一种发酵型桑叶咀嚼片及其制备方法与流程

本发明属于咀嚼片技术领域，特别涉及一种发酵型桑叶咀嚼片及其制备方法，该发酵型桑叶咀嚼片具有清香爽口、酸甜适宜、质地细滑、硬度适中的口感，同时产品抗氧化活性和抑制α-葡萄糖苷酶活性较好，经动物实验显示其具有较好的降糖活性，可应用于2型糖尿病的预防和治疗。

背景技术：

桑叶为桑科植物桑的叶，味苦甘性寒，归肺、肝经，有祛风清热，凉血明目功效。大量药理学实验表明，桑叶提取物具有降糖、降压、抗氧化、抗菌等多种生物学作用。桑叶中富含的生物碱、多糖和黄酮类物质是其主要的活性成分。近年来，桑叶作为药食两用材料，被广泛地运用于食品和药品开发。

金顶侧耳(Pleurotus citrinopileat)又称金顶蘑、榆黄蘑，是一种非常珍贵的药食两用真菌，它富含维生素、氨基酸、蛋白质以及活性多糖，具有提高人体免疫功能以及抗衰老等多种生物活性。利用金顶侧耳发酵桑叶，一方面药用真菌茵丝大量生长,产生活性成分,另一方面桑叶基质被分解,原有活性成分发生改变,因此能够有效组合并增强两者的生物活性。

技术实现要素：

发明目的：本发明所要解决的第一个技术问题是提供了一种发酵型桑叶咀嚼片。本发明的所要解决的第二个技术问题是提供了该咀嚼片的制备方法。本发明以金顶侧耳发酵的桑叶粉(含发酵液浓缩物和菌丝体干燥粉末)为主要原料，配合小麦麸皮超微粉、山楂粉、甘露醇，通过特殊的加工工艺，制备出强化了抗氧化活性以及α-葡萄糖苷酶抑制活性的发酵型桑叶咀嚼片。产品口感酸甜、硬度适中、携带和使用方便，可在日常生活中作为休闲食品或糖尿病患者的日常保健食品。从市场需求来看，本产品将具有广阔的开发前景和经济价值。

技术方案：本发明提供的一种发酵型桑叶咀嚼片，至少由以下重量份的组分制成：发酵桑叶粉(含发酵液浓缩物、菌丝体干燥粉末)30～60份、小麦麸皮超微粉10～20份、山楂粉10～20份、甘露醇10～20份。

作为优选，所述发酵型桑叶咀嚼片至少由以下重量份的组分制成：发酵桑叶粉(含发酵液浓缩物、菌丝体干燥粉末)60份、小麦麸皮超微粉10份、山楂粉20份、甘露醇10份。

本发明还提供了上述发酵型桑叶咀嚼片的制备方法，包括以下步骤：

1)桑叶的液体发酵：配制50g/L桑叶粉溶液，并调节溶液pH至5～6.5，然后加入0.05～0.15％KH₂PO₄，0.05～0.15％MgSO₄，121℃，灭菌10～20分钟，接种金顶侧耳母种培养基，在温度为25℃、无光照、摇床转速110r/min条件下培养4～6天得到发酵液；

2)发酵桑叶粉的制备：发酵液(含菌体和发酵后桑叶)匀浆后冷冻干燥，粉碎后，过筛得到发酵桑叶粉备用；

3)小麦麸皮超微粉的制备：取市售新鲜小麦麸皮，清水洗去淀粉类物质，通风晾晒干燥，干燥后样品经粉碎，过80～100目筛，再加10～20倍量的饮用水，经200w超声波细胞破碎仪处理5～15min，样品再经冷冻干燥，干燥后样品经粉碎，过300目筛，得小麦麸皮超微粉；

4)山楂粉的制备：市售山楂干去核后洗净，加入5～10倍量的饮用水，浸泡15～30min，匀浆后进行冷冻干燥，过80～100目筛，得山楂粉；

5)混合和调配：将步骤1)～4)制得的发酵桑叶粉、小麦麸皮超微粉、山楂粉和甘露醇混匀得混合粉末；

6)湿法制粒压片法制备咀嚼片：将混合粉末加入质量分数95％的乙醇作为润湿剂，制软材、造粒、干燥后添加1％的硬脂酸镁、压片、包装、杀菌即得发酵型桑叶咀嚼片。

其中，上述步骤1)中，金顶侧耳母种培养基的组成为：桑叶粉配制成桑叶粉溶液，溶液pH6.5，含0.05～0.15％KH₂PO₄，0.05～0.15％MgSO₄，1～5％的葡萄糖，121℃灭菌20分钟，每升培养基接入固体培养菌种1/4cm²。

其中，上述金顶侧耳母种培养条件：温度25℃、无光照、摇床转速110r/min，培养3～5天。

其中，上述固体培养菌种采用PDA培养基，灭菌后接入1环金顶侧耳活化菌种，在温度为25℃，无光照条件下培养3～5天。

其中，上述步骤2)中冷冻干燥温度为-20℃～-55℃。

有益效果：本发明提供的发酵型桑叶咀嚼片由发酵桑叶粉(含发酵液浓缩物、菌丝体干燥粉末)、小麦麸皮超微粉、山楂粉、甘露醇混合制成，原料来源天然，产品酸甜爽口、口感细滑、硬度适中，食用方便。产品不仅保留了原料的各种营养成分，还通过生物发酵过程增加了金顶侧耳菌丝体产生的生物活性物质、以及桑叶中活性物质的转化，产品中的总酚和多糖含量明显上升，总抗氧化活性以及抑制α-葡萄糖苷酶的活性均明显增强。经动物实验，可有效降低2型糖尿病小鼠的空腹血糖值，可用于日常保健或糖尿病患者的饮食调节。

具体而言，本发明相对于现有技术具有以下突出的优势：

一是原料来源天然，并经发酵转化提升生物学活性。该咀嚼片采用的原材料均为食药两用植物材料。其中，桑叶在古书籍中被称作“神仙草”,在《神农本草经》、《本草纲目》等药书中均有记载，具有降糖、降压等多种活性。利用现代发酵技术，桑叶经珍贵药食真菌金顶侧耳发酵，生物大分子进一步转化，具有抗氧化以及抑制α-葡萄糖苷酶活性的物质被大量生成，桑叶的使用和药用价值得到了更好的提升，动物实验结果表明该咀嚼片有利于降低2型糖尿病小鼠的空腹血糖值。小麦麸皮是面粉加工行业的副产物，富含膳食纤维、谷物多酚和微量元素，近年来被认为是低血糖指数食品原料。山楂含有维生素C、胡萝卜素等物质，具有降压、降脂，预防心血管疾病的作用。

二是产品在口感和食用便利性上均有优势。上述材料中，桑叶经发酵略带一点苦涩味，经配合小麦麸皮、山楂、甘露醇后，苦涩味基本消除。同时，新鲜小麦麸皮的天然麦香味以及山楂的酸甜口味，使得产品口感清爽宜人。同时产品为咀嚼片，平时携带方便，便于食用。

三是应用广泛。该咀嚼片制备工艺先进，制得的咀嚼片不仅安全无毒、疗效可靠、稳定性好，而且气味芬芳、酸甜爽口，且价格亲民、利于被人们接受，可作为各类人群的休闲食品，也可以作为糖尿病患者的保健食品，市场潜力巨大。

附图说明

图1普通桑叶及实施例1～4的总抗氧化活性；

图2普通桑叶及实施例1～4的α-葡萄糖苷酶抑制活性；

图3普通桑叶及实施例1～4对小鼠的降糖活性分析；

具体实施方式

根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的具体的物料配比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。

本实施例中的桑叶为经霜桑叶，采摘于中国农业科学院蚕业研究所桑树资源圃；新鲜小麦麸皮购于农贸市场；山楂购于药店；金顶侧耳母种来源于江苏省农科院食用菌菌种保藏中心，浸提用水均为纯净水；浸提用具均为玻璃或不锈钢容器。

实施例1

发酵型桑叶咀嚼片，至少由以下重量份的组分制成：发酵桑叶粉(含发酵液浓缩物、菌丝体干燥粉末)60份、小麦麸皮超微粉10份、山楂粉20份、甘露醇10份。

发酵型桑叶咀嚼片的制备方法，包括以下步骤：

(1)桑叶的液体发酵：

桑叶粉配制成50g/L溶液，用2％硫酸溶液调pH至5.5，50℃保温2h。然后加入0.1％KH₂PO₄，0.1％MgSO₄。121℃，灭菌15分钟。接种金顶侧耳母种培养基10mL，在温度为25℃、无光照、摇床转速110r/min条件下培养5天得到发酵液；

其中，金顶侧耳母种培养基的制备：桑叶粉配制成50g/L溶液，加入0.1％KH₂PO₄，0.1％MgSO₄，2％的葡萄糖。加入饮用水制备出液体培养基，121℃灭菌15分钟。每升培养基接入固体培养菌种1/4cm²，在温度25℃、无光照、摇床转速110r/min条件下培养5天，取出备用。固体培养菌种采用PDA培养基，灭菌后接入1环金顶侧耳活化菌种，在温度为25℃，无光照条件下培养5天。

(2)发酵桑叶粉的制备

发酵液(含菌体和发酵后桑叶)，匀浆后冷冻干燥，粉碎后，过筛得到发酵桑叶粉备用；冷冻干燥温度为-55℃。

(3)小麦麸皮超微粉的制备：

取市售新鲜小麦麸皮，清水洗去淀粉类物质，通风晾晒干燥，干燥后样品经粉碎，过80目筛，再加10倍量的饮用水，经200w超声波细胞破碎仪处理5min，样品再经冷冻干燥，干燥后样品经粉碎，过300目筛，得小麦麸皮超微粉；

(4)山楂粉的制备：

市售山楂干去核后洗净，加入5倍量的饮用水，浸泡30min，匀浆后进行冷冻干燥，过100目筛，得山楂粉。

(5)混合和调配：

将步骤1)～4)制得的发酵桑叶粉(含发酵液浓缩物、菌丝体干燥粉末)(60份)、小麦麸皮超微粉(10份)、山楂粉(20份)、甘露醇(10份)混匀得混合粉末；

(6)湿法制粒压片法制备咀嚼片：

将混合粉末加入95％乙醇作为润湿剂，制软材、造粒、干燥后添加1％的硬脂酸镁、压片、包装、杀菌即得发酵型桑叶咀嚼片。

实施例2

发酵型桑叶咀嚼片，至少由以下重量份的组分制成：发酵桑叶粉(含发酵液浓缩物、菌丝体干燥粉末)50份、小麦麸皮超微粉20份、山楂粉20份、甘露醇10份。

发酵型桑叶咀嚼片的制备方法，包括以下步骤：

(1)桑叶的液体发酵：

桑叶粉配制成50g/L溶液，用2％硫酸溶液调pH至6.5，50℃保温2h。然后加入0.05％KH₂PO₄，0.15％MgSO₄，121℃，灭菌10分钟。接种金顶侧耳母种培养基10mL，在温度为25℃、无光照、摇床转速110r/min条件下培养5天得到发酵液；

其中，金顶侧耳母种培养基的制备：桑叶粉50g/L，加入0.05％KH₂PO₄，0.15％MgSO₄，1％的葡萄糖。加入饮用水制备出液体培养基，121℃灭菌15分钟。每升培养基接入固体培养菌种1/4cm²，在温度25℃、无光照、摇床转速110r/min条件下培养5天，取出备用。固体培养菌种采用PDA培养基，灭菌后接入1环金顶侧耳活化菌种，在温度为25℃，无光照条件下培养5天。

(2)发酵桑叶粉的制备

发酵液(含菌体和发酵后桑叶)，匀浆后冷冻干燥，粉碎后，过筛得到发酵桑叶粉备用。冷冻干燥温度为-40℃。

(3)小麦麸皮超微粉的制备：

取市售新鲜小麦麸皮，清水洗去淀粉类物质，通风晾晒干燥，干燥后样品经粉碎，过100目筛，再加20倍量的饮用水，经200w超声波细胞破碎仪处理15min，样品再经冷冻干燥，干燥后样品经粉碎，过300目筛，得小麦麸皮超微粉；

(4)山楂粉的制备：

市售山楂干去核后洗净，加入10倍量的饮用水，浸泡15min，匀浆后进行冷冻干燥，过100目筛，得山楂粉。

(5)混合和调配：

将步骤1)～4)制得的发酵桑叶粉(含发酵液浓缩物、菌丝体干燥粉末)(50份)、小麦麸皮超微粉(20份)、山楂粉(20份)、甘露醇(10份)混匀得混合粉末；

(6)湿法制粒压片法制备咀嚼片：

将混合粉末加入95％乙醇作为润湿剂，制软材、造粒、干燥后添加1％的硬脂酸镁、压片、包装、杀菌即得发酵型桑叶咀嚼片。

实施例3

发酵型桑叶咀嚼片，至少由以下重量份的组分制成：发酵桑叶粉(含发酵液浓缩物、菌丝体干燥粉末)40份、小麦麸皮超微粉20份、山楂粉20份、甘露醇20份。

发酵型桑叶咀嚼片的制备方法，包括以下步骤：

(1)桑叶的液体发酵：

桑叶粉配制成50g/L溶液，用2％硫酸溶液调pH至6.5，50℃保温2h。然后加入0.15％KH₂PO₄，0.05％MgSO₄。121℃，灭菌15分钟。接种金顶侧耳母种培养基10mL，在温度为25℃、无光照、摇床转速110r/min条件下培养5天。

金顶侧耳母种培养基的制备：桑叶粉50g/L，加入0.15％KH₂PO₄，0.05％MgSO₄，5％的葡萄糖。加入饮用水制备出液体培养基，121℃灭菌15分钟。每升培养基接入固体培养菌种1/4cm²，在温度25℃、无光照、摇床转速110r/min条件下培养5天，取出备用。固体培养菌种采用PDA培养基，灭菌后接入1环金顶侧耳活化菌种，在温度为25℃，无光照条件下培养5天。

(2)发酵桑叶粉的制备

发酵液(含菌体和发酵后桑叶)，匀浆后冷冻干燥，粉碎后，过筛得到发酵桑叶粉备用。冷冻干燥温度为-20℃。

(3)小麦麸皮超微粉的制备：

取市售新鲜小麦麸皮，清水洗去淀粉类物质，通风晾晒干燥，干燥后样品经粉碎，过100目筛，再加15倍量的饮用水，经200w超声波细胞破碎仪处理10分钟，样品再经冷冻干燥，干燥后样品经粉碎，过300目筛，得小麦麸皮超微粉；

(4)山楂粉的制备：

市售山楂干去核后洗净，加入8倍量的饮用水，浸泡30min，匀浆后进行冷冻干燥，过100目筛，得山楂粉。

(5)混合和调配：

将步骤1)～4)制得的发酵桑叶粉(含发酵液浓缩物、菌丝体干燥粉末)(40份)、小麦麸皮超微粉(20份)、山楂粉(20份)、甘露醇(20份)混匀得混合粉末；

(6)湿法制粒压片法制备咀嚼片：

将混合粉末加入95％乙醇作为润湿剂，制软材、造粒、干燥后添加1％的硬脂酸镁、压片、包装、杀菌即得发酵型桑叶咀嚼片。

实施例4

发酵型桑叶咀嚼片，至少由以下重量份的组分制成：发酵桑叶粉(含发酵液浓缩物、菌丝体干燥粉末)30份、小麦麸皮超微粉15份、山楂粉15份、甘露醇15份。

发酵型桑叶咀嚼片的制备方法，包括以下步骤：

1)桑叶的液体发酵：桑叶粉配制成50g/L溶液，用2％硫酸溶液调pH至6，50℃保温2h，然后加入0.15％KH₂PO₄，0.15％MgSO₄，121℃，灭菌15分钟，接种金顶侧耳母种培养基，在温度为25℃、无光照、摇床转速110r/min条件下培养5天得到发酵液；

金顶侧耳母种培养基的制备：桑叶粉50g/L，加入0.15％KH₂PO₄，0.15％MgSO₄，2％的葡萄糖。加入饮用水制备出液体培养基，121℃，灭菌15分钟。每升培养基接入固体培养菌种1/4cm²，在温度25℃、无光照、摇床转速110r/min条件下培养4天，取出备用。固体培养菌种采用PDA培养基，灭菌后接入1环金顶侧耳活化菌种，在温度为25℃，无光照条件下培养5天。

2)发酵液(含菌体和发酵后桑叶)，匀浆后冷冻干燥，粉碎后，过筛得到发酵桑叶粉备用。冷冻干燥温度为-30℃。

3)小麦麸皮超微粉的制备：取市售新鲜小麦麸皮，清水洗去淀粉类物质，通风晾晒干燥，干燥后样品经粉碎，过90目筛，再加20倍量的饮用水，经200w超声波细胞破碎仪处理15min，样品再经冷冻干燥，干燥后样品经粉碎，过300目筛，得小麦麸皮超微粉；

4)山楂粉的制备：市售山楂干去核后洗净，加入10倍量的饮用水，浸泡25min，匀浆后进行冷冻干燥，过90目筛，得山楂粉；

5)混合和调配：将步骤1)～4)制得的发酵桑叶粉、小麦麸皮超微粉、山楂粉和甘露醇混匀得混合粉末；

6)湿法制粒压片法制备咀嚼片：将混合粉末加入95％乙醇作为润湿剂，制软材、造粒、干燥后添加1％的硬脂酸镁、压片、包装、杀菌即得发酵型桑叶咀嚼片。

实验例1总抗氧化活性的测定

实施例1～4与桑叶的总抗氧化活性比较：

按总抗氧化能力(T-AOC)测定试剂盒(购自南京建成生物工程有限公司)说明书操作方法，准确称取桑叶干燥粉末以及实施例1～4得到的发酵型桑叶咀嚼片样品重量，按重量体积比加9倍生理盐水制成10％的匀浆，2000～2500转/分离心10分钟，取上清待测。实验结果如图1所示。实施例1-4的总抗氧化性均优于桑叶，其中实施例1的总抗氧化值为2.18U/mg，是桑叶的1.6倍，由此可见该咀嚼片配方及其制备方法均增强了产品的抗氧化性。

实验例2实施例1～4与普通桑叶提取物的α葡萄糖苷酶抑制活性的测定

实施例1～4与普通桑叶提取物的α葡萄糖苷酶抑制活性比较：

取桑叶和各实施例浸提液，利用体外α-葡萄糖苷酶反应体系：0.2mL 4m mol/LpNPG，加入2.4mL 0.05mol/L pH6.8的磷酸缓冲液，再加入0.2mL浓缩液，37℃预热5min后，加入0.2mL酶液(约0.04U)，酶活力定义为:在pH6.8、37℃条件下，每分钟催化形成1μmolpNG所需要的酶量为1个活力单位)。37℃反应15min，加入2mL 1mol/L Na₂CO₃终止反应，测定410nm处吸光值。以蒸馏水代替浓缩液为全酶管，以缓冲液代替酶液作为对照管以消除抑制剂颜色的影响。抑制活性＝(1－(实验管－对照管)/全酶管))×100％。实验结果如图所示2。实施例1-4对α-葡萄糖苷酶的抑制活性均显著高于普通桑叶样品，其抑制活性分别提高了97％、77％、66％和69％。

实验例3实施例1～4与普通桑叶粉对小鼠的降糖活性测定

实施例1～4与桑叶粉对小鼠的降糖活性：

健康小鼠购入后，适应性饲养一周，自由饮水饮食，室温控制在20～25℃，湿度60％左右。一周后，将小鼠随机分成两组，对照组(n＝10)，模型组(n＝80)。对照组小鼠给予普通饲料喂养，试验组小鼠用高糖高脂饲料喂养，自由饮水、饮食。饲养4周后，禁食不禁水24h，腹腔注射STZ(剂量为70mg/kg)，连续注射两天，3天后测定空腹血糖(fasting blood glucose，FBG)(禁食不禁水12h血糖)，选用空腹血糖水平≥16.8mmol/L的小鼠为模型小鼠，两周后血糖值稳定在16.8mmol/L以上的小鼠进入下一步实验。

正常对照组：随机取8只对照组正常小鼠，普通饲料常规饲养；模型对照组：随机取8只模型组小鼠，高脂高糖饲料常规饲养；处理组：分别随机取8只模型组小鼠作为一组，各组均以高脂高糖饲料常规饲养，分别给予1.5g/kg/d样品，灌胃给药，连续处理10周。10周后，各组小鼠禁食不禁水过夜，第二天测定其空腹血糖值，结果如图3。可见，桑叶具有降糖作用，在处理10周后处理组的空腹血糖值显著低于模型组，但尚未恢复至正常组水平。实施例1-4按同样的剂量处理2型糖尿病小鼠10周，其空腹血糖值均低于桑叶处理组，更接近于正常组水平，其中实施例1的空腹血糖值显著低于桑叶组，平均空腹血糖值为8.2mmol/L。