含有石榴浓缩物作为活性成分的用于改善皮肤的组合物的制作方法

本发明涉及一种使用天然植物材料作为活性成分以促进透明质酸合成的方法以及由此改善皮肤保湿、皮肤皱纹、皮肤美白、皮肤角质化等的方法。本申请要求于2014年7月22日提交的韩国专利申请号10-2014-0092819的优先权，其公开内容通过引用整体并入本文。
背景技术：
：透明质酸是在动物的皮肤等中丰富的生物合成的天然物质。透明质酸也称为玻尿酸。它是亲水的，因为它有许多羟基(-oh)基团，并参与皮肤保湿。它还通过与在各种上皮细胞中表达的cd44蛋白反应来调节各种生理作用。皮肤是不断与外部接触的器官。它由来自外部的表皮、真皮和皮下脂肪组织的三层组成，并保护人体免受来自外部的物理和/或化学刺激。特别地，皮肤起到控制水分损失的重要作用，所述水分占人体的约65-70％，输送人体所需的各种生理活性物质排出人体，并维持软和湿状态。然而，随着老化，皮肤内在地经历调节代谢的各种激素的分泌减少，同时由于免疫细胞功能和细胞活性的降低，身体所需的免疫蛋白和生物学蛋白的生物合成会减少。外在地，由于臭氧层破坏引起的紫外线辐射增加和环境污染恶化，使得自由基、有害活性氧等增多，因此导致皮肤的功能和美感下降。因此，正在积极地进行改善皮肤的有效性和安全性均优异的物质的研究。另外，正在积极地进行关于通过外用方式(例如化妆品)提供皮肤状态改善效果且通过饮食摄取提供皮肤改善效果的物质的研究。在这方面，对于显示出皮肤改善效果的天然植物材料的兴趣不断增加。因为许多天然植物材料已经显示出通过数百年的使用而证实的安全性或效果，所以它们在安全性和环境友好方面是有利的。因此，需要一种有效改善皮肤并且安全的物质。技术实现要素：技术问题本发明涉及提供一种有效促进透明质酸合成的天然植物材料。本发明还涉及提供一种用于改善皮肤，特别是保湿皮肤的组合物，其包含对于透明质酸合成有效的天然植物材料作为活性成分，以及使用该组合物改善皮肤，特别是保湿皮肤的方法。本发明还旨在提供一种用于加工天然植物材料组合物的方法，其改善了促进透明质酸合成的效果。技术方案在一个方面，本发明提供了：用于促进透明质酸合成的方法，其包括将含有石榴浓缩物作为活性成分的食品或药物组合物施用于需要促进透明质酸合成的受试者；和/或用于促进透明质酸合成的组合物，其含有石榴浓缩物作为活性成分。石榴浓缩物可以含有优选0.8mg/g以上，更优选0.8-3mg/g的鞣花酸。此外，石榴浓缩物可以含有优选8mg/g以上，更优选8-15mg/g的多酚。本发明的发明人惊奇地发现，通过对用淀粉降解酶处理石榴果实而获得的石榴降解产物进行加热浓缩的工艺所制备的石榴浓缩物有效促进透明质酸合成，并且含有石榴浓缩物作为活性成分的组合物显示出优异的皮肤保湿效果。他们还发现，除了皮肤保湿效果之外，石榴浓缩物还表现出包括改善皮肤弹性、改善色素沉着、美白皮肤、改善皮肤紧绷、改善皮肤纹理、增亮肤色和/或减少皮肤角质化等的优异的皮肤改善效果，。石榴(punicagranatuml.)是一种植物，原产于西南亚、印度西北部和加利福尼亚。它广泛分布在亚热带和热带地区。从很久以前，已知石榴，特别是红石榴是一种补品，并且已知它能有效地预防高血压和动脉硬化。它富含38-47％的水溶性糖，并且还含有各种维生素和矿物质。根据本发明的石榴浓缩物是指通过对用淀粉降解酶处理石榴果实而获得的石榴降解产物进行加热浓缩的工艺所制备的石榴浓缩物。可以优选在40-65℃，更优选在45-60℃下用淀粉降解酶进行处理。用淀粉降解酶处理的时间可以优选在100分钟以内，更优选为50-70分钟，最优选在约60分钟以内。加热浓缩可以优选进行3次以上，更优选地，在40-110℃的范围内进行3次以上。石榴浓缩物可以含有0.8mg/g以上，优选0.8-3mg/g，更优选1.8-3mg/g，甚至更优选2.4-3mg/g，最优选2.7-3mg/g的鞣花酸，尽管可以根据石榴的收获地点和时间而变化。此外，石榴浓缩物可以含有8mg/g以上，优选8-15mg/g，更优选11.5-13mg/g，甚至更优选11.79-12.59mg/g的多酚。当鞣花酸浓度低于0.8mg/g或当多酚浓度低于8mg/g时，促进透明质酸合成的效果可能不显著。并且，当鞣花酸浓度超过3mg/g或当多酚浓度超过15mg/g时，可能发生诸如got和gpt的肝功能水平偏离正常范围的副作用。据推测，石榴浓缩物促进透明质酸合成的效果来源于后述特定的制备方法，特别是来自用淀粉降解酶处理的方法、石榴浓缩物的浓缩方法、加热温度和压力等，但本发明不限于此。更具体地，通过压榨石榴果实并用淀粉降解酶处理后进行加热浓缩所获得的石榴浓缩物与通过压榨石榴果实所获得的石榴汁相比，具有显著优越的促进透明质酸合成的效果。然而，尽管预测存在于天然石榴果实中的各种糖或相同结构重复连接的成分在用淀粉降解酶处理和/或经加热浓缩的化学处理工艺期间被转化为苷元且这些转化的的成分的复合机制产生该效果，但本发明不限于此。例如，根据本发明的石榴浓缩物与相同浓缩倍数的石榴汁相比含有显著更高量的多酚。用于本发明的石榴可以是例如伊朗石榴、土耳其石榴、美国石榴或其混合物。例如，土耳其石榴栽培品种包括hicaznarpomegranatecv.、cekirdeksizvipomegranatecv.、silifkeasisipomegranatecv.、katirbasipomegranatecv.、lefanpomegranatecv.等，但不限于此。对于根据本发明的石榴浓缩物的制备，可以仅使用不包括石榴果皮和种子的石榴果肉。石榴的果皮和种子可能引起副作用。例如，包含在石榴果皮中的生物碱可能会降低生物功能，并且具有痉挛、抽搐、昏迷等的风险，因为它们影响呼吸系统和肌肉。并且，石榴种子浓缩物可能在一些人中引起副作用，例如过敏、舌头肿胀等。在另一方面，本发明提供了一种制备能够促进透明质酸合成的石榴浓缩物的方法，其包括用淀粉降解酶处理石榴果实的步骤和通过加热而浓缩石榴降解产物的步骤。根据本发明的石榴浓缩物可以通过包括用淀粉降解酶处理石榴果实的步骤和通过加热而浓缩石榴降解产物的步骤的方法制备。例如，在清洗石榴后，完全除去果皮和种子，并在短时间内进行灭菌。然后，通过加入淀粉降解酶降解石榴中含有的多糖例如淀粉等。然后，通过选择性地添加诸如明胶、二氧化硅、膨润土、硅溶胶、单宁、纤维素或酪蛋白酸钙等的添加剂来控制石榴浓缩物的浊度、颜色、粘度等，然后通过加热浓缩来制备石榴浓缩物。另外，在各个步骤之间可以包括过滤步骤。例如，在除去果皮和种子的步骤之后并在高温灭菌步骤之前、在用淀粉降解酶处理的步骤之后并在浓缩步骤之前和/或在浓缩步骤之后可以进一步包括过滤工艺。更具体地，通过用淀粉降解酶处理石榴果实而获得石榴降解产物的步骤可以包括以下步骤：s1)从伊朗石榴、土耳其石榴、美国石榴或其混合物中除去果皮和种子并仅获得石榴果肉的步骤在示例性实施方式中，仅利用排除石榴果皮和种子后的石榴果肉提供浓缩物。s2)对所述石榴果肉进行灭菌的步骤分步将石榴果肉灭菌。灭菌可以在高温或低温下进行，并优选在短时间(例如50-80秒)内进行灭菌。s3)用淀粉降解酶处理经灭菌的石榴果肉的步骤用淀粉降解酶处理经灭菌的石榴果肉。可以优选在40-65℃，更优选在45-60℃下用淀粉降解酶进行处理。该酶处理时间可以优选在100分钟以内，更优选为50-70分钟，甚至更优选在60分钟以内，最优选为约60分钟。可以使用本领域已知的各种淀粉降解酶，而没有特别限制。例如，可以使用果胶酶、蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶等。优选地，可以使用果胶酶。石榴降解产物可以通过在40-110℃的范围内优选加热3次以上来浓缩。更具体地，加热浓缩可以通过如下所述的两种方法进行：s4-1)可以通过在70-100℃和400-850mbar下升温升压的同时进行2次以上的加热后在40-80℃和100-350mbar下降温降压的同时进行1次以上的加热来浓缩石榴果肉降解产物。也就是说，通过在升温升压的同时进行加热后在降温降压的同时进行加热来浓缩石榴果肉降解产物。在升温升压的同时可以优选进行2次以上的加热浓缩，更优选进行3次以上的加热浓缩，在降温降压的同时可以优选进行1次以上，更优选进行2次以上的加热浓缩。加热浓缩可以进行总共3次以上。在70-100℃和400-850mbar下升温升压的同时进行加热浓缩，并且每次加热浓缩的温度和压力设为不同，但只要在上述温度和压力范围内进行升温升压，本发明对此就没有特别限制。优选地，可以在70-85℃和400-550mbar下进行第一次加热浓缩、在85-92℃和550-750mbar下进行第二次加热浓缩以及在92-100℃和750-850mbar下进行第三次加热浓缩。更优选地，可以在78-82℃和450-500mbar下进行第一次加热浓缩、在85-90℃和600-650mbar下进行第二次加热浓缩以及在92-98℃和800-850mbar下进行第三次加热浓缩。在40-80℃和100-350mbar下降温降压的同时进行加热浓缩，并且每次加热浓缩的温度和压力设为不同，但只要在上述温度和压力范围内进行降温降压，本发明对此就没有特别限制。优选地，可以在60-80℃和250-350mbar下进行第四次加热浓缩以及在40-60℃和100-250mbar下进行第五次加热浓缩。更优选地，可以在65-72℃和300-330mbar下进行第四次加热浓缩以及在45-55℃和100-150mbar下进行第五次加热浓缩。或者，s4-2)可以在55-90℃下进行第一次加热浓缩、在105-110℃下进行第二次加热浓缩以及在100-105℃下进行第三次加热浓缩。在一个示例性实施方式中，根据本发明的石榴浓缩物有效地促进透明质酸合成。因此，可以预期由于透明质酸合成增加而产生的有利的生理效应。例如，它有效地改善皮肤保湿。因此，一方面，本发明可以提供用于改善皮肤保湿的方法和/或用于保湿皮肤的组合物。更具体地，本发明可以提供用于保湿皮肤的组合物，其含有石榴浓缩物作为活性成分。另一方面，本发明可以提供一种用于改善皮肤保湿的方法，其包括将含有石榴浓缩物作为活性成分的食品或药物组合物施用于需要皮肤保湿的受试者的步骤。另一方面，本发明可以提供通过用含有石榴浓缩物作为活性成分的组合物在体外处理经分离的细胞来促进透明质酸合成的方法。例如，受试者可以是包括啮齿动物、哺乳动物等的动物，优选是人。并且，细胞可以是来自诸如啮齿动物，哺乳动物等的动物的细胞。优选地，其可以来自人。本发明的发明人还发现，除了如上所述的促进透明质酸合成的效果以外，石榴浓缩物还通过以浓度依赖性方式降低mmp-1和弹性蛋白酶来有效改善皮肤皱纹，并且通过以浓度依赖性方式减少黑色素来美白皮肤。通过临床评价还发现，其具有整体改善皮肤的极好效果，包括减少角质化、改善皮肤弹性、改善皮肤颜色、改善皮肤皱纹、美白皮肤等。因此，除了用于皮肤保湿以外，根据本发明的含有石榴浓缩物作为活性成分的组合物可用于整体改善皮肤。例如，其可以用于提供选自由改善皮肤弹性、改善色素沉着、美白皮肤、改善皮肤紧绷、改善皮肤纹理、增亮皮肤色调和/或减少角质化所组成的组中的一种或多种皮肤改善效果，特别是除了保湿皮肤之外，还包括选自由改善皮肤皱纹、美白皮肤、改善皮肤弹性和减少角质化所组成的组中的一种或多种皮肤改善效果。根据本发明的组合物可以在发生透明质酸缺乏和/或皮肤保湿不足的症状之后施用，或者在预期或诊断出透明质酸缺乏和/或皮肤保湿不足之后提前施用。根据本发明的组合物可以用于需要上述效果的各种目的。例如，其可以用作食品(包括保健功能性食品)组合物、药物组合物或化妆品组合物。因此，本发明提供了含有上述组合物的食品组合物、药物组合物或化妆品组合物。更具体地，本发明可以提供用于皮肤保湿的有效促进透明质酸合成的食品组合物、药物组合物或化妆品组合物，其含有通过上述方法制备的石榴浓缩物作为活性成分。上述食品包括保健辅助食品、保健功能食品、功能性食品等，但不限于此，并且还可以包括添加有根据本发明的石榴浓缩物的天然食品、加工食品、食料等。除了石榴浓缩物之外，根据本发明的食品组合物还可以含有通常用于食品或食品组合物中的成分。还可以在不负面影响本发明目的的范围内单独或组合地包括天然植物浓缩物，例如芍药、樟子、刺五加皮、灵芝蘑菇、金缕梅、黄麻、当归、栀子、黄芪、麦芽和三叶橙，以及维生素c、果寡糖、甜菊苷、纯净水、麦芽糖糊精等。然而，还可以添加到本发明的食品中的其它活性成分和/或添加剂不限于上述实例。例如，根据本发明的食品可以含有水溶性维生素，例如硫胺素(维生素b1)、核黄素、抗坏血酸、烟酸和维生素b6；脂肪酸，例如肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、油酸、亚油酸等；弱酸，例如乙醇酸和乙酸；以及氨基酸包括苏氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和赖氨酸作为8种必需氨基酸，以及天冬氨酸、丝氨酸、谷氨酸、脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、组氨酸、精氨酸等。活性成分的混合量可以根据使用目的(预防、改善、治疗等)适当确定。通常地，根据本发明的食品组合物可以含有10-90重量％的用于食品或饮料的活性成分。食物组合物中石榴浓缩物的有效剂量可以根据药物组合物的有效剂量确定，并且可以低于上述范围以长期摄取。但是，因为活性成分根本没有安全问题，所以可以以更大的量使用。根据本发明的食品的种类没有特别限制。例如，其可以是用于施用的制剂的形式，例如片剂、硬或软胶囊剂、溶液剂、悬浮剂等。这些制剂可以通过使用通常可接受的载体制备。例如，可以通过使用赋形剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂、增溶剂、悬浮剂、防腐剂、增量剂等来制备用于口服给药的制剂。根据本发明的食品的类型没有特别限制。例如，其可以是强化食品、膳食补充剂、非酒精饮料、运动饮料、水果饮料、茶或牛奶类的饮料或液体食品的形式，但不限于此。根据本发明的药物组合物可以口服或肠胃外施用，并且可以是一般药物制剂的形式。具体的药物制剂包括用于口服给药的制剂，例如片剂、硬或软胶囊剂、溶液剂、悬浮剂等。这些制剂可以通过使用通常可接受的载体制备。例如，可以通过使用赋形剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂、增溶剂、悬浮剂、防腐剂、增量剂等来制备用于口服给药的制剂。含有本发明的石榴浓缩物作为活性成分的药物组合物的给药剂量可以由专业人员考虑各种因素来确定，例如生理条件、患者的年龄和性别、并发症的存在等。通常地，可以为成年人施用0.1-10mg，特别是10mg至1g每千克体重的剂量。单位剂量可以含有药物组合物的每日剂量或其1/2、1/3、1/4、1/5、1/6、1/7、1/8、1/9或1/10，并可以每天给药1-10次。对于长期摄取，给药剂量可以小于上述范围，并且由于活性成分完全没有安全问题，因此可以以更大的量使用。在一个示例性实施方式中，甚至在根据本发明的石榴浓缩物以10ml/天的剂量服用后，健康相关指数(例如红细胞(rbc)计数、血尿素氮(bun)水平、天冬氨酸转氨酶(ast)水平、丙氨酸氨基转移酶(alt)水平、肌酸水平、葡萄糖水平、sg水平等)维持在正常范围内。因此，可以安全地实现促进透明质酸合成和/或改善皮肤(包括保湿皮肤)的效果，而对身体没有副作用。有益效果根据本发明，通过使用石榴浓缩物可以预期促进透明质酸合成的效果。此外，可以预期优异的皮肤保湿效果的同时，还可预期改善皮肤皱纹、美白皮肤、减少角质化等的优异效果。附图说明图1显示了用于hacat细胞的石榴浓缩物的毒性试验结果。图2显示了通过测量透明质酸产量来评价石榴浓缩物的皮肤保湿效果的结果(*p<0.05、**p<0.01、***p<0.005)。图3显示了用于hdf-n细胞的石榴浓缩物的毒性试验结果。图4显示了melan-a细胞的石榴浓缩物的毒性试验结果。图5显示了通过测量前胶原合成来评价皱纹改善效果的结果(*p<0.05、**p<0.01、***p<0.005)。图6显示了通过测量mmp-1抑制来评价皱纹改善效果的结果(*p<0.05、**p<0.01、***p<0.005)。图7显示了通过测量弹性蛋白酶抑制来评价皱纹改善效果的结果(*p<0.05、**p<0.01、***p<0.005)。图8显示了通过分析酪氨酸酶抑制活性来评价皮肤美白效果的结果。图9显示了通过测量黑色素合成抑制来评价皮肤美白效果的结果。图10显示了通过黑色素合成抑制测定来观察黑素细胞的结果。图11显示了鱼尾纹随时间的视觉评估的结果。图12显示了摄取产品前后受试者的鱼尾纹的变化。图13显示了施用产品后皮肤的含水量随时间的变化。图14显示了施用产品后经表皮水分流失的变化。图15显示了施用产品后皮肤角质化随时间的变化。图16显示了施用产品后受试者的脸部和前臂的皮肤角质化的变化。图17显示了施用产品后鱼尾纹(复制品)随时间的变化。图18显示了摄取产品后受试者的鱼尾纹的变化。图19a-19d显示了施用产品后皮肤弹性参数随时间的变化。图20显示了施用产品后肤色亮度随时间的变化。图21显示了摄取产品后受试者的肤色亮度的变化。具体实施方式在下文中，将通过实施例详细描述本发明。然而，以下实施例仅用于说明目的，并且对于本领域普通技术人员显而易见的是，本发明的范围不受实施例的限制。<制备例>石榴浓缩物的制备实验例1：通过加热浓缩制备石榴浓缩物(1)12nk26的制备首先，除去杂质后洗涤1000kg土耳其石榴果实。通过切割果实，除去果皮并通过压榨除去种子，以获得450kg石榴果肉。过滤后，将石榴果肉在100-105℃下灭菌60秒，然后冷却至48-55℃。对于得到的每1000l石榴汁，用70-100ml果胶酶在48-55℃下处理1小时以降解淀粉。然后，为了保持浑浊和颜色、提供适于摄取的粘度等，向每1000l石榴汁加入900g膨润土，然后将混合物在48-55℃下搅拌10分钟。然后，通过1.5mm和1mm过滤器进行真空过滤，随后加热浓缩(顺序地，在70-85℃和400-550mbar下直到12brix(白利糖度)、在85-92℃和550-750mbar下直到17brix、在92-100℃和750-850mbar下直到31brix、60-80℃和250-350mbar下直到43brix、并然后在40-60℃和100-250mbar下直到65brix)，通过用0.15mm过滤器过滤来制备含有1.8-3.0mg/g鞣花酸和12.59mg/g多酚(通过没食子酸比色法测量)的石榴浓缩物。石榴浓缩物中的水果：浓缩物的重量比为10:1。该石榴浓缩物命名为样品12nk26。(2)12910910的制备首先，去除杂质后洗涤伊朗石榴果实。切下果实并去除果皮。然后，通过在160bar下压榨除去种子。在低温灭菌后，对于得到的每6000l石榴汁，用100-150g果胶酶在48-60℃下处理1小时以降解淀粉。然后，为了保持浊度和颜色，提供适于摄取的粘度等，向每6000l石榴汁加入1200-1800g明胶、6000g二氧化硅和14kg膨润土，将混合物在50-60℃下搅拌30分钟。然后，在真空过滤后，随后加热浓缩(顺序地，在55-90℃下(3分钟)、105-110℃下(90秒)和100-105℃下(90秒))，制得含有0.8-1.4mg/g鞣花酸和11.79mg/g多酚(通过没食子酸比色法测量)的石榴浓缩物。石榴浓缩物中的水果：浓缩物的重量比为5:1。该石榴浓缩物命名为样品12910910。比较例1：石榴汁(921217)的制备首先，除去杂质后洗涤1000kg土耳其石榴果实。通过切割果实，除去果皮并通过压榨除去种子，以获得450kg的石榴果肉。过滤后，将石榴果实在90-94℃下灭菌20秒，并然后冷却至15-20℃。作为结果，制备了含有0.2-0.32mg/g鞣花酸和0.7-1.55mg/g多酚(通过没食子酸比色法测量)的石榴汁。石榴浓缩物中的水果：浓缩物的重量比为2:1。该石榴汁命名为样品921217。<实施例2>石榴浓缩物的透明质酸合成促进效果的评价1、测试材料通过将样品12nk26、12910910和921217稀释至足以进行细胞培养的浓度来制备测试溶液。在通过wst-1测定进行初步实验后，在不显示细胞毒性的浓度下评价测试溶液的皮肤相关效应。阳性对照组用细胞培养基稀释。[表1]试剂和材料制造商目录号达尔伯克改良伊格尔培养基(dmem)welgenelm-001-0148孔板spl3004896孔板spl31096细胞增殖试剂wst-1roche1644-807dc蛋白测定试剂盒bio-rad500-0116氢氧化钠(naoh)welgeneml022-02n-乙酰基-d-葡萄糖胺sigmaa8625玻尿酸elisa试剂盒r&d系统dy36142、细胞系和培养将人角质形成细胞(hacat细胞，atcc)接种到培养皿的底部，并在添加含有青霉素(100iu/ml)、链霉素(10μg/ml)和10％fbs的达尔伯克改良伊格尔培养基(dmem，welgene，韩国)后在37℃下在5％二氧化碳培养箱中培养。3、细胞毒性测量测试溶液对hacat细胞的细胞毒性。将hacat细胞以5×104个细胞/孔接种在96孔板上，然后培养24小时。然后，在保持饥饿状态12小时后，加入测试溶液和新鲜培养基(不含补充剂)，并培养细胞24小时。24小时后，为了测量细胞存活能力，使用100μl用无补充培养基稀释至1/10的wst-1溶液处理每个孔。培养1小时后，在450nm下测量吸光度。作为结果，12nk26在低于0.5％的浓度下显示出80％以上的细胞存活能力，921217在低于1％的浓度下显示出80％或更高的细胞存活能力，以及12910910在低于0.5％的浓度下显示出80％或更高的细胞存活能力。[表2](n＝4)4、透明质酸合成的增加通过elisa测量角质形成细胞中的透明质酸合成的程度来评价样品的皮肤保湿效果。为此，将hacat细胞以5×104个细胞/孔接种在平板上，并培养24小时。24小时后，使用用dmem细胞培养基(不含补充物)稀释的试验样品处理细胞，并培养24小时。回收培养的细胞，通过透明质酸elisa(r&d系统，dy3614)测量透明质酸的量。用pbs洗涤粘附于底部的细胞，并用1nnaoh裂解以测定蛋白质的总量。然后，计算每给定量蛋白质的乙酰透明质酸的量。*蛋白质量的测量根据lowry方法使用bio-raddc蛋白试剂盒来测量蛋白质量。(1)将细胞裂解物(上清液)以5ml/孔加入96孔板中。(2)蛋白质标准品的制备将用细胞裂解缓冲液稀释至8种不同浓度的1.5mg/ml牛血清白蛋白(bsa，bio-rad，500-0007)以5ml/孔加入96孔板中。(3)将试剂盒中含有的试剂a和试剂s以40:1的比例混合并添加为25μl/孔。(4)试剂盒中包含的试剂b添加为200μl/孔。(5)在室温下培养15分钟后，在750nm下测量吸光度。(6)总蛋白量由bsa校准曲线计算。5、统计所有数据表示为平均值±sd。根据学生t检验(显著性概率p<0.005，双侧)进行统计分析。6、结果通过elisa评价样品12nk26,921217和129109103对透明质酸合成的影响。为此，使用透明质酸elisa试剂盒(r&d系统，dy3614)。作为结果，至于的12nk26，与对照组相比，在0.01％、0.05％和0.1％的浓度下，透明质酸测量为179.6％、214.4％和305.1％。透明质酸合成以浓度依赖性方式增加。在所有三个浓度下，透明质酸合成的增加是统计显著的。对于921217，与对照组相比，在0.01％、0.05％和0.1％的浓度下，透明质酸分别测量为84.0％、98.3％和106.2％，并且在三个浓度没有观察到统计显著性。对于12910910，与对照组相比，在0.01％、0.05％和0.1％的浓度下，透明质酸测量为162.4％、262.4％和298.2％。透明质酸合成以浓度依赖性方式增加。在所有三个浓度下，透明质酸合成的增加是统计显著的。对于用作阳性对照组的nag，与对照组相比，当用20mm处理时产生了224.8％的透明质酸，表明通过nag促进了hacat细胞的透明质酸生物合成(参见表3和图2)。[表3](n＝4)<实施例3>石榴浓缩物对皮肤的生理活性的影响的评价1、测试材料通过将如实施例1中所述制备的石榴浓缩物(样品12nk26)稀释至适于细胞培养的浓度来制备测试溶液。在通过wst-1测定进行初步实验后，在不显示细胞毒性的浓度下评价测试溶液的皮肤相关效应。阳性对照组用细胞培养基稀释。在该实施例中使用的其它测试材料如下。[表4]2、细胞系和培养为了测试皱纹改善，使用正常人原发性真皮成纤维细胞、来自人类新生儿包皮的初生(hdf-n)。将细胞接种在培养皿的底部并在添加含有0.1％胰岛素、0.1％rhfgf、0.1％庆大霉素和2％fbs的成纤维细胞基础培养基(fbm，lonza，cc-3131)后在37℃下在5％二氧化碳培养箱中进行培养。为了评价皮肤美白效果，使用来自由dorothycbenette博士(stgeorge'shospital，伦敦，英国)提供的c57bl/6j(黑色，a/a)小鼠的melan-a细胞作为永生化细胞系(bennettdc,cooperpj,hartir.alineofnon-tumorigenicmousemelanocyte,syngeneicwiththeb16melanomaandrequireatumorpromoterforgrowth.intjcancer1987；39:414-418)。在加入含有10％胎牛血清、50u/ml青霉素、50μg/ml链霉素、200nm佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯(pma)的rpmi1640培养基后，在37℃下在5％二氧化碳培养箱中进行培养细胞。3、细胞毒性测量测试溶液对hdf-n细胞和melan-a细胞的细胞毒性。将hdf-n细胞和melan-a细胞分别以6×103个细胞/孔和9×103细胞/孔接种在96孔板上，并然后培养24小时。然后，在保持饥饿状态12小时后，加入测试溶液和新鲜培养基(不含补充物或fbs)，并培养细胞24小时。24小时后，为了测量细胞存活能力，使用100μl用无补充培养基稀释至1/10的wst-1溶液处理每个孔。培养1小时后，在450nm下测量吸光度。作为结果，对于hdf-n细胞(表5)，石榴浓缩物样品在低于0.1％的浓度下显示出80％以上的细胞存活能力，而对于melan-a细胞(表6)，在低于0.05％的浓度下显示出80％以上的细胞存活能力。[表5](n＝5)[表6](n＝5)4、皱纹改善效果4-1、增加前胶原为了测量促进试验溶液的前胶原合成的效果，将hdf-n细胞以1×104个细胞/孔接种在48孔板上，并然后培养24小时。然后，在保持饥饿状态24小时后，使用用不同浓度的细胞培养基fbm(不含补充物)稀释的试验溶液处理细胞，并然后培养24小时。回收培养的细胞，并使用前胶原i型c肽(pip)eia试剂盒(takara，mk101)测量前胶原的量。用pbs洗涤粘附于底部的细胞，并用1nnaoh裂解以测定蛋白质的总量。然后，计算每给定量蛋白质的前胶原的量。作为结果，与对照组相比，用10ng/mltgf-β处理的阳性对照组显示出150.8％的前胶原产量。这表明hdf-n细胞的前胶原生物合成由tgf-β促进。同时，当细胞用浓度为0.01％、0.05％和0.1％的样品处理时，前胶原产量分别为96.3％、53.3％和53.0％，并且没有观察到与对照组的统计显著差异(表7)。[表7](n＝4)4-2、uv诱导的mmp-1表达的抑制评价试验溶液对uv诱导的mmp-1表达的影响，以通过免疫elisa测定法测量基质金属蛋白酶(mmp-1)的活性来评价样品的皱纹改善效果。将hdf-n细胞以2×104个细胞/孔接种在24孔板上，并然后培养24小时。24小时后，丢弃培养基并用dpbs洗涤后，加入200μldpbs，并照射5j/cm2的uv-a。用稀释到足够浓度的样品处理细胞后，将细胞培养24小时。然后，取培养基并用人类总mmp-1elisa试剂盒(r&d系统，dy901)测量mmp-1的量。用总蛋白质量校准测量的mmp-1的量。作为结果，与未照射组相比，uva照射组产生240.2％的mmp-1，这表明在hdf-n细胞中通过5j/cm2uva诱导mmp-1表达。同时，当用浓度为0.001％、0.005％和0.01％的石榴浓缩物处理hdf-n细胞时，用人类总mmp-1elisa试剂盒(r&d系统，dy901)测量的mmp-1产量分别为137.1％、69.3％和7.1％，与uva未照射组相比为1。也就是说，与uv照射组相比，mmp-1产量以浓度依赖性方式降低，并且该降低具有统计显著性。此外，用作阳性对照组的视黄酸与未照射uva的组相比显示出171.6％的mmp-1产量，与uv照射组相比，其具有统计显著的降低。[表8](n＝4)4-3、弹性蛋白酶抑制测定hdf-n成纤维细胞用于测量测试溶液对弹性蛋白酶活性的影响。为此，将培养的hdf-n细胞用含有0.1％tritonx-100的0.2mtris-hcl(ph8.0)处理，并通过超声处理裂解。在3000rpm下离心20分钟并取上清液后，通过定量酶和总蛋白质量来测量酶的活性。为了测量弹性蛋白酶活性，将匀浆的成纤维细胞用200μg/ml弹性蛋白酶、0.2mtris-hcl缓冲液和不同浓度的样品处理。加入50mmstana、弹性蛋白酶特异性底物，并在37℃下培养，在405nm下测量吸光度。将弹性蛋白酶活性抑制程度与未用测试溶液处理的对照组进行比较。使用磷酰胺作为阳性对照组。当用浓度为0.05％、0.1％和1％的石榴浓缩物处理后在405nm下测量吸光度时，与对照组相比，弹性蛋白酶活性分别测量为92.3％、89.5％和63.6％，其以浓度依赖性方式显示降低趋势。特别地，在所有三个浓度下都观察到与对照组相比统计显著的降低。对于用作阳性对照组的磷酰胺，与对照组相比，弹性蛋白酶活性测量为74.9％。该降低是统计显著的。[表9](n＝3)5、皮肤美白效果5-1、酪氨酸酶抑制测定通过用乙醇或合适的溶剂将测试溶液稀释至足够的浓度来制备用于测量酪氨酸酶活性的样品溶液。向试管中依次加入220μl的0.1m磷酸缓冲液、20μl的样品溶液和20μl的蘑菇酪氨酸酶溶液(1500-2000u/ml)，向所得溶液中加入40μl的1.5mm酪氨酸溶液。在37℃下培养10-15分钟后，使用elisa读数器在490nm下测量吸光度。作为空白溶液，加入0.1m磷酸盐缓冲液(ph6.5)代替样品溶液。使用合适的程序计算当活性被抑制50％时的样品浓度(ic50)。石榴浓缩物在低于0.1％的浓度下不能抑制酪氨酸酶活性。相比之下，用作阳性对照组的曲酸的ic50值测量为3.634ppm。[表10](n＝3)样品石榴浓缩物曲酸ic50值3.634ppm5-2、黑色素合成的抑制将melan-a细胞以3×104个细胞/孔接种在24孔板上。在培养箱中培养细胞24小时以使细胞与平板良好粘附后，将用培养基稀释至不同浓度的试验溶液加入各孔中。试验样品在3天内处理一次，共6天。用光学显微镜(明场显微镜)观察细胞中的黑色素。将细胞用1nnaoh裂解，并然后离心。分离上清液后，通过测量405nm下的吸光度来定量蛋白质的总量。从蛋白质量测定黑色素含量。作为结果，与未处理的对照组相比，当试验溶液的浓度分别为0.005％、0.01％和0.05％时，黑色素含量测量为95.4％、86.3％和67.1％。也就是说，黑色素合成以浓度依赖性方式降低，并且降低是统计显著的。当将100μm熊果苷作为阳性对照组处理时，黑色素合成以浓度依赖性方式被抑制。[表11](n＝4)6、统计所有数据表示为平均值±sd。根据学生t检验(显著性概率p<0.005，双侧)进行统计分析。<实施例4>石榴浓缩物对皮肤的生理活性的影响的临床评价<实施例4-1>试验方法1.招聘受试者测试了62名年龄在25至60岁之间的干燥皮肤、鱼尾纹和色素沉着的女性受试者。随机给予所选受试者含有根据实施例1中描述的方法(试验产品)制备的石榴浓缩物(样品12nk26)的饮料或不含石榴浓缩物(对照产品)的饮料，并要求每天服用一小袋(50ml/袋)以持续8周(双盲试验)。在摄取试验产品之前和在持续摄取4周和8周后，根据目视评价皮肤含水量、皮肤角质化、tewl、鱼尾纹(复制品)、皮肤弹性、皮肤颜色亮度(l*值)、问卷、安全性、饮食和体重(包括bmi)来评价皮肤改善效果。此外，在摄取试验产品前和持续摄取8周后进行血液试验。在含有石榴浓缩物(样品12nk26)的饮料(测试产品)和不含石榴浓缩物的饮料(对照产品)及其内容物中包含的成分如下。2、测量和评价通过块随机化将受试者分为对照产品组和测试产品组，选择面部和左或右前臂作为测试部位。对于面部，在面颊上的眼角与鼻尖(含水量、角质化、tewl、弹性和肤色)、色素区域(皮肤颜色)和鱼尾纹(皱纹)相交的位置进行测量。对于内前臂，在远离肘部5cm的部分进行测量。在受试者参与视觉评估、仪器测量(皮肤的含水量、角质化、经表皮失水、皮肤弹性、皮肤颜色和鱼尾纹)、调查、体重(bmi)测量、饮食调查和安全性评价之前，要求他们在保持恒定温度(22±2℃)和湿度(50±5％)的空间中清洗脸部和休息30分钟，并且没有空气运动和直接阳光。3、视觉评估根据韩国食品药品安全部功能化妆品ii效力评价指南(2005年7月)的视觉评价标准，在0级和9级之间评价2名受试者的鱼尾纹的程度。在fl模式下使用visia面部成像系统(canfieldimagingsystem，美国)对眼角处的皱纹成像。[表12]等级描述等级描述0无皮肤皱纹和皮肤细纹5浅皱纹明显，但没有深皱纹1皮肤细纹开始出现6浅皱纹开始转变为深皱纹2皮肤细纹略微形成7深皱纹略微形成3许多细纹和浅皱纹开始出现8许多深皱纹4浅皱纹略微形成9许多很深的皱纹4、仪器测量在摄取产品前以及在持续摄取4周和8周后，在受试者的左脸或右脸上测量皮肤的含水量、经表皮水分流失、角质化、皮肤弹性和皮肤颜色。此外，测量左或右鱼尾纹。(1)使用cm825测量皮肤的含水量cm825(courage+khazakagmbh，德国)根据电容测量皮肤角质层下方30-40μm的含水量。当从探针供应电流时，由于包含在皮肤中的水而导致皮肤的电导率以任意单位(au)显示。当皮肤的含水量较大时，测量值较高。为了精确测量，对每个测试部位(脸颊、内前臂)进行3次测量，并分析它们的平均值。(2)使用测量经表皮水分流失经表皮水分损失(tewl)是指从皮肤中失去的水分，并与保湿功能密切相关。因为tewl值随着干燥恶化而增加，所以皮肤水合可以通过测量tewl来评估。(delfin，芬兰)使用温度和湿度传感器测量每单位面积的水蒸发量(g/m2h)。测量和分析在不同时间的测试部位(脸颊、内前臂)的水蒸发。(3)使用测量皮肤角质化通过使用黑色带从试验部位(脸颊、内前臂)取样角质物质来测量角质化，角质化是皮肤水合的另一种量度。通过使用d500盘涂敷器施加225g/cm2的压力约5秒，并然后剥离胶带，以将胶带粘附在皮肤上获得样品。将获得的角质物质样品用charmview(moritex，日本)以700×放大率成像，并使用plus程序分析该面积。(4)使用vl-650测量乌鸦脚(复制品)vl650(courage+khazakagmbh，德国)是测量制备的复制品中皱纹的深度、长度等的仪器。在将复制品安装在配置成使得特殊光通过的标准盒上之后，使用ccd照相机获得阴影图像，并分析最大皱纹深度(最厚皱纹的深度)。(5)使用测量皮肤弹性使用mpat580(courage+khazaka，德国)测量皮肤弹性。最常用的方法使用负压并且具有高度可重复性。通过cutometer测量的值在0和1(mm，比率)之间。对于每次测量，在测试部位(前脸颊)进行3次测量，并且分析参数(r0-r9)的平均值。弹性参数解释如下。[表13]参数描述r0第一条曲线的最高点(皮肤硬度)。r1第一条曲线的最低点(恢复到皮肤原始状态的能力)。r2毛弹性(值越接近1，皮肤弹性越大)。r3最后一条曲线的最高点(疲劳效果)。r4最后一条曲线的最低点(疲劳效果)。r5净弹性(值越接近1，皮肤弹性越大)。r6曲线的粘弹性部分r7曲线的生物弹性r8第一条曲线的ua值(ua和uf越接近，恢复到皮肤原始状态的能力越强)。r9反复吸吮皮肤后皮肤的疲劳效果-r0越高，皮肤越柔软，r0越低，硬度越大。-r2、r5、r7和r8越接近1，皮肤弹性越大。-r1、r3、r4、r6和r9越小，皮肤弹性越大。(6)使用cm-700d测量皮肤颜色cm-700d通过测量光谱反射率来测量三刺激值，并计算cielab颜色系统的l*、a*和b*值。在l*a*b*颜色系统中，亮度由l*表示，颜色和色度由a*和b*表示。a*和b*表示颜色方向。a*表示红色方向，-a*表示绿色方向，b*表示黄色方向，-b*表示蓝色方向。由于l*、a*和b*值接近0并且在相反情况下显示高色度，因此颜色变得无色。对每个测试部位(前脸颊、色素区域)进行3次测量，并且将肤色亮度(l*值)平均。5、血液分析在摄取试验产品前和摄取8周后检查受试者的血液。发现试验产品不影响代谢。6、饮食调查和体重测量为了研究受试者的饮食习惯的变化是否影响测试结果，在摄取测试产品前测量体重，并且在持续摄取4周和8周后测量体重，并进行饮食调查以检查在测试期间受试者的饮食习惯是否如常保持。要求受试者自我报告给定的饮食调查问卷。-饮食：(无：0、小：1、中等：2、很多：3)7、调查基于受试者回答的问卷，在摄取试验产品前和持续摄取4周和8周后评价试验产品的功效和摄取满意度。8、安全评估在摄取试验产品之前和在持续摄取4周和8周后检查受试者的皮肤状况。此外，通过对受试者进行访谈来评价产品的皮肤状况、全身状况和刺激。9、数据分析在摄取试验产品前和在持续摄取4周和8周后计算仪器测量值的平均值和标准偏差(s.d)，并且统计分析测量时间和组之间的测量值的差异。通过配对t检验进行测量时间的比较(p<0.05)，并且通过独立t检验进行组之间的比较(p<0.05)。程序用于统计分析，并根据频率分析调查结果。<实施例4-2>试验结果1、目视评估与摄取试验产品前(p<0.05)相比，在持续摄取产品(产品b)8周后，鱼尾纹减少(改善)，具有统计显著性(表14，图11-12)。[表14](n＝62)值：配对t检验(*p<0.05、**p<0.01、***p<0.001，与摄取产品前相比显著不同)°变化：(wx-w0)/w0×100，通过平均值计算2、皮肤含水量在持续摄取产品4周和8周后时，与具有统计显著性的对照组(产品a)相比，对于测试组(产品b)，面部和前臂两者的皮肤含水量都增加(改善)(p<0.05)(表15，图13)。[表15](n＝62)值：独立t检验(*p<0.05、**p<0.01、***p<0.001，两组之间存在显著不同)3、经表皮失水量(tewl)在持续摄取产品4周和8周后，与具有统计显著性的产品a(对照组)相比，产品b(测试组)在前臂上的tewl降低(改善)(p<0.05)(表16，图14)。[表16](n＝62)值：独立t检验(*p<0.05、**p<0.01、***p<0.001，两组之间存在显著不同)4、皮肤角质化与摄取产品前相比，在持续摄取产品4周后的面部以及在持续摄取产品8周后的面部和前臂的皮肤角质化减少(改善)，具有统计显著性(p<0.05)。在持续摄取产品8周后，产品a(对照组)的面部皮肤角化减少1.84％，产品b(试验组)的面部角质化减少6.12％。在前臂上，产物a减少0.37％，产物b减少4.09％(p<0.05)(表17)。[表17](n＝62)值：配对t检验(*p<0.05、**p<0.01、***p<0.001，与摄取产品前相比显著不同)°变化：(wx-w0)/w0×100，通过平均值计算在持续摄取产品8周后，与产品a相比，产品b具有统计显著性，脸部和前臂两者的皮肤角化减少(改善)(p<0.05)(表18，图15-16)。[表18](n＝62)值：独立t检验(*p<0.05、**p<0.01、***p<0.001，两组之间存在显著不同)5、鱼尾纹(复制品)与摄取产品前相比，在持续摄取产品b(试验组)8周后，最大皱纹深度显着降低(改善)(p<0.05)(表19，图18)。[表19](n＝62)值：配对t检验(*p<0.05、**p<0.01、***p<0.001，与摄取产品前相比显著不同)°变化：(wx-w0)/w0×100，通过平均值计算6、皮肤弹性在持续摄取产品8周后，与产品a(对照组)相比，产品b(测试组)的r1(恢复到原始状态的能力)和r4(最后一条曲线的最低点)降低(改善)，具有统计显著性，以及r5(净弹性)和r7(生物弹性)显著增加(改善)。此外，在持续摄取产品4周和8周后，与产品a相比，产品b的r2(毛弹性)增加(改善)，具有统计显著性(p<0.05)(表20，图19a-19d)。[表20](n＝62)值：独立t检验(*p<0.05、**p<0.01、***p<0.001，两组之间存在显著不同)7、肤色亮度与产品a(对照组)相比，产品b(试验组)在持续摄取产品4周后的面颊以及在持续摄取产品8周后的面颊和色素区域的皮肤颜色亮度增加(改善)，具有统计显著性(p<0.05)(表21，图20-21)。[表21](n＝62)值：独立t检验(*p<0.05、**p<0.01、***p<0.001，两组之间存在显著不同)8、血液分析两组之间在任何参数中没有观察到统计显著性差异(p<0.05)(表22)。[表22](n＝62)值：独立t检验(*p<0.05、**p<0.01、***p<0.001，两组之间存在显著不同)9、饮食调查和体重测量在饮食调查、体重和bmi方面，在摄取产品前和持续摄取产品4周和8周后，产品a和产品b两组之间没有显著差异(p<0.05)(表23)。[表23](n＝62)值：配对t检验(*p<0.05、**p<0.01、***p<0.001，与摄取产品前相比显著不同)10、调查根据受试者在摄取试验产品前和在持续摄取4周和8周后回答的问卷，评价对测试产品的功效的满意度。结果如下(表24)。[表24](n＝62)等级：0、无变化，1、不显著的、未察觉的变化，2、轻微察觉的改善，3、察觉的改善，4、明显的改善-正面反应为2-4的受试者数量(％)等级：1、从不，2、不太可能，3、可能，4、是的，5、绝对-正面反应为4-6的受试者数量(％)11、安全评价在整个试验期间，在皮肤病学或全身症状中，在任何受试者中没有观察到异常反应(表25)。[表25](n＝62)当前第1页12