本发明涉及动物养殖饲料技术领域，特别涉及酵母培养物在制备改善鱼类生长、提高鱼类非特异性免疫力的饲料中的应用。
背景技术：
酵母培养物(yeast culture，YC)是指在一定的工艺条件下酵母菌在特定培养基经过深度发酵而得到复杂发酵产物，它包括细胞代谢产物(含多肽、有机酸、氨基酸、核酸、酶类、未知生长因子等)、变性培养基(含寡糖、多肽等)和酵母细胞本身(蛋白质、氨基酸、核酸、细胞壁多糖等)，营养成分十分丰富，可为动物肠道内共生菌提供“全价营养底物”，最大限度维持体内肠道各菌系之间的平衡，促进肠道功能正常，提高饲料中营养物质消化吸收率，从而改善动物生产性能。
但是，现有技术中，酵母培养物的研究多是在以饲料添加成分对反刍动物的生长性能影响的研究，而对鱼类生长性能，尤其是在影响鱼类非特异性免疫的研究却很少。因此，将酵母培养物作为鱼类饲料添加成分，对提高鱼类生产水平、优化鱼饲料具有重要的意义。
技术实现要素：
本发明要解决的技术问题是提供一种酵母培养物在制备改善鱼类生长、提高鱼类非特异性免疫力的饲料中的应用。
为了解决上述技术问题，本发明是通过如下技术方案实现的：
酵母培养物在制备改善鱼类生长、提高鱼类非特异性免疫力的饲料中的应用，其中的酵母培养物是按照包括如下步骤的方法制备得到的：将保藏号为CGMCC No.2.399的酿酒酵母，经斜面菌种活化后，得到的酵母菌种继续接种制备种子液，将种子液依次进行液体有氧发酵，固体厌氧发酵，将得到的固体发酵产物通过干燥及粉碎得到酵母培养物。
作为进一步的技术方案，斜面菌种活化包括如下步骤：将冷冻保藏的保藏号为CGMCCNo.2.399的酿酒酵母接种到斜面培养基上，静置恒温28～35℃，培养40～70h，得到活化后的酵母菌种。
斜面培养基为固体麦芽汁培养基，包括麦芽膏粉、氯霉素、琼脂；各成分含量优选为麦芽膏粉130g/L、氯霉素0.1g/L，琼脂2％。
上述种子液的制备包括如下步骤：将酵母菌种接种至液体培养基中，在28～35℃恒温摇床培养，转速120～200r/min；培养18～30h。
作为进一步的技术方案，液体有氧发酵包括如下步骤：将种子液以10％～20％接种量接种到装有新的液体培养基的发酵罐中进行扩大培养，控制通气量为1～5L/min，温度为28～35℃，发酵时间为20～35h；得到扩大培养的液体菌种液。
液体培养基为麦芽汁培养基，包括麦芽膏粉、氯霉素，两者含量优选为麦芽膏粉130g/L、氯霉素0.1g/L；pH值为5.6～6.5。
作为进一步的技术方案，固体厌氧发酵包括如下步骤：将液体菌种液以20％～30％的接种量接种至无菌固体培养基中，于双层可控温隔离干燥设备中进行固体厌氧发酵，控制水分含量为35％～70％，发酵温度为28～35℃，发酵时间18～50h；得到固体发酵产物。
固体培养基包括按质量份数计的秸秆4～7份、玉米粉3～5份、麸皮1～3份或酒糟3～5份的任三种或四种；培养基碳氮比为(2～7)∶1，通过添加尿素进行控制。
作为进一步的技术方案，干燥包括如下步骤：将固体发酵产物进行干燥，干燥方式真空干燥，干燥温度25℃～45℃，优选30℃，得到酵母培养物初产品。
作为进一步的技术方案，粉碎包括如下步骤：将酵母培养物初产品进行粉碎，粉碎过筛40～60目，得到酵母培养物产品。
作为进一步的技术方案，酵母培养物在饲料中的添加量的质量百分含量为0.2～1％
作为进一步的技术方案，饲料的日投饲次数为2～3次，日投饲率为鱼体重的3～5％。
作为进一步的技术方案，饲料的主要营养成分包括粗蛋白50％～55％，粗脂肪10％～12％；饲料粉碎后，用80～100目筛去除大颗粒，混合均匀后压制成粒径为1～2mm的颗粒饲料，冷藏储存。
本发明的有益效果：
本发明通过在鱼饲料中添加不同浓度的酵母培养物，来研究酵母培养物对鱼类生长性能和非特异性免疫的影响，为酵母培养物在鱼饲料中的应用提供基础；试验证明，在大菱鲆的饲料中添加不同浓度的酵母培养物，均能显著提高大菱鲆增重率(P＜0.05)，并且均能显著降低饲料系数(P＜0.05)，可知酵母培养物对大菱鲆的生长性能有显著改善；同时，均能显著提高大菱鲆溶菌酶和碱性磷酸酶的活力，进而提高大菱鲆非特异性免疫水平。
具体实施方式
下面对本发明的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所使用的菌株的详细信息如下：
酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)：CGMCC编号为2.399；该酿酒酵母已在申请号为CN201410629012.0，专利名称为一种黄水醋饮的生产方法的发明授权专利中公开。
下述实施例中所使用的大菱鲆由山东某水产养殖场提供；大菱鲆(Scophthalmus maximus)俗称“多宝鱼”，属于鲽形目、鲆科菱鲆属，是产自欧洲的一种冷水性海产鱼类，于1992年引进我国，因其低耗氧量，生长迅速，适合高密度养殖，迅速成为我国北方重要水产经济种类。
实施例1，酵母培养物的制备
1、斜面菌种活化：将冷冻保藏的保藏号为CGMCC No.2.399的酿酒酵母接种到含有麦芽膏粉130g/L、氯霉素0.1g/L，琼脂2％的斜面培养基上，静置恒温28℃，培养40h，得到活化后的酵母菌种。
2、种子液的制备：将活化后的酵母菌种用1环接种至含有麦芽膏粉130g/L、氯霉素0.1g/L；pH值为5.6的液体培养基中，在28℃恒温摇床培养，转速120r/min；培养18h。
3、液体有氧发酵：将制备好的种子液以10％接种量接种到装有新的含有麦芽膏粉130g/L、氯霉素0.1g/L；pH值为5.6的液体培养基的发酵罐中进行扩大培养，控制通气量为5L/min，温度为28℃，发酵时间为20h：得到扩大培养的液体菌种液。
4、固体厌氧发酵：将液体菌种液以20％的接种量接种至质量份数为秸秆4份、玉米粉3份、麸皮3份的无菌固体培养基中，添加尿素控制碳氮比为2∶1，于双层可控温隔离干燥设备中进行固体厌氧发酵，控制水分含量为35％，发酵温度为28℃，发酵时间18h；得到固体发酵产物。
5、酵母培养物的获得
将所述固体发酵产物进行干燥，干燥方式真空干燥，干燥温度25℃～45℃，优选30℃，得到酵母培养物初产品。再将所属酵母培养物初产品进行粉碎，粉碎过筛40～60目，即可得到酵母培养物产品。该产品粗蛋白质含量为14.9％，甘露聚糖含量为1.0％，β-葡聚糖含量为3.5％，灰分含量为7.8％。
实施例2，酵母培养物的制备
1、斜面菌种活化：将冷冻保藏的保藏号为CGMCC No.2.399的酿酒酵母接种到含有麦芽膏粉130g/L、氯霉素0.1g/L，琼脂2％的斜面培养基上，静置恒温30℃，培养48h，得到活化后的酵母菌种。
2、种子液的制备：将活化后的酵母菌种用1环接种至含有麦芽膏粉130g/L、氯霉素0.1g/L；pH值为6.5的液体培养基中，在30℃恒温摇床培养，转速160r/min；培养24h。
3、液体有氧发酵：将制备好的种子液以20％接种量接种到装有新的含有麦芽膏粉130g/L、氯霉素0.1g/L；pH值为5.6的液体培养基的发酵罐中进行扩大培养，控制通气量为2L/min，温度为30℃，发酵时间为28h；得到扩大培养的液体菌种液。
4、固体厌氧发酵：将液体菌种液以30％的接种量接种至质量份数为秸秆6份、玉米粉5份、麸皮2份和酒糟3份的无菌固体培养基中，添加尿素控制碳氮比为3∶1，于双层可控温隔离干燥设备中进行固体厌氧发酵，控制水分含量为55％，发酵温度为30℃，发酵时间42h；得到固体发酵产物。
5、酵母培养物的获得
将所述固体发酵产物进行干燥，干燥方式真空干燥，干燥温度25℃～45℃，优选30℃，得到酵母培养物初产品。再将所属酵母培养物初产品进行粉碎，粉碎过筛40～60目，即可得到酵母培养物产品。经检测得到，该产品粗蛋白质含量为15.4％，甘露聚糖含量为1.5％，β-葡聚糖含量为4.2％，灰分含量为5.6％。
实施例3，大菱鲆的生长性能及非特异性免疫试验
1，饲料的制备
本试验所选用的基础饲料包括鱼粉、大豆浓缩蛋白、小麦粉、α-淀粉、羧甲基纤维素钠、甜菜碱、大豆软磷脂、鱼油、大豆油、抗氧化剂、预混料，其中，抗氧化剂为鱼饲料中常见的抗氧化剂，预混料为每千克日粮提供5400IU维生素A、900IU维生素D3、48mg维生素E、2.4mg维生素K3、1.8mg维生素B1、7.2mg维生素B2、12mg维生素B6、0.2mg维生素B12、24mg烟酰胺、15mg泛酸钙、0.06mg生物素、120mg维生素C、150mg铁、2.8mg铜、60mg锌、60mg锰、0.75mg碘、0.32mg硒、150mg镁的混合料。
上述基础饲料各组成的添加量见下表1。
2，试验过程
试验前，将大菱鲆在养殖系统中驯养2周，选择规格一致初始均重为(15.84±0.26)g，且体质健壮的个体300尾，随机分成5组，分别喂料，以喂料为基础饲料作为对照组；喂料为在基础饲料中分别添加实施例1和实施例2制备的酵母培养物的饲料，其中加入实施例1中的酵母培养物的质量分别为3000mg/kg、5000mg/kg、10000mg/kg，作为试验组1、试验组2、试验组3；加入实施例2中的酵母培养物的质量为5000mg/kg，作为试验组4。每个试验组3个重复，每个重复的大菱鲆数量为20尾。
上述5组试验中，饲料配方及营养水平见表1。将表中各组分粉碎后，用80～100目筛去除大颗粒，混合均匀后压制成粒径为1～2mm的颗粒饲料，4℃冷藏储存备用。
表1饲料各组成及主要营养成分表(饲喂基础)
表1中的主要营养成分为实测值。
试验在山东某水产养殖场内进行，试验用鱼在网箱(规格为1m×1m×1m)中采用循环海水充气养殖，本试验共15个网箱。循环海水经过砂虑、臭氧处理后进入网箱。试验期为70d，饲料每天投喂2次(上午07:00、下午17:00)，日投饲率为体重的3～5％。试验期间控制水温在15～18℃之间，溶解氧量＞7.0mg/L，pH值7.5～8.5，盐度28～30％。
3，样品采集与分析
养殖试验结束后，试验鱼在网箱中停食24h，然后逐箱起捕。记录每个网箱中大菱鲆的尾数，测定对虾的体重，计算增重率、特定生长率、饲料系数。每个网箱随机选取6尾试验鱼经麻醉后尾静脉取血。血液在4℃冰箱中静置6h后离心(4℃，5000r/min，35min)，取上清液。整个过程在冰上进行，样品放入-80℃冰箱中保存待测。
溶菌酶(LZM)采用空白对照比浊法测定，总超氧化物歧化酶(SOD)采用羟胺法测定，过氧化氢酶(CAT)采用可见光分光光度计法测定，碱性磷酸酶(AKP)采用磷酸苯二钠法测定，以上指标均采用南京建成生物工程研究所的试剂盒进行测定。
4，试验结果
4.1酵母培养物对大菱鲆生长性能的影响
上述对照组、试验组1～4的酵母培养物对大菱鲆生长性能的影响，5组试验的结果数据见表2。
表2酵母培养物对各试验组大菱鲆特定生长率、增重率和饲料系数的影响
上述表2中，上角标a，b表示同列数据肩注不同字母表示差异显著(P＜0.05)。
增重率(％)＝(末体重-初体重)/初体重×100；
特定生长率(％/d)＝(ln末均重-ln初均重)/饲养天数×100；
饲料系数＝投饲量/(试验末总体重+试验中死亡鱼体重-试验初总体重)
数据统计采用SPSS14.0版统计软件中One-Way过程进行方差分析，并进行Duncan’s法多重比较，显著水平为0.05，结果采用(平均值±标准差)表示。
由表2可知，向大菱鲆的饲料中添加3000mg/kg酵母培养物、5000mg/kg酵母培养物和10000mg/kg酵母培养物的试验组1～4，与对照组相比，在喂料后，大菱鲆的特定生长率分别提高了5.2％、7.6％、8.77％和11.11％(P＜0.05)；增重率分别提高了9.09％、12.95％、15.17％和19.82(P＜0.05)；饲料系数降低了13.40％、16.49％、18.56％和18.56％(P＜0.05)。
4.2酵母培养物对大菱鲆非特异性免疫的影响
上述对照组、试验组1～4的酵母培养物对大菱鲆非特异性免疫的影响，5组试验的结果数据见表3。
表3酵母培养物对各试验组大菱鲆血清非特异性免疫的影响
上述表3中，上角标a，b表示同列数据肩注不同字母表示差异显著(P＜0.05)。
数据统计采用SPSS14.0版统计软件中One-Way过程进行方差分析，并进行Duncan’s法多重比较，显著水平为0.05，结果采用(平均值±标准差)表示。
由表3可知，与对照组相比，各试验组能显著提高大菱鲆溶菌酶和碱性磷酸酶的活力(P＜0.05)，同时能在一定程度上提高超氧化物歧化酶和过氧化氢酶的活力，但差异不显著(P＞0.05)。
综上，试验数据表明，在大菱鲆的饲料中添加不同浓度的酵母培养物均能显著提高大菱鲆增重率(P＜0.05)，并且均能显著降低饲料系数(P＜0.05)，可知酵母培养物对大菱鲆的生长性能有显著改善；同时，均能显著提高大菱鲆溶菌酶和碱性磷酸酶的活力，进而提高了大菱鲆非特异性免疫水平。
以上对本发明的实施方式作了详细说明，但本发明不限于所描述的实施方式。对于本领域的技术人员而言，在不脱离本发明原理和精神的情况下，对这些实施方式进行多种变化、修改、替换和变型，仍落入本发明的保护范围内。