°C、0.118mpa下灭菌40分钟，即得。
[0036]制备好贫泛培养基和增富培养基后,取20X200mm的试管,靠底部的一端装入贫泛培养基，在无菌条件下，用接种耙子在斜面中间，将上部培养基切除，需且成摆齐的横面。取无菌聚丙烯薄膜3-6片贴于贫泛培养基端面上，然后植入带有横断面的增富培养基，贴紧，贴实，即得隔断式真菌异核体快速检出培养机组。
[0037]—种隔断式真菌异核体快速检出培养基组的制备方法
取20 mmX 200mm的试管，在靠底部的一端装入贫泛培养基，摆成斜面，待斜面形成后，在无菌条件下，用接种耙子在斜面中间，将上部培养基切出，需切成摆齐的横面。
[0038]取厚度6道的高压聚丙烯塑料薄膜，剪成同培养基横断面大小一致的形状，将聚丙烯塑料薄膜放塑料袋内，高压灭菌备用。
[0039]取经高压灭菌的聚丙烯薄膜3片，在无菌条件下，贴于贫泛培养基断面上。然后再在上面植入带有横断面的增富培养基，要贴紧、贴实，同样也在无菌条件下进行，即得。
[0040]接菌
在无菌条件下，挑取平皿上来自A、B两个单孢萌发的接合部，刚刚形成的菌落，分别挑取3个点，以等距离接于贫泛培养基上，于24°C恒温培养。
[0041]挑取优势菌丝
经24°C恒温培养后，在60倍放大镜下，挑取第一时间爬过塑料薄膜隔断的菌丝，进行后期筛选和生物学、栽培学等方面的考查。
【权利要求】
1.一种隔断式真菌异核体快速检出培养基组，包括贫泛培养基、增富培养基、聚乙烯薄膜和检出试管，其特征在于: 在检出试管中，底部为贫泛培养基，中间为三层聚丙烯薄膜隔断层，上部为增富培养基。
2.根据权利要求1所述的一种隔断式真菌异核体快速检出培养基组，其特征在于: 所述贫泛培养基主要是由NH4CL 2-4g、NaN03 2_4g、NH4H2P04 2_3g、多维葡萄糖2_3g、KH2P04 2-4g、MGS042-4g、NaCL 2_4g、MnS04 2_4g、CaCL2 2_4g、ZnS04 2_4g、NaHC03 lg、土豆150-300 g、琼脂20-30 g、维生素& lOmg和维生素民lOmg制备成; 增富培养基主要是由5%的棉籽皮浸出液1000ml、土豆200 g、多维葡萄糖20g、琼脂25g、MGS043g、KH2P04 3g、NaCL 3g、MnS04 3g、CaCL2 3g、ZnS04 3g、蛋白胨 5g、酵母膏 6g、维生素& lOmg、维生素B2 lOmg和NaHC03 lg制备成。
3.根据权利要求1所述的一种隔断式真菌异核体快速检出培养基组的制备方法，其特征在于: 贫泛培养基的制备方法，包括下述步骤: (1)土豆洗净去外皮，用刀切成5mmX5mm的方块,称重取150-300 g,加水至1000ml,煮沸30分钟，然后用4层纱布过滤，水份不足1000ml，加水至1000ml，备用； (2)取步骤1制备的土豆滤液1000ml，加入20-30g琼脂，加热，搅拌至琼脂全部溶化，过滤，定容1000 ml，然后在搅拌中加入NH4CL 2_4g、NaN03 2_4g、NH4H2P04 2_3g ;、多维葡萄糖 2-3g、MGS04 2-4g、KH2P04 2_4g、NaCL 2_4g、MnS04 2_4g、CaCL2 2_4g ZnS04 3g 和NaHC03 1-1.5g，待搅拌使无机盐充分溶化后，放入高压灭菌器中，在120°C、0.118mpa灭菌40分钟，即得; 增富培养基的制备方法，包括下述步骤: (1)土豆洗净去皮，切成5X 5mm的方块，取200 g，加水至1000 ml，煮沸30分钟，然后用4层纱布过滤，滤液加水至1000 ml，备用； (2)取棉籽皮50g，加水1000 ml，在60°C水溶锅中60分钟，过滤，取滤液定容1000 ml,备用; (3)合并步骤1和步骤2所得滤液2000ml，加入琼脂25 g，加热，搅拌，使琼脂全部溶化，过滤，定容为 1000 ml，然后加入 MGS043g、KH2P04 3g、NaCL 3g、MnS04 3g、CaCL2 3g、ZnS04 3g和NaHC03 l_g,搅拌,使无机盐全部溶化,再加入蛋白胨5g、酵母膏6g、维生素& lOmg、维生素B2 lOmg搅拌均勻，在120°C、0.118mpa下灭菌40分钟，即得。
【文档编号】C12Q1/04GK104480188SQ201410823677
【公开日】2015年4月1日 申请日期:2014年12月26日 优先权日:2014年12月26日
【发明者】韩玉才, 周伟, 王凯, 王淑华 申请人:瓦房店大河红运生态农业有限公司