含有白扁豆提取物作为有效成分的用于预防或改善非酒精性脂肪肝疾病的组合物的制作方法

本发明涉及一种含有白扁豆(dolichoslablablinne)提取物作为有效成分的用于预防或改善非酒精性脂肪肝疾病的健康功能食品组合物及药物组合物。

背景技术：

韩国的肝疾病死亡率非常高，每10万名人口为23.5名，在40岁年龄段中占死亡原因的首位(41.1名/10万名)，在50岁年龄段中占死亡原因的第二位(72.4名/10万名)，在30岁年龄段中占死亡原因的第三位(10名/10万名)，肝疾病为韩国中年人口的主要死亡原因。

在所述肝疾病中，脂肪肝是指不存在于正常细胞内的中性脂肪非正常性地沉积在肝细胞内而显示出的现象。正常肝的约5％是由脂肪组织构成，中性脂肪、脂肪酸、磷脂、胆固醇及胆固醇酯为脂肪的主要成分，但一旦发生脂肪肝时，大部分的成分会被中性脂肪所替代，如果中性脂肪的量达到肝重量的5％以上，则被诊断为脂肪肝。脂肪肝恶化而导致肝细胞内的脂肪块变大，则包括核在内的细胞的重要组成成分会被推向一边，从而导致肝细胞的功能降低，并因细胞内蓄积的脂肪而膨胀的肝细胞会压迫肝细胞之间的微细血管和淋巴腺，从而使肝内的血液和淋巴液的循环产生障碍。在这样的情况下，肝细胞无法得到适当的氧气供给和营养供给，从而会导致肝功能降低。

非酒精性脂肪肝疾病(non-alcoholicfattyliverdisease，nafld)并不是酒精所导致的肝损伤，而是指脂肪酸以中性脂肪的形态在肝的实质细胞内蓄积5％以上的情况。在病理学上分类为单纯性脂肪肝(simplesteatosis)和伴随炎症的脂肪肝炎(steatohepatitis)，在长时间未进行治疗的情况下，会转移为肝炎、肝纤维、肝硬化等严重的肝疾病。在韩国，因生活方式的变化，非酒精性肝疾病的发生频率也呈增加的趋势。

另外，白扁豆(dolichoslablablinne)也被称为藊豆、白藊豆或鹊豆，叶子为三出复叶，互生，托叶小，呈三角状卵形，小叶片为宽卵形，叶尖，在茎附近的叶子为宽的楔子形或块状，边缘平直，两面长有稀疏的绒毛。花为蝶形，白色，种子为2～5个，也呈白色。

白扁豆自古以来作为民间疗法具有健胃化湿、和中消暑的功效，在韩国授权专利第0316269号公开了白扁豆叶的甲醇提取物具有增加生理活性的功效，韩国授权专利第0929979号中公开了含有白扁豆的中药组合物具有能够减少因抗癌剂的施用而诱导的肝脏和肾脏的毒性的功效，但并没有关于对非酒精性脂肪肝的功效研究方面的报道。

技术实现要素：

要解决的技术问题

本发明是基于上述要求而提出的，通过确认在使用本发明的有效成分白扁豆提取物进行处理的肝细胞中，中性脂肪的含量有效地得到减少，从而完成了本发明。

技术方案

为了实现上述目的，本发明提供一种含有白扁豆(dolichoslablablinne)提取物作为有效成分的用于预防或改善非酒精性脂肪肝疾病的健康功能食品组合物。

此外，本发明提供一种含有白扁豆(dolichoslablablinne)提取物作为有效成分的用于预防或治疗非酒精性脂肪肝疾病的药物组合物。

此外，本发明提供一种含有白扁豆(dolichoslablablinne)提取物作为有效成分的用于降低因高脂肪食物而增加的体重或血糖的组合物。

此外，本发明提供一种非酒精性脂肪肝疾病的预防或治疗方法，其包括将白扁豆(dolichoslablablinne)提取物对个体进行施用的步骤。

此外，本发明提供一种含有白扁豆(dolichoslablablinne)提取物作为有效成分的用于预防或治疗人之外的动物的脂肪肝疾病的兽医学组合物。

此外，本发明提供一种含有白扁豆(dolichoslablablinne)提取物作为有效成分的用于预防或改善动物的脂肪肝疾病的饲料添加剂。

发明的效果

本发明涉及一种含有白扁豆提取物作为有效成分的用于预防或改善非酒精性脂肪肝疾病的健康功能食品组合物，本发明的组合物能够抑制中性脂肪的蓄积，从而能够在用于预防或改善非酒精性脂肪肝疾病的健康功能性食品及医药品中有效使用。

附图说明

图1为用不同浓度(0.125mm、0.25mm、0.5mm及1.0mm)的游离脂肪酸对肝癌细胞系(hepg2)进行处理后，对中性脂肪的含量进行测定的结果，其中所述游离脂肪酸是以2:1的浓度比混合油酸酯及棕榈酸酯的。(a)为用尼罗红(adipored)染色后对中性脂肪的含量进行确认的结果，(b)为用油红o染色后得到的中性脂肪图像的结果。对照区是用未包含游离脂肪酸的5％(w/v)的bsa溶液处理的。

图2为在肝癌细胞系(hepg2)中对用1mm的游离脂肪酸处理而生成的中性脂肪因阳性对照组18β-甘草次酸(18beta-glycyrrhetinicacid)而减少的程度进行确认的结果，是在尼罗红染色后对中性脂肪的含量进行确认的图。对照区是用未包含游离脂肪酸的5％(w/v)的bsa溶液处理的。

图3为在肝癌细胞系(hepg2)中对用1mm的游离脂肪酸处理而生成的中性脂肪因阳性对照组18β-甘草次酸(18beta-glycyrrhetinicacid)而减少的程度进行确认的结果，是在油红o染色后得到的中性脂肪图像的结果。对照区是用未包含游离脂肪酸的5％(w/v)的bsa溶液处理的。

图4为在肝癌细胞系(hepg2)中对用1mm的游离脂肪酸处理而生成的中性脂肪因白扁豆热水提取物而减少的程度进行确认的尼罗红染色试验结果。对照区是用未包含游离脂肪酸的5％(w/v)的bsa溶液处理的。

图5为在肝癌细胞系(hepg2)中对用1mm的游离脂肪酸处理而生成的中性脂肪因白扁豆热水提取物而减少的程度进行确认的油红o染色试验中所获得的中性脂肪的图像。对照区是用未包含游离脂肪酸的5％(w/v)的bsa溶液处理的。

图6为在肝癌细胞系(hepg2)中对用1mm的游离脂肪酸处理而生成的中性脂肪因白扁豆乙醇提取物而减少的程度进行确认的尼罗红染色试验结果。对照区是用未包含游离脂肪酸的5％(w/v)的bsa溶液处理的。

图7为在肝癌细胞系(hepg2)中对用1mm的游离脂肪酸处理而生成的中性脂肪因白扁豆乙醇提取物而减少的程度进行确认的油红o染色试验中所获得的中性脂肪的图像。对照区是用未包含游离脂肪酸的5％(w/v)的bsa溶液处理的。

图8为本发明一实施例中为了确认白扁豆热水提取物的细胞毒性而实施的mts试验结果。对照区是用未包含游离脂肪酸的5％(w/v)的bsa溶液处理的。

图9为本发明一实施例中对白扁豆热水提取物和作为对照组的大豆提取物、黑豆提取物、绿豆提取物及豌豆提取物的减少中性脂肪的含量的程度进行比较的尼罗红染色试验结果。对照区是用未包含游离脂肪酸的5％(w/v)的bsa溶液处理的，是将用1mm的游离脂肪酸进行处理时的中性脂肪的含量作为100％并以此为基准来显示相对值的。

图10为本发明一实施例中白扁豆热水提取物对因高脂肪食物而导致的小鼠的体重增加(a)及肝组织重量的增加(b)带来的影响的确认结果。con为正常对照组，hfd为因摄入高脂肪食物而诱发脂肪肝的高脂肪食物组，hfd+dll-ex为同时摄取高脂肪食物和25、50、100(mg/kg/天)的白扁豆热水提取物的实验组。(a)中的*和**表示与高脂肪食物组(hfd)相比，摄取高脂肪食物和白扁豆热水提取物的组的体重显著减少，(b)中的##表示与正常组(con)相比，高脂肪食物组(hfd)的肝组织重量有意义地增加(p<0.01)，*和**表示与高脂肪食物组(hfd)相比，同时摄取高脂肪食物和白扁豆热水提取物的实验组(hfd+dll-ex)的肝组织重量有意义地减少。m100是阳性对照组，是同时施用高脂肪食物和水飞蓟(milkthistle)提取物(100mg/kg/天)的组。

图11为本发明的一实施例中25、50、100(mg/kg/天)的白扁豆热水提取物对因高脂肪食物而导致的小鼠的总脂肪(a)、腹部皮下脂肪(b)、附睾脂肪组织(c)及小肠脂肪组织(d)的重量带来的影响的确认结果。##表示与正常组(con)相比，高脂肪食物组(hfd)的总脂肪(a)、腹部皮下脂肪(b)、附睾脂肪组织(c)及小肠脂肪组织(d)的重量有意义地增加(p<0.01)，*和**表示与高脂肪食物组(hfd)相比，同时摄取高脂肪食物和白扁豆热水提取物的实验组(hfd+dll-ex)的总脂肪(a)、腹部皮下脂肪(b)、附睾脂肪组织(c)及小肠脂肪组织(d)的重量有意义地减少。m100是阳性对照组，是同时施用高脂肪食物和水飞蓟提取物(100mg/kg/天)的组。

图12为本发明的一实施例中对25、50、100(mg/kg/天)的白扁豆热水提取物是否能减少因高脂肪食物而导致的血液内丙氨酸氨基转移酶(alt)和天冬氨酸氨基转移酶(ast)的增加进行确认的结果。##表示与正常组(con)相比，高脂肪食物组(hfd)的alt(a)和ast(b)有意义地增加(p<0.01)，*和**表示与高脂肪食物组(hfd)相比，同时摄取高脂肪食物和白扁豆热水提取物的实验组(hfd+dll-ex)的alt(a)和ast(b)有意义地减少。m100是阳性对照组，是同时施用高脂肪食物和水飞蓟提取物(100mg/kg/天)的组。

图13为本发明的一实施例中对25、50、100(mg/kg/天)的白扁豆热水提取物是否能降低因高脂肪食物而导致的血液内的中性脂肪(a)、总胆固醇(b)、低密度脂蛋白(c)及游离脂肪酸(d)的增加进行确认的结果。##表示与正常组(con)相比，高脂肪食物组(hfd)的血液内的中性脂肪(a)、总胆固醇(b)、低密度脂蛋白(c)及游离脂肪酸(d)有意义地增加(p<0.01)，*和**表示与高脂肪食物组(hfd)相比，同时摄取高脂肪食物和白扁豆热水提取物的实验组(hfd+dll-ex)的血液内的中性脂肪(a)、总胆固醇(b)、低密度脂蛋白(c)及游离脂肪酸(d)有意义地减少。m100是阳性对照组，是同时施用高脂肪食物和水飞蓟提取物(100mg/kg/天)的组。

图14为本发明的一实施例中对25、50、100(mg/kg/天)的白扁豆热水提取物是否能降低因高脂肪食物而导致的空腹血糖的增加进行确认的结果。##表示与正常组(con)相比，高脂肪食物组(hfd)的空腹血糖有意义地增加(p<0.01)，*和**表示与高脂肪食物组(hfd)相比，同时摄取高脂肪食物和白扁豆热水提取物的实验组(hfd+dll-ex)的空腹血糖有意义地减少。m100是阳性对照组，是同时施用高脂肪食物和水飞蓟提取物(100mg/kg/天)的组。

具体实施方式

本发明涉及一种含有白扁豆提取物作为有效成分的用于预防或改善非酒精性脂肪肝疾病的健康功能食品组合物。

所述白扁豆提取物可以采用本领域公知的通常的提取溶剂。作为优选的提取溶剂，可以使用水、碳原子数为1～4的无水或含水低级醇(例如甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、正丙醇、异丙醇及正丁醇等)、所述低级醇和水的混合溶剂、丙酮、乙酸乙酯、氯仿、1,3-丁二醇、己烷、二乙醚或乙酸丁酯，进一步优选为水或乙醇，再进一步优选为水。

在利用所述水进行热水提取时，加入相对于白扁豆重量为5～10倍体积的水，在90～110℃下加热2～3小时进行提取。优选地，将提取溶液用滤纸进行过滤后进行冷冻干燥来使用，但并不限定于此。

此外，利用乙醇进行提取时，加入相对于白扁豆重量为5～10倍体积的80％的乙醇，在20～25℃的常温下浸渍22～24小时进行提取。优选地，将提取溶液用滤纸进行过滤后进行冷冻干燥来使用，但并不限定于此。

所述白扁豆提取物的特征在于减少肝组织的中性脂肪的含量，所述非酒精性脂肪肝疾病的特征在于选自非酒精性单纯性脂肪肝、非酒精性脂肪肝炎及非酒精性肝硬化中的任一种，但并不限定于此。

相对于组合物总重量，所述白扁豆提取物优选为0.1～10重量％，但并不限定于此，可以将所述本发明的组合物添加到以预防或改善非酒精性脂肪肝疾病为目的的食品中来制备健康功能性食品，所述健康功能性食品并不特别地限定于此，可以是健康功能性食品、营养补充剂、营养剂、医药食品(pharmafood)、健康食品、营养食品(nutraceutical)、设计食品(designerfood)、食品添加剂等所有形态的食品，优选可以为包括肉类、香肠、面包、巧克力、糖果类、点心类、饼干类、比萨饼、拉面、其它面类、口香糖类、冰淇淋类的乳制品，各种汤、饮料、茶、功能饮料、酒精饮料及维生素复合剂等。此时，添加的方法可以适当地使用通常的方法，并可以根据使用目的(预防、健康或治疗性处置)来适当地决定添加量。

所述本发明的组合物还可以进一步包含除了有效成分之外的多种成分，对这些多种成分没有特别的限制，优选可以为各种营养剂、维生素、电解质、风味剂、着色剂、果胶酸及其盐、海藻酸及其盐、有机酸、保护胶体增稠剂、ph调节剂、稳定剂、防腐剂、甘油、酒精、碳酸饮料中使用的碳酸化剂等。此外，为了赋予适口性及/或功能性，可以含有用于制备天然果汁、果汁饮料及蔬菜饮料的果肉，这些成分可以单独或组合使用。

此外，本发明涉及一种含有白扁豆提取物作为有效成分的用于预防或治疗非酒精性脂肪肝疾病的药物组合物。

所述白扁豆提取物可以采用本领域公知的通常的提取溶剂。作为优选的提取溶剂，可以使用水、碳原子数为1～4的无水或含水低级醇(例如甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、正丙醇、异丙醇及正丁醇等)、所述低级醇和水的混合溶剂、丙酮、乙酸乙酯、氯仿、1,3-丁二醇、己烷、二乙醚或乙酸丁酯，进一步优选为水或乙醇，再进一步优选为水。

在利用所述水进行热水提取时，加入相对于白扁豆重量为5～10倍体积的水，在90～110℃下加热2～3小时进行提取。优选地，将提取溶液用滤纸进行过滤后进行冷冻干燥来使用，但并不限定于此。

此外，利用乙醇进行提取时，加入相对于白扁豆重量为5～10倍体积的80％的乙醇，在20～25℃的常温下浸渍22～24小时进行提取。优选地，将提取溶液用滤纸进行过滤后进行冷冻干燥来使用，但并不限定于此。

所述白扁豆提取物的特征在于减少肝组织的中性脂肪的含量，所述非酒精性脂肪肝疾病的特征在于选自非酒精性单纯性脂肪肝、非酒精性脂肪肝炎及非酒精性肝硬化中的任一种，但并不限定于此。

本发明的药物组合物可以含有药学上可接受的载体。本发明的药物组合物中包含的药学上可接受的载体是在制剂时通常使用的载体，包括盐水、灭菌水、林格氏溶液、缓冲盐水、葡萄糖溶液、麦芽糖糊精溶液、甘油、乙醇、乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯树胶、磷酸钙、褐藻胶、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、糖浆、甲基纤维素、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁及矿物油等，但并不限定于此。

本发明的药物组合物中，除了所述成分之外，还可以进一步包含抗氧化剂、缓冲液、抑菌剂、稀释剂、表面活性剂、粘合剂、润滑剂、润湿剂、甜味剂、香味剂、乳化剂、悬浮剂及保存剂等。

本发明的药物组合物可以为口服或非口服施用，优选为口服施用方式。本发明的药物组合物的适合的施用量可以根据制剂化方法、施用方式、患者的年龄、体重、性别、疾病状态、饮食、施用时间、施用途径、排泄速度及反应感应性等因素进行不同的处置。优选地，本发明的药物组合物的施用量是以成人为基准为0.001～100mg/kg。

本发明的药物组合物可以根据本领域技术人员容易实施的方法，并利用药学上可接受的载体及/或赋形剂来进行制剂化，从而制备成单位用量形态或加入到大容量容器中来制备。此时，剂型可以为油或水性介质中的溶液、悬浮液、糖浆剂或乳化液形态，或者是浸膏剂、散剂、粉末剂、颗粒剂、片剂或胶囊剂形态，还可以进一步包含分散剂或稳定剂。

此外，本发明涉及一种含有白扁豆(dolichoslablablinne)提取物作为有效成分的用于降低因高脂肪食物而增加的体重或血糖的组合物。

此外，本发明涉及一种非酒精性脂肪肝疾病的预防或治疗方法，其包括将白扁豆(dolichoslablablinne)提取物对个体进行施用的步骤。

所述个体包括患有非酒精性脂肪肝疾病的患者，还包括具有患非酒精性脂肪肝疾病可能性的人在内的所有动物。

此外，本发明涉及一种含有白扁豆(dolichoslablablinne)提取物作为有效成分的用于预防或治疗人之外的动物的脂肪肝疾病的兽医学组合物。

本发明的含有白扁豆(dolichoslablablinne)提取物的兽医学组合物可以进一步包含根据常规方法的适当的赋形剂及稀释剂。可以包含在本发明的含有白扁豆(dolichoslablablinne)提取物的兽医学组合物中的赋形剂及稀释剂的例子有乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、木糖醇、赤藓糖醇、麦芽糖醇、淀粉、阿拉伯树胶、褐藻胶、明胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁、十六烷醇、十八烷醇、液态石蜡、山梨醇酐单硬脂酸酯、聚山梨醇酯60、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯及矿物油。

本发明的含有白扁豆(dolichoslablablinne)提取物的兽医学组合物可以进一步包含填充剂、抗凝剂、润滑剂、润湿剂、香料、乳化剂、防腐剂等，本发明的兽医学组合物可以采用本领域公知的方法进行剂型化，使得在对动物施用后能够提供活性成分的迅速、持续或缓慢的释放，剂型可以为散剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂、悬浮液、乳液、溶液、糖浆、气溶胶、软质或硬质明胶胶囊、栓剂、灭菌注射溶液、灭菌外用剂等形态。

本发明的兽医学组合物的施用量会根据动物的年龄、性别、体重而有所不同，可以将0.1～100mg/kg的量一日施用一次至数次，可以根据施用途径、疾病的程度、性别、体重、年龄等来增减施用量。因此，在任何方面来说，所述施用量并不能限定本发明的范围。

此外，本发明涉及一种含有白扁豆(dolichoslablablinne)提取物作为有效成分的用于预防或改善动物的脂肪肝疾病的饲料添加剂。

所述饲料添加剂可以是含有20～90重量％的白扁豆(dolichoslablablinne)提取物的高浓缩液、粉末或颗粒形态。

本发明的饲料添加剂可以进一步包含选自柠檬酸、富马酸、己二酸、乳酸、苹果酸等有机酸或磷酸钠、磷酸钾、酸性焦磷酸盐、聚磷酸盐(聚合磷酸盐)等磷酸盐或多元酚、焦儿茶酸(catechin)、α-生育酚、迷迭香提取物(rosemaryextract)、维生素c、绿茶提取物、甘草提取物、壳聚糖、鞣酸、植酸等天然抗氧化剂中的一种以上。

本发明的含有白扁豆(dolichoslablablinne)提取物的动物饲料添加剂及包含其的饲料可以和作为辅助成分的氨基酸、无机盐类、维生素、抗生物质、抗菌物质、抗氧化、抗霉菌酶、消化及吸收提高剂、生长促进剂、疾病预防剂等物质一起使用。

所述饲料添加剂可以单独在食用载体中与其它饲料添加剂组合施用。此外，所述饲料添加剂可以作为表面铺料(top-dressing)或将它们直接与动物饲料混合，或者与饲料分开以另外的口服剂型、注射或通过皮肤，或者与其它成分组合的方式容易地施用。通常，如本领域公知的那样，可以采用单次施用一天的施用量或分多次施用一天的施用量。将所述饲料添加剂与动物饲料分开进行施用的情况下，如本领域公知的那样，作为提取物的施用形态，可以将它们与非-毒性制药方面可接受的食用载体进行组合而制备成即释或缓释剂型。这种食用载体可以是固体或液体，例如，玉米淀粉、乳糖、蔗糖、大豆片、花生油、橄榄油、芝麻油及丙二醇。在使用固体载体时，提取物的施用型可以是片剂、胶囊剂、散剂、锭剂或含糖片剂或微分散型的表面铺料。使用液体载体时，可以是软明胶胶囊剂或糖浆剂或液体悬浮液剂、乳液剂或溶液剂的施用形态。此外，施用形态可以含有助剂，例如保存剂、稳定剂、润湿剂、乳化剂或溶液促进剂等。此外，含有白扁豆(dolichoslablablinne)提取物作为饲料添加剂的动物饲料可以是为了满足动物食物需求所通常使用的任意的含蛋白质有机谷粉。这种含蛋白质谷粉通常主要由玉米、大豆谷粉或玉米/大豆谷粉混合物构成。所述饲料添加剂可以通过浸渍、喷洒或混合来添加到所述动物饲料中，并加以利用。

本发明的兽医学组合物或饲料添加剂可以适用于宠物的食物中。

下面，利用实施例对本发明进行更加详细说明。这些实施例仅是为了对本发明进行更详细的说明，对于本领域技术人员来说，本发明的范围并不限定于这些实施例是显而易见的。

[试剂]

1)油红o(oilredo；西格玛(cat#o-0625)，fw408.5)储备溶液的制备

将0.35g的油红o溶解于100ml的异丙醇(isopropanol)中制备后，利用0.2μm的过滤器(filter)进行过滤，并于常温下保存。

2)油红o工作溶液的制备

将6ml的所述油红o储备溶液和4ml的ddh2o混合后，利用0.2μm的过滤器进行过滤，并于常温下放置20分钟。

3)10％的福尔马林溶液的制备

在63ml的ddh2o中稀释27ml的福尔马林原液而得到储备溶液(37％，默克公司，cat#k36658003)，将该储备溶液与10ml的10xpbs混合。

4)将100％的异丙醇(isopropanol；默克公司，cat#k36543834)作为空白对照。

5)60％的异丙醇的制备

将6ml的所述100％的异丙醇和4ml的ddh2o混合制得。

实施例1.肝癌细胞系(hepg2)的培养

肝癌细胞系(hepg2)是购自美国典型培养物保藏中心(americantypeculturecollection，attc)并使用。肝癌细胞系(hepg2)是用含有10％的fbs、1％的青霉素-链霉素的dmem(dulbecco'smodifiedeagle'smedium(达尔伯克改良伊格尔培养基))培养基来进行培养。将上述细胞在37℃下，在5％的co2培养器中培养，将培养的细胞以一定的数量(3×10⁴细胞/500μl孔)接种到24孔板并进行实验。

在24孔板中接种细胞后，待细胞完全附着到24孔上而具有细胞的形态后，当细胞达到75％的饱和度(confluence)时进行使用。

实施例2.游离脂肪酸(freefattyacid；ffa)的制备

(1)100mm的棕榈酸酯(西格玛p-0500)及100mm的油酸酯(西格玛o-75010)储备溶液的制备

在70℃下，利用0.1m的naoh溶液作为溶剂来制备，并利用0.2μm的过滤器过滤后，进行灭菌。

(2)未包含游离脂肪酸的5％(w/v)的bsa(西格玛a-6003)溶液的制备

将三蒸水(ddh2o)作为溶剂使用而制备后进行灭菌，并在4℃下冷藏保存。

(3)使油酸酯和棕榈酸酯的浓度为2:1进行混合的5mm的混合脂肪酸储备溶液的制备

在60℃下，将上述(2)中制备的溶解于三蒸水中的未包含游离脂肪酸的5％(w/v)的bsa溶液作为溶剂使用，制备10ml的脂肪酸储备溶液，使得上述(1)中制备的各个脂肪酸的浓度达到5mm。对于上述(1)中制备的100mm的棕榈酸酯及100mm的油酸酯储备溶液，取165μl(1.65mm)的棕榈酸酯(palmitate)及330μl(3.3mm)的油酸酯(oleate)，并一滴一滴地滴到9.505μl的5％(w/v)的bsa溶液的同时进行摇动而使其混合(vortexing(涡流))。之后，在常温下冷却后，用0.2μm的过滤器过滤(上述制备的混合溶液在-20℃下保存3～4周也稳定)。

(4)包含1％(w/v)的bsa的1mm的混合游离脂肪酸的制备

在无菌环境下，在上述(3)中制备的包含5％(w/v)bsa的5mm混合游离脂肪酸(油酸酯及棕榈酸酯以2:1的浓度比混合的游离脂肪酸)溶液(10ml)和含有0.5％的fbs/1％的青霉素-链霉素的dmem培养基中混合包含495μl的naoh的生长培养基(40ml)，从而制备50ml，使得ffa的最终浓度为1mm，bsa为1％(w/v)。

(5)bsa对照溶液的制备

在含有10ml的5％的ffa-游离bsa溶液+40ml的0.5％的fbs/1％的青霉素-链霉素的dmem培养基中混合包含495μl的naoh的生长培养基，使得最终体积为50ml。

(6)阳性对照溶液的制备

将10～100μm的18β-甘草次酸(18beta-glycyrrhetinicacid)作为阳性对照组使用。

实施例3.白扁豆提取物的制备

(1)白扁豆热水提取物的制备

在200g的白扁豆中加入2l的水，在90～100℃的温度下加热2～3小时，然后过滤提取物。之后，利用冷冻干燥机进行减压干燥来获得白扁豆热水提取物，为了将所述获得的白扁豆热水提取物用于实验，将其溶解于10％(v/v)的二甲基亚砜(dmso)中并进行使用。

(2)白扁豆乙醇提取物的制备

在200g的白扁豆中加入2l的80％的乙醇，在20～25℃的常温下浸渍22～24小时，然后过滤提取物。之后，利用减压浓缩机进行浓缩，并利用冷冻干燥机进行减压干燥来获得白扁豆乙醇提取物，为了将所述获得的白扁豆乙醇提取物用于实验，将其溶解于10％(v/v)二甲基亚砜中并进行使用。

实施例4.中性脂肪的含量评价

(1)尼罗红染色(adipored染色)试验

利用1mm的游离脂肪酸(ffa)来处理包含肝癌细胞系(hepg2)的培养基，在24小时后稍微吸出(suction)培养基。

在37℃的条件下以500μl/孔的量喷洒adipored溶液(将300μl的adipored溶解于10ml的pbs中而制得)后，在黑暗条件的常温下轻微摇动(shaking)15分钟进行反应。在该过程中，为了使染料的光褪色(photobleaching)最小化，用铝箔包裹板来进行保存。

待反应结束后，使用分光光度计(spectrophotometer)，在激发波长(excitation)为485nm、发射波长(emission)为572nm的条件下对其进行测定。

(2)油红o染色试验

从上述肝癌细胞系(hepg2)中去除培养基后，利用0.5ml的pbs缓冲溶液来清洗细胞，并完全去除pbs缓冲溶液。之后，在常温下添加0.5ml的10％的福尔马林，并孵化(incubation)10分钟。

去除上述的福尔马林，并添加0.5ml的新鲜福尔马林后至少孵化1小时以上(上述细胞在染色之前可以在福尔马林溶液中保存数日，需要用铝箔和石蜡膜(parafilm)包裹，以防止细胞干燥)。

之后，用吸液管去除福尔马林，然后使用0.5ml的ddh2o来清洗2次。在常温下利用60％的异丙醇(isopropanol)来清洗细胞5分钟。在常温下使细胞完全干燥(此时可以利用干燥机(drier)进行干燥)。

在上述干燥的细胞中添加0.5ml的油红o溶液，并在常温下孵化10分钟，然后去除油红o溶液，并立即添加ddh2o重复清洗4次。尽可能地去除染色溶液的碎片，之后利用荧光显微镜获取图像。

完全去除水气，并在干燥状态下添加0.5ml的溶解于100％的异丙醇中的油红o染色溶液，轻轻摇动10分钟进行孵化。此时，用吸液管向上下进行混合，使得油红o染色能够很好地渗透，然后移至96孔板中，并在500nm下测定od(光密度)。测定100％的异丙醇的od值来用作基准值(0点)。

4.1.对肝癌细胞系(hepg2)中因游离脂肪酸而增加的中性脂肪的含量进行确认

为了确认白扁豆提取物对于非酒精性脂肪肝(nafld)的功效，使用作为细胞模型的由游离脂肪酸所诱导的细胞性非酒精性脂肪肝模型。

用以2:1的重量比混合油酸和棕榈酸的游离脂肪酸分别以0.125mm、0.25mm、0.5mm及1.0mm的浓度对肝癌细胞系(hepg2)进行处理后，通过尼罗红染色试验和油红o染色试验来确认中性脂肪的含量变化的结果，确认了中性脂肪的含量与游离脂肪酸的浓度的增加呈比例地增加(图1)。

4.2.利用白扁豆提取物对肝癌细胞系(hepg2)中用游离脂肪酸处理而生成的中性脂肪的含量的减少效果进行确认

首先，将已知具有分解中性脂肪的效果的物质18β-甘草次酸以不同浓度(0、10μm、30μm、50μm及100μm)进行处理，从而确认细胞内的中性脂肪的含量减少的程度。

如图2中所示，对利用不同浓度(0、10μm、30μm、50μm及100μm)的18β-甘草次酸处理的肝癌细胞系实施尼罗红染色试验的结果，可知18β-甘草次酸具有能够减少约10～15％左右的中性脂肪含量的效果。在油红o染色试验结果的图像中也获得了随着18β-甘草次酸的浓度的增加中性脂肪减少的图像(图3)。

之后，通过尼罗红染色试验和油红o染色试验对肝癌细胞系(hepg2)中的中性脂肪因白扁豆热水提取物而减少的情况进行确认的结果，确认了对于白扁豆热水提取物10μg/ml、50μg/ml及100μg/ml的浓度约有28％左右的中性脂肪会随着浓度显著减少的效果，其中所述中性脂肪是利用1mm的油酸酯及棕榈酸酯的混合(2:1)游离脂肪酸对肝癌细胞系(hepg2)进行处理所生成的中性脂肪(图4及图5)。

此外，白扁豆乙醇提取物与所述白扁豆热水提取物相比减少的程度稍微会弱一些，但如图6及图7所示，在尼罗红染色试验和油红o染色试验结果中，确认了降低肝细胞内中性脂肪含量的效果为10～15％左右。

4.3.白扁豆热水提取物及豆类(大豆、黑豆、绿豆及豌豆)提取物的中性脂肪含量减少效果的比较

为了确认在其它的豆类提取物中是否也有白扁豆热水提取物在肝细胞内减少中性脂肪含量的效果，将大豆提取物、黑豆提取物、绿豆提取物及豌豆提取物作为对照组使用来实施尼罗红试验，从而分析中性脂肪含量的变化。尼罗红试验结果如图9所示，除了本发明的白扁豆提取物之外，在其它的豆类提取物中未显示出减少中性脂肪的效果，仅在白扁豆提取物中确认了中性脂肪得到显著减少的效果(图9)。

实施例5.对白扁豆提取物的细胞毒性进行确认

为了确认本发明的白扁豆热水提取物的细胞毒性，实施了mts试验。mts试验采用通常的实验方法实施，其结果如图8所示，观察到在以500μg/ml的高浓度处理的情况下，细胞生存率也几乎没有变化，从而确认了几乎不会显示出细胞毒性。

实施例6.白扁豆提取物对高脂肪食物小鼠的效果的确认

(1)实验动物的饲养

实验动物为120只8周龄雄性c57bl/6j小鼠，购自samtako公司，适应2周后用于实验。之后，通过随机完全区组设计(randomizedcompleteblockdesign)分为正常食物对照组(con，10％的脂肪)、高脂肪食物对照组(hfd，60％的脂肪)、施用高脂肪食物的同时施用上述实施例3的(1)中制备的白扁豆热水提取物的组(25mg/kg/天，50mg/kg/天，100mg/kg/天)及作为阳性对照组的施用高脂肪食物的同时施用水飞蓟提取物(100mg/kg/天)的组，共饲养9周，水和实验食物则自由供给。每组使用20只小鼠。以各组为对象，将上述高脂肪食物和提取物每天以口服施用方式供给9周。在9周期间，每周测定一次体重的变化，并测定食物摄取量、肝重量、腹部脂肪重量。饲养室的温度维持在22±1℃，湿度维持在50±5％，以12小时为间隔来调节黑暗和光照。从中央实验动物有限公司(centrallab.animalinc.)购入10％的正常食物和60％的高脂肪食物并进行供应。

(2)体重变化和肝组织、总脂肪、腹部皮下脂肪、附睾脂肪组织及小肠脂肪组织的变化

确认了上述实施例3的(1)中制备的白扁豆热水提取物对因高脂肪食物而增加的小鼠体重带来的影响，其结果为，与高脂肪食物组相比，摄取高脂肪食物的同时摄取本发明的实施例3的(1)中制备的白扁豆热水提取物的组的体重显示出显著低的结果。尤其，在施用100mg/kg/天的白扁豆热水提取物的组中，显示出体重的增加显著低的结果(图10a)。

确认了实施例3的(1)中制备的白扁豆热水提取物是否能减少因高脂肪食物而增加的肝组织重量，其结果为，与高脂肪食物组相比，同时摄取高脂肪食物和本发明的白扁豆热水提取物的组的肝组织重量显示出显著减少的结果。

高脂肪食物的长期摄入会诱发非酒精性脂肪肝。因此，在本实验中确认了因摄取高脂肪食物而诱发脂肪肝的高脂肪食物组(hfd)的肝组织重量与正常对照组(con)的肝组织重量相比显著增加，在同时施用高脂肪食物和白扁豆热水提取物的组中显示出肝组织的重量显著低的结果。尤其，在施用高脂肪食物的同时施用100mg/kg/天的白扁豆热水提取物的组中显示出肝组织的重量显著低的结果(图10b)。这样的结果是能够支持本发明的白扁豆热水提取物具有防止因高脂肪食物而诱发的肝组织的脂肪蓄积的效果的结果。

此外，确认了本发明的白扁豆热水提取物对因高脂肪食物而引起的小鼠的总脂肪、腹部皮下脂肪、附睾脂肪组织及小肠脂肪组织的增加带来的影响，其结果为，与高脂肪食物组相比，在同时摄取高脂肪食物和白扁豆热水提取物的组中显示出总脂肪、腹部皮下脂肪、附睾脂肪组织及小肠脂肪组织的增加显著减少的结果。尤其，在施用100mg/kg/天的白扁豆热水提取物的组中显示出显著低的结果(图11)。

这样的结果说明本发明的生药提取物具有预防或治疗肥胖的效果。

(3)血中的alt、ast的变化

确认了本发明的白扁豆热水提取物是否能减少因高脂肪食物而引起的血中的alt和ast的增加，其结果为，与高脂肪食物组相比，同时摄取高脂肪食物和本发明的实施例3的(1)中制备的白扁豆热水提取物的组的alt和ast显示出显著减少的结果(图12)。

这样的结果表明本发明的白扁豆热水提取物的食物添加能够减少血中的sgpt(alt)和sgot(ast)酶活性，这说明本发明的生药提取物能够改善因高脂肪食物而产生的非酒精性脂肪，从而显示出抑制肝损伤的功效。

(4)血液内的中性脂肪、总胆固醇、低密度脂蛋白、游离脂肪酸的变化

确认了本发明的实施例3的(1)中制备的白扁豆热水提取物是否能减少因高脂肪食物而增加的血液内的中性脂肪、总胆固醇、低密度脂蛋白及游离脂肪酸的数值，其结果为，在高脂肪食物组中显著增加的中性脂肪，总胆固醇、低密度脂蛋白及游离脂肪酸数值在施用白扁豆热水提取物的组中显示出随着浓度较显著减少的结果(图13)。

因此，白扁豆热水提取物的食物添加能够显著减少血液内的脂质水平，从而改善因高脂肪食物而诱导的非酒精性脂肪肝。

(5)空腹时的血中糖浓度变化

确认了本发明的白扁豆热水提取物是否能减少因高脂肪食物而导致的血中糖浓度，其结果为，与高脂肪食物组相比，在同时摄取高脂肪食物和本发明的白扁豆热水提取物的组中血中糖浓度会随着浓度显著减少(图14)。

因此，显示出本发明的白扁豆热水提取物的食物添加能够显著减少血清内糖浓度。