一种具有生产和回收β-果糖基转移酶双重功能的酵母菌株的构建的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种具有生产和回收β-果糖基转移酶双重功能的酵母菌株的构建，属于酶工程领域。通过把酿酒酵母TDH3启动子序列、酿酒酵母分泌信号肽编码序列、β-果糖基转移酶编码序列、酿酒酵母凝聚因子C端的400个氨基酸片段编码序列、酿酒酵母TDH3终止子序列按顺序合成，在两端加上限制性内切酶位点，通过酶切构建到pPIC9K质粒中，再将该质粒转化到酵母中得到具有生产和回收β-果糖基转移酶双重功能的酵母菌株，其生产β-果糖基转移酶的回收率达到82%，发酵后β-果糖基转移酶酶活达到95.0 U/g湿酵母。本发明实现了β-果糖基转移酶生产和同步浓缩回收的一步完成，降低了能源消耗和成本，具有较强的实用性。
【专利说明】—种具有生产和回收β-果糖基转移酶双重功能的酵母菌株的构建
[0001]
【技术领域】
[0002]本发明属于酶工程领域，具体涉及一种具有生产和回收β_果糖基转移酶双重功能的酵母菌株的构建。
【背景技术】
[0003]β -果糖基转移酶能够在蔗糖的果糖基上连接1-3个果糖基而形成一系列果糖寡聚体。低聚果糖是一种水溶性膳食纤维，长期服用可以降低血清胆固醇，改善脂质代谢，经动物和人体实验证实。人体摄入低聚果糖后，体内有益菌群双歧杆菌数量可抑制外源致病菌和肠内固有腐败细菌如沙门氏菌等生长繁殖，减少肠内腐败物质的生长和积累，促进肠道蠕动，防止便秘和腹泻。低聚果糖是一种优良的水溶性膳食纤维，能有效降低血清胆固醇、甘油三脂、游离脂肪酸的数量，对于因血脂高而引起的高血压、动脉硬化等一系列心血管疾病有较好的改善作用。低聚果糖在大肠内被细菌发酵生成L-乳酸，可以溶解钙、镁、铁等矿物质，促进人体对矿物质的吸收。实验证实，低聚果糖促进钙的吸收率达70.8%。因此，低聚果糖可以促进生长发育和防止骨质疏松症。同时还可促进维生素B1、Β2、Β3、Β6、Β12及叶酸的自然形成，从而提高人体新陈代谢水平，提高免疫力和抗病力。预防及改善由于体内毒而引起的皮肤性疾病，可防止面疮、黑斑、雀斑、青春痘、老人斑，使皮肤亮丽、老化减缓。双歧杆菌吸收低聚果糖后，迅速增殖，抑制大肠杆菌、沙门氏菌和梭状芽胞杆菌等腐败菌发生作用，减少毒性代谢物(如吲哚、亚硝基氨)的生成，同时迅速将毒性代谢物排出体夕卜，减轻肝脏负担，起到保护肝脏的作用，预防各种慢性病、癌症等作用明显，低聚果糖极少会被消化道中的胃酸和酶分解，极难被人体吸收。据测定，低聚果糖的热值为1.5Kcal/g以下，而蔗糖热值为4.6 Kcal/g，因此摄入低聚果糖后，不会引起肥胖，是理想的、低热值的功能性甜味剂。低聚果糖不能被突变链球菌利用生成不溶性葡聚糖而提供口腔微生物沉积/产酸和腐蚀的场所(牙垢)，因此可以防止龋齿。低聚果糖生产的关键是生产低成本的果糖转移酶。
[0004]液体发酵具有发酵体积大，易实现自动化控制等特点，因而液体发酵在许多产品的生产上体现出巨大优势。特别是在现在劳动力成本上升，国际大力推进机械化和自动化背景下，液体发酵具有更广阔的空间。β -果糖基转移酶的生产也有越来越倾向于液体发酵的优势。但是液体发酵生产的酶类产品浓度低的特征。生产的β_果糖基转移酶等都游离在发酵醪液中，为得到高浓度的β -果糖基转移酶的固体坟墓，需要对发酵醪液进行浓缩。为纯化浓缩β_果糖基转移酶往往需要通过真空蒸发或喷雾干燥等工艺来浓缩。在蒸发浓缩或喷雾干燥的过程中，β -果糖基转移酶的活性丧失一部分，而且浓缩工艺大幅度提高了生产成本，在蒸发或喷雾干燥的过程中，消耗大量的能源如电或燃气等。因此降低浓缩成本，成为降低液体发酵生产β-果糖基转移酶生产成本的必然选择。
【发明内容】
[0005]本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种具有生产和回收β-果糖基转移酶双重功能的酵母菌株。
[0006]本发明的另一目的在于提供用于构建上述酵母菌株的DNA片段。
[0007]本发明的再一目的在于提供用于构建上述酵母菌株的质粒。
[0008]本发明的目的还在于提供上述酵母菌株的构建方法。
[0009]本发明的目的通过下述技术方案实现:
用于构建具有生产和回收β -果糖基转移酶双重功能的酵母菌株的DNA片段，包括按顺序排列的酿酒酵母TDH3启动子序列、酿酒酵母分泌信号肽编码序列、β -果糖基转移酶编码序列、酿酒酵母凝聚因子C端的400个氨基酸片段编码序列、酿酒酵母TDH3终止子序列；上述序列分别如SEQ ID N0.1?5所示。
[0010]优选的，所述的用于构建具有生产和回收β -果糖基转移酶双重功能的酵母菌株的DNA片段的序列如SEQ ID N0.6所示。
[0011]用于构建具有生产和回收β -果糖基转移酶双重功能的酵母菌株的质粒为包含上述DNA片段的真核表达质粒。所述的真核表达质粒优选为PPIC9K质粒。
[0012]所述的用于构建具有生产和回收β -果糖基转移酶双重功能的酵母菌株的质粒通过包含如下步骤的方法制备得到:合成两端有限制性内切酶识别位点含有上述DNA片段的序列,通过限制性内切酶连接到真核表达质粒上。所述的真核表达质粒pPIC9K质粒时，限制性内切酶优选为Bgl II和FspA I。
[0013]一种具有生产和回收纤β_果糖基转移酶双重功能的酵母菌株，含有上述质粒。所述的酵母菌株优选为酵母菌株SMDl 168。
[0014]所述的具有生产和回收β -果糖基转移酶双重功能的酵母菌株的构建方法，包括如下步骤:制备酵母电转化感受态细胞，将上述质粒通过电转化转进酵母中得到。
[0015]本发明相对于现有技术具有如下优点和效果:
本发明的酵母菌株能在生产β_果糖基转移酶的同时，把β_果糖基转移酶吸附在菌株自身表面，通过简单过滤，就能达到浓缩β -果糖基转移酶的目的。
[0016]本发明大大简化了果糖基转移酶的浓缩工艺，降低了能源消耗，大幅度降低了成本，因此该发明具有较强的实用性。
[0017]本发明把果糖基转移酶基因在酵母内表达，并实现了果糖基转移酶生产和同步浓缩回收的一步完成，现有技术未有相关报道，具有较高的创新型。
[0018]本发明酵母菌株生产β_果糖基转移酶的回收率达到82%，发酵后β_果糖基转移酶的酶活达到95.0U/g湿酵母。
【具体实施方式】
[0019]下面结合实施例对本发明做进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
[0020]实施例1
(l)pPIC9K质粒的提取 I)接1%含PPIC9K质粒的大肠杆菌细胞于2mL LB培养基。
[0021]2) 37°C振荡培养 12h。
[0022]3)取1.5mL菌液于EP管，以4000rpm离心3min,弃上清液。
[0023]4)加 0.1mL 溶液 I (1% 葡萄糖，50mM EDTA ρΗ8.0, 25mM Tris-HCl ρΗ8.0)充分混入口 ο
[0024]5)加入0.2mL溶液II (0.2mM NaOH, 1% SDS),轻轻翻转混匀，置于冰浴5min。
[0025]6)加入0.15mL预冷溶液III (5mol/L KAc, pH4.8),轻轻翻转混勻，冰浴5min。
[0026]7)以1000rpm离心20min,取上清液于另一新EP管中。
[0027]8)加入等体积的异戊醇，混匀后静置1min。
[0028]9)再以 1000rpm 离心 20min,弃上清。
[0029]10)用70%乙醇0.5mL洗涤一次,抽干所有液体。
[0030]11)待沉淀干燥后，溶于0.05mL TE缓冲液中。
[0031](2)大肠杆菌DH5a感受态细胞的制备
I)将大肠杆菌DH5 a置于LB或其它营养丰富的培养基上，在37°C下过夜培养。
[0032]2)高温灭菌大的离心瓶(250?500mL)以备第二天摇瓶用。
[0033]3)准备几瓶灭菌水(总量约1.5升)，保存于冷冻室中以备第二天重悬浮细胞用。
[0034]4)转移0.2?ImL过夜培养物至装有20mL LB (或其他营养丰富的培养基)的10mL摇瓶。
[0035]5) 37°C下剧烈振荡培养6小时。
[0036]6)监控0D600值(培养I小时后每半小时测定一次)。
[0037]7)当0D600值达到0.5?1.0时，从摇床中取出摇瓶，置于冰上冷却15分钟。
[0038]8)细胞在4°C 5000g下离心15分钟，弃上清液。
[0039]9)用灭菌的冰水重悬浮细胞，先用涡旋仪或吸液管重悬浮细胞于少量体积中(几毫升)，然后加水稀释至离心管的2/3体积。
[0040]10)照上面步骤重复离心，小心弃去上清液。
[0041]11)照上面步骤用灭菌的冰水重悬浮细胞。
[0042]12)离心，弃上清液。
[0043]13)用20mL灭菌的、冰冷后的10%甘油重悬浮细胞。
[0044]14)照上面步骤离心，小心弃去上清液(沉淀可能会很松散)。
[0045]15)用10%甘油重悬浮细胞至最终体积为2?3mL。
[0046]16)将细胞按150 μ L等份装入微量离心管，于_80°C保存。
[0047](3)pPIC9K重组质粒构建
I)用限制性内切酶Bgl I1、FspA I分别酶切质粒pPIC9K。限制性内切酶Bgl I1、FspA I(TAkaRA)各 1.5μ?，提取的 pPIC9K 质粒溶液 6μ?，10ΧΚ Buffer WL 加入到 ΙΟΟμ? EP 管中，在30°C水浴锅中酶切60min。再通过琼脂糖凝胶电泳回收酶切的质粒pPIC9K得到的三个片段中最大的一个片段。
[0048]2)序列合成和酶切
合成两端具有Bgl II和FspA I识别序列的序列GGAGATCTTCTAGACC-酿酒酵母TDH3启动子序列-酿酒酵母分泌信号肽编码序列-果糖基转移酶编码序列-酿酒酵母凝聚因子C端的400个氨基酸片段编码序列-酿酒酵母TDH3终止子序列-GGTGCGCACCC，各片段及全长片段如SEQ ID N0.1?6所示。将合成的全长片段也用Bgl II和FspA I进行酶切并回收。
[0049]3)连接
酶切的全长片段2(^1^，酶切的口？1091(质粒541^，10\131^€61 5μ?, ddH20 ΙΟμ?, Τ4 DNA连接酶(Takara) 5μ?加入ΙΟΟμ? EP管中，16°C连接过夜。
[0050]4)将上述连接产物电转化到大肠杆菌DH5 α，电转化具体方法如下:
4.1)在冰上解冻大肠杆菌DH5 α感受态细胞，添加I?10 μ L连接产物，冰上放置约5分钟。
[0051]4.2)转移连接产物/细胞混合物至冷却后的2mm电穿孔容器中。
[0052]4.3)加载电转仪 P1000，准备好 300 μ L LB 或 2ΧΥΤ。
[0053]4.4)对电穿孔容器进行脉冲(200欧姆，25 μ F，2.5千伏)，检查时间常数，应该在3以上。
[0054]4.5)立即添加300yL的LB或2ΧΥΤ至电转杯中。
[0055]4.6) 37°C下培养细胞40分钟至I小时以复苏。
[0056]4.7)复苏后离心弃掉150 μ L上清，剩余150 μ L重悬菌体涂布到含有氨苄(10Pg/mL)的LB或2XYT培养基的固体平板上，于37°C培养过夜。
[0057]5)挑去固体平板上生长的单克隆,通过培养,提取质粒,用Bgl II和FspA I对质粒进行酶切鉴定，鉴定正确的质粒再进一步测序，得到PPIC9K重组质粒。
[0058](4)酵母感受态细胞的制备
I)挑一环酵母菌(SMD1168)接种于5mL YEPD培养基中，30°C、250?300rpm培养过夜得到一级种子。
[0059]2)取ImL—级种子分别接种于两瓶50mL YEI3D培养基中，30°C、250?300rpm培养约 16 ?18h (0D600 约 1.3 ?1.5)。
[0060]3)于4°C离心收集菌体,用25mL冰预冷无菌水洗漆一次后,细胞用1mL冰预冷无菌水重悬，可换成较小的离心管。
[0061]4)加入ImL ρΗ7.5的10ΧΤΕ缓冲液，摇晃均匀，再加入ImL 1XLiAc,旋转摇匀，于30 °C轻轻摇动45min。
[0062]5)再加入0.4mL lmol/L DTT，并同时旋转摇动，于30°C轻轻摇动15min。
[0063]6)于4°C离心，弃上清(用枪吸)，再用25mL冰预冷无菌水洗涤。
[0064]7) 2.5mL冰预冷的lmol/L山梨醇洗涤，离心收集菌体，弃上清(用枪吸)。
[0065]8)每管用100 μ L lmol/L山梨醇溶解，分装于3个EP管中(80 μ L/管)，于_70°C冰箱保存。
[0066](5 ) pPIC9K重组质粒电转化酵母
I)向酵母感受态细胞中加入约5?1yg (体积小于10μυΡΡΚ9Κ重组质粒，用枪吹吸均匀，转移至预冷的电转杯中，静置5min。
[0067]2)擦干电转杯，电击，电击参数:1.5KV,25uF,200欧姆。
[0068]3)立即加入ImL冰预冷的lmol/L山梨醇，转移至离心管中，于30°C静置lh。
[0069]4)离心，弃上清，加入ImL YEPD后，于30°C、200rpm培养2h。
[0070]5)离心得菌体后，吸除550 μ L上清液，然后取150 μ L涂lOOPg/mL氨苄YEPD板于30°C培养至长出转化子。
[0071](6)酵母转化子发酵
挑取的转化子在YEro培养基中30°C培养24h，以10%接种量(v/v)接种于发酵培养基(酵母浸膏10g/L，蛋白胨20g/L，50mM柠檬酸缓冲液)中。发酵在500mL摇瓶中发酵，装液量为20% (v/v )，在发酵培养基中培48h。
[0072](7) β-果糖基转移酶的回收
发酵液在离心机中4000r/m离心lOmin，收集上清液(上清液中有游离的β -果糖基转移酶，用于β -果糖基转移酶回收率的计算)，按酵母沉淀湿重与蒸馏水质量比1:10的比分例加入蒸馏水，用蒸馏水洗涤两次，收集酵母沉淀，β -果糖基转移酶吸附在酵母表面。
[0073](8) 果糖基转移酶活测定:试管中分别加入ImL上清液或1.0g酵母沉淀，力口A 50mmol/L pH6.0磷酸缓冲液溶解的10% (w/w)鹿糖,40°C下保温60min, 95°C保温5min。高效液相色谱法测定剩余量，通过计算可得蔗糖的减少量。色谱条件:色谱柱为Watercarbohydrate (250mmX4.6mm);流动相为乙腈:水溶液(75:25);流速 lmL/min ;进样量15 μ L ;检测波长283nm ;柱温35 °C。
[0074]酶活定义为:在40°C，pH值6.0条件下，每分钟分解IMfflol蔗糖的酶量为1U。
[0075]β -果糖基转移酶回收率(％)=酵母沉淀的酶活/ (上清液的酶活+酵母沉淀的酶活)X 100%O
[0076]经过测定β -果糖基转移酶的回收率达到82%，发酵后β -果糖基转移酶的酶活达到95.0U/g湿酵母。β -果糖基转移酶较高的回收率，说明在发酵的时候，构建的酵母能很好的富集浓缩β -果糖基转移酶，实现了发酵和浓缩的一步完成。
[0077]上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
【权利要求】
1.用于构建具有生产和回收β-果糖基转移酶双重功能的酵母菌株的DNA片段，其特征在于:包括按顺序排列的酿酒酵母TDH3启动子序列、酿酒酵母分泌信号肽编码序列、β -果糖基转移酶编码序列、酿酒酵母凝聚因子C端的400个氨基酸片段编码序列、酿酒酵母TDH3终止子序列。
2.根据权利要求1所述的DNA片段，其特征在于:所述的序列分别如SEQID N0.1?5所示。
3.根据权利要求1所述的DNA片段，其特征在于:所述的DNA片段的序列如SEQIDN0.6所示。
4.用于构建具有生产和回收β_果糖基转移酶双重功能的酵母菌株的质粒，其特征在于:为包含权利要求1-3任一项所述的DNA片段的真核表达质粒。
5.根据权利要求4所述的质粒,其特征在于:所述的真核表达质粒为pPIC9K质粒。
6.根据权利要求4所述的质粒，其特征在于:通过包含如下步骤的方法制备得到:合成两端有限制性内切酶识别位点含有权利要求1-3任一项所述的DNA片段的序列，通过限制性内切酶连接到真核表达质粒上。
7.根据权利要求6所述的质粒,其特征在于:所述的真核表达质粒为pPIC9K质粒时，限制性内切酶为Bgl II和FspA I。
8.一种具有生产和回收β_果糖基转移酶双重功能的酵母菌株，其特征在于:包含权利要求4-7任一项所述的质粒。
9.根据权利要求8所述的酵母菌株，其特征在于:所述的酵母菌株为酵母菌株SMDl168。
10.权利要求8或9所述的酵母菌株的构建方法，其特征在于包括如下步骤:制备酵母电转化感受态细胞，将权利要求4-7任一项所述的质粒通过电转化转进酵母中得到。
【文档编号】C12R1/865GK104498513SQ201410839854
【公开日】2015年4月8日 申请日期:2014年12月30日 优先权日:2014年12月30日
【发明者】章轶锋, 薛栋升 申请人:湖北工业大学