本发明属于生物工程领域，具体涉及一种蛋黄粉、其制备方法及应用。
背景技术：
自2009年以来，早期死亡综合症(ems)，又称急性肝胰腺坏死综合症(ahpns)给亚洲，特别是东南亚和中国的对虾养殖产业造成了前所未有的冲击。除了大规模减产外，该疾病还带来了诸多负面问题，例如：对虾养殖就业问题、社会福利问题、对虾供求问题和全球对虾总体价格问题等等。
2013年5月，美国亚利桑那大学水产病理实验室(uaz-apl)定义急性肝胰腺坏死综合症(ahpns)病原为副溶血弧菌的特异菌株，该菌株能够产生毒素并诱导健康对虾致病。2014年，在世界范围内普遍证实目前aphnd的病因与副溶血弧菌所携带的毒素质粒所表达的pira和pirb两种毒素相关。
蛋黄中除含有丰富的卵磷脂、卵黄高磷蛋白等营养因子，可促进幼体生长发育外，还含有其他一些抗病原微生物的功能因子，如卵粘蛋白和半胱氨酸蛋白酶抑制剂可抑制由病毒引起的血细胞凝聚且通过对巯基蛋白的抑制发挥抗菌，抗病毒的作用；诞酸及诞酸低聚糖、免疫球蛋白可促进幼体发育以及抗感染，特别是针对病毒引起的下痢具有抑制作用。高免鸡蛋在普通鸡蛋所含有的有效成分的基础上，还含有经特异抗原免疫后产生的高浓度的蛋黄抗体，这种含特异性抗体鸡蛋能在鸡蛋普遍提升机体营养供给和免疫水平的基础上，有效防御和抵抗病原的侵袭，是一种优质的新型饲料添加剂。
cn101044884b公开了一种卵黄抗体饲料添加剂制备方法。该方法利用经免疫的全蛋液在搅拌的同时向其中加入饲用麸皮，将混合均匀的免疫蛋麸皮料在恒温箱中干燥36h，而后在粉碎机作用下得到的饲料添加剂制备方法。cn1507790a公开了一种含有大肠杆菌卵黄抗体的饲用蛋白粉的制备方法及其应用。该蛋白粉内含有效价≥1:64的抗大肠杆菌的卵黄抗体。该制备方法是将免疫后的全蛋液进行巴氏杀菌、在常规喷雾干燥器中进行喷雾干燥得到饲用蛋白粉。上述方法的干燥时间过于漫长，不利于蛋黄免疫球蛋白活性的保持，鸡蛋中的主要作用成分是蛋黄中的蛋黄抗体，而蛋清却可以分离出来作为一种高附加值的食品成分经喷雾干燥后单独出售，其市场售价一般在普通蛋黄喷雾干燥产品的市场售价两倍左右。因此，在获取蛋黄抗体的同时，将蛋黄和蛋清分开制作成产品更有利于实际生产中的产业化。
随着抗生素作为饲料添加剂在世界范围内的相继禁止，蛋黄颗粒/粉作为新型饲料添加剂替代品在国内外已经相继有基础研究的报道，但其产业化目前还不尽成熟，鸡蛋黄颗粒/粉作为饲料添加剂的产业化已成为现代农业发展的迫切需要。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种蛋黄粉、其制备方法及应用，该蛋白粉制备方法简单，免疫活性高。
为达到此发明的目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供了一种蛋黄粉，所述蛋黄粉的原料按重量份数主要由以下原料制备得到：
蛋黄液20-30
微晶纤维素65-90；
其中所述蛋黄粉为颗粒或粉末状。
本发明中蛋黄液为20-30，例如可以是20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30。
本发明中微晶纤维素为65-90，例如可以是65、66、68、70、72、74、75、76、78、80、82、85、86、88或90。
优选地，所述蛋黄粉的原料中的蛋黄液：微晶纤维素按质量比例为1:2-4。
优选地，所述蛋黄液为经抗原免疫后得到的含特异性抗体的蛋黄液。
优选地，所述蛋黄液中的卵黄抗体的效价≥1:12400。
优选地，所述抗原为pira和pirb。
本发明中，所述的pira和pirb作为一种毒素蛋白，通过基因工程手段从副溶血弧菌中获得，作为一种特异性可产生特异性抗体的蛋白，其作为抗原能够针对抗急性肝胰腺坏死综合症，相比于直接用副溶血弧菌作为抗原，以pira和pirb蛋白作为抗原，专一性更强，抗性更强，效率更高。
优选地，所述pira蛋白的氨基酸序列包含如seqidno.1所示片段，所述序列如下：
优选地，所述pirb蛋白的氨基酸序列包含如seqidno.2所示片段，所述序列如下：
本发明中，所述pira和pirb蛋白的氨基酸序列是特异性的产生特异性的抗体针对急性肝胰腺坏死综合症，灵敏度高，效果显著。
第二方面，本发明提供一种制备如第一方面所述的蛋黄粉的制备方法，所述方法包括如下步骤：
(1)将收集的免疫蛋进行清洁消毒，再进行破蛋处理，分离蛋黄和蛋清，再将蛋黄过滤去除杂质，得到蛋黄液；
(2)将步骤(1)的蛋黄液与微晶纤维素按配方量加入低速搅拌机中，充分混匀；
(3)将混匀后的混合物经湿法制粒机挤压、滚圆得到湿的混合物颗粒；
(4)将湿的混合物颗粒加入流化床中干燥；
任选地，将干燥的混合物颗粒粉碎后过筛网进行筛滤。
优选地，步骤(2)所述低速搅拌机的速度为为5-10r/min，例如可以是5r/min、5.5r/min、6r/min、6.5r/min、7r/min、7.5r/min、8r/min、8.5r/min、9r/min、9.5r/min或10r/min，优选6-9r/min，更优选8r/min。
优选地，步骤(4)所述的干燥温度为55-65℃，例如可以是55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃或65℃，优选为57-62℃。
优选地，所述免疫蛋的制备包括以下步骤：
(1a)制备所述pira和pirb蛋白抗原；
(1b)使用所述pira和pirb蛋白抗原及费氏佐剂，对产蛋禽类进行注射免疫，检取免疫禽类所产的免疫蛋。
优选地，所述步骤(1a)具体包括：
(a)通过pcr扩增技术获得所述pira和pirb的基因序列，并将pira和pirb的基因序列重组到表达载体中，构建重组载体；
(b)将重组载体转化到克隆菌种，筛选含有所述pira和pirb基因序列的阳性转化菌；
(c)从所述阳性转化菌中提取所述重组载体，并转化到表达菌中，得到含有所述pira和pirb基因序列的阳性表达菌，对所述阳性表达菌扩大培养，诱导所述pira和pirb蛋白表达；
(d)分离纯化所述pira和pirb蛋白。
本发明的pira和pirb蛋白可以通过在适当的宿主中表达得到，也可以通过常规肽合成技术化学合成得到，优选的是在适当的宿主中表达得到。
优选地，步骤(1b)所述免疫产蛋禽类的方法为将纯化后的pira和pirb的重组抗原与弗氏佐剂按1:1混合乳化3-5h，进行四点肌肉注射免疫产蛋禽类。
优选地，所述注射免疫进行五次，第三次免疫后的第二周开始收集鸡蛋，并测定抗体效价。
优选地，注射免疫具体包括：第一次免疫后隔两周进行第二次免疫，再隔两周进行第三次免疫，隔一个月后进行第四次免疫，最后隔40天进行第五次免疫；通过蒸馏水及硫酸铵溶液稀释，然后沉淀并透析等方法提取所述igy，用间接竞争elisa检测igy的效价。
优选地，所述制备方法包括如下步骤：
(1)将收集的免疫蛋进行清洁消毒，再进行破蛋处理，分离蛋黄和蛋清，再将蛋黄过滤去除杂质，得到蛋黄液；
其中，免疫蛋制备的具体步骤如下：
(1a)制备所述pira和pirb蛋白抗原，具体步骤如下：
(a)通过pcr扩增技术获得所述pira和pirb的基因序列，并将pira和pirb的基因序列重组到表达载体中，构建重组载体；
(b)将重组载体转化到克隆菌种，筛选含有所述pira和pirb基因序列的阳性转化菌；
(c)从所述阳性转化菌中提取所述重组载体，并转化到表达菌中，得到含有所述pira和pirb基因序列的阳性表达菌，对所述阳性表达菌扩大培养，诱导所述pira和pirb蛋白表达；
(d)分离纯化所述pira和pirb蛋白；
(1b)使用所述pira和pirb蛋白抗原及费氏佐剂，对产蛋禽类进行注射免疫，检取免疫禽类所产的免疫蛋，具体步骤如下：
免疫产蛋禽类的方法为将纯化后的pira和pirb的重组抗原与弗氏佐剂按1:1混合乳化3-5h，进行四点肌肉注射免疫产蛋禽类；
所述注射免疫进行五次，第三次免疫后的第二周开始收集鸡蛋，并测定抗体效价；
(2)将步骤(1)的蛋黄液与微晶纤维素按配方量加入转速为5-10r/min的低速搅拌机中，充分混匀；
(3)将混匀后的混合物经湿法制粒机挤压、滚圆得到湿的混合物颗粒；
(4)将湿的混合物颗粒加入流化床中55-65℃下干燥；
任选地，将干燥的混合物颗粒粉碎后过筛网进行筛滤。
第三方面，本发明提供一种饲料，所述饲料包含如第一方面所述的蛋黄粉。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明免疫蛋中的卵黄抗体效价高，制备的蛋黄粉具有高效预防的特点，有效应对急性肝胰腺坏死综合症；
(2)微晶纤维素与蛋黄液充分混合也使得蛋黄抗体能被微晶纤维素有效包裹，增强了蛋黄抗体对胃肠道中酶和ph值的抵抗作用，从而使其能以口服的方式更有效地发挥抗体效果；不仅如此，微晶纤维素在起到降低水分含量的同时作为饲料添加剂的成分可以起到帮助胃肠道消化以及排便的功能，能进一步改善胃肠道的消化功能，促进所饲动物的生长；
(3)本发明的蛋黄粉制备过程中干燥温度仅为55-65℃，而且干燥时间也控制在1h左右，能有效避免蛋黄抗体因在过高温度里长时间处理而导致蛋黄抗体活性受损，最终影响产品效果。此外干燥时间较短也有利于提高产品的生产效能，增加产业化的效益。
具体实施方式
为更进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合本发明的优选实施例来进一步说明本发明的技术方案，但本发明并非局限在实施例范围内。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
实施例1：制备pira和pirb蛋白
(1)副溶血性弧菌pira和pirb基因的克隆，表达载体的构建及鉴定
(a)根据副溶血性弧菌pira和pirb基因的序列设计引物：
其中，所述pira基因序列的pcr扩增引物为：
上游引物：5’-cgcggatccatgagtaacaatataaaacatgaaac-3’，其中下划线部分为bamhi酶切位点；
下游引物：5’-cccgcggccgcttagtggtaatagattgtacagaaa-3’，其中下划线部分为noti酶切位点。
其中，所述pirb基因序列的pcr扩增引物为：
上游引物：5’-cgcggatccatgactaacgaatacgttgtaacaa-3’，其中下划线部分为bamhi酶切位点；
下游引物：5’-cccgcggccgcctacttttctgtaccaaattcatcg-3’，其中下划线部分为noti酶切位点。
采用常规小量细菌dna提取方法即碱裂解法提取副溶血性弧菌的质粒。
pcr扩增：以提取的质粒为模板进行pcr扩增，反应体系如下：
设置一组以水为样本的阴性对照。
反应条件如下：
所获得pcr产物进行1.2％的琼脂糖凝胶电泳鉴定并用胶回收试剂盒(qiaquickgelextraction)纯化。采用takarapmd18-tkit参照说明书体系进行连接。
(b)验证，将得到的pira和pirb基因序列进行转化并克隆验证；具体地，所述转化为取10ul连接产物加至100uldh5α感受态细胞中，冰上放置30min，42℃热激30s，立即冰上冷却2min。加入890ullb培养基。37℃培养1h。
采用蓝白斑初步筛选克隆，取40ulx-gal和8uliptg混合均匀后涂布于氨苄抗性培养基上，室温静置干燥，于其上涂布100ul转化培养菌夜，37℃过夜培养。
具体地，所述pcr验证m13引物，对经过夜培养后的透明无色单菌落进行pcr，具体如下：
标记平板上的预选的单菌落，用枪头依次挑取单菌落重悬于10ul灭菌去离子水中，沸水10min处理。12000g离心1min，取上清为模板，pcr体系如下：
设置一组以水为样本的阴性对照。
反应条件如下：
所述酶切采用将过夜培养的菌夜采用试剂盒的提取的方法纯化质粒，电泳检测无误后进行双酶切，酶切体系如下：
同时酶切pet28a质粒，作为阴性对照，酶切温度为37℃，时间1h。所获得酶切产物进行1.2％的琼脂糖凝胶回收目的条带。
(b)通过同源重组法，将连接产物重组到表达载体体pet-28a(+)(购自takara公司)中，构建重组载体；将所述重组载体转化到克隆菌dh5α大肠杆菌中，筛选含有所述pira和pirb基因序列的阳性转化菌；具筛选可以通过x-gal等方法筛选含有所述pira和pirb基因序列的阳性转化菌；
具体地，将上述中回收到的目的片段和载体进行连接。采用takarat4连接酶体系如下：
按上述方法将连接产物转化到dh5α感受态，并在lb(kan+)平板进行培养，37℃过夜，挑取单菌落进行pcr鉴定。
(c)从所述阳性转化菌中提取所述重组载体，pcr验证并酶切验证，验证基因片段的大小，证明pcr得到的序列正确。将所述测序证明正确的重组载体转化到表达菌bl21大肠杆菌中，得到含有所述pira和pirb基因序列的阳性表达菌；
具体地，挑取6个单菌落37℃过夜培养。将过夜培养的菌液以1:100的比例加入5mlamp+lb培养基中，37℃220rpm培养2h。取出1ml菌液作为未诱导对照，其余按照体积加入iptg至终浓度为0.4mm，37℃180rp培养4h。取1ml菌液12000g离心10min，弃上清，用100ul去离子水重悬沉淀，加入等体积的2×sdsloadingbuffer，沸水浴10min，取上清用12％sds-page电泳检测。
将经检测诱导成功的菌株扩大培养和诱导，将过夜培养的菌液1:100稀释至200ml新鲜lb培养基中，按照上述诱导条件对其进行诱导。
经诱导后的菌液12000g离心10min，收集菌体。以1/10体积的裂解缓冲液重悬菌体，超声破碎，控制功率200w，工作条件为超声4s暂停10s90次，以冰浴降温，重复3次以彻底破碎细菌。将经超声破碎处理的菌液12000g离心10min后，分别取上清和沉淀经12％sds-page验证蛋白表达方式。
(d)分离纯化所述pira和pirb蛋白，具体地，可以通过ni-nta柱亲和层析纯化等方式分离纯化所述pira和pirb蛋白。
具体地，可以采用ge公司的ni-nta亲和层析预装柱(nisepharosehighperformance)按照产品说明书纯化目的蛋白pira和pirb。实验中，以50-100cm/h的线性流速用蒸馏水洗5个柱体积，以150cm/h的线性流速用6个柱体积的结合缓冲液平衡柱子，然后加入预处理过的样品，用缓冲液洗涤，直到吸收达到基线。采用逐步洗脱法用洗脱缓冲液洗脱，收集各阶段样品，sds-page检测蛋白纯化效果。
实施例2：免疫蛋鸡及高免蛋的收集
免疫，将pira和pirb蛋白作为抗原与等体积的费氏佐剂混合，采用皮下多点注射免疫蛋鸡；
具体地，测定纯化后毒素蛋白的浓度，用pbs将纯化后的重组蛋白的浓度调整至0.01～0.1mg/ml，将调整后的重组蛋白与佐剂按照1:1比例相混合后按照公司特有的五次两途径免疫的方式免疫蛋鸡。第一次免疫为1ml重组蛋白与1ml弗氏完全佐剂充分混合后进行胸肌四点注射，两周后用0.5ml重组蛋白与0.5ml弗氏不完全佐剂充分混合后进行胸肌四点注射免疫。两周后再次重复以上操作，但免疫总剂量改为1.5ml。第四次免疫为一个月以后，采用0.75ml重组蛋白与0.5ml弗氏不完全佐剂充分混合后进行翅静脉注射免疫。40天后重复以上操作。至此一共五次免疫完成。；第三次免疫结束7天后开始收集鸡蛋提取纯化igy。
将鸡蛋内的卵黄抗体的效价采用下述方法进行测定：
用pir毒素蛋白包被酶标板，4℃过夜。将包被好的板用pbs-t洗涤3次，3min/次。将1％bsa各加200ul到抗原包被的板孔内，37℃孵育1.5h。移出各孔内液体，用pbs-t洗涤3次，3min/次。待检抗体经特定稀释度稀释后分别加样100ul；阴性对照稀释后在阴性孔加入100ul；37℃孵育1h。移出各孔内液体，用pbs-t洗涤3次，3min/次。二抗hrp羊抗鸡igg经1：3000稀释后，每孔加入100ul。移出各孔内液体，用pbst洗涤3次，3min/次。各反应孔加入100ultmb显色液，37℃孵育15分钟。各反应孔加入100ul1mhcl，终止反应。酶标仪测定结果。
本发明取得的鸡蛋中的抗体效价为：1:12500-1:48300。
实施例3：蛋黄颗粒的制备
(1)将收集的免疫蛋进行清洁消毒，再进行破蛋处理，分离蛋黄和蛋清，再将蛋黄过滤去除杂质，得到蛋黄液；
(2)将步骤(1)的蛋黄液与微晶纤维素按质量比1:4加入低速(5-10r/min)搅拌机中，充分混匀；
(3)分批将混合物加入滚圆机，在孔径4.5mm，转速50r/min下缓慢加入步骤(2)中制备得到的混合物，挤压机出孔处挤出表面光滑的较长的连续条状固体的半成品。将半成品收集加入滚圆机进行滚圆处理，时间约为1min，处理转速初始为200r/min，然后迅速降为50r/min。进风温度为65℃，物料温度45℃，待物料表面干燥脆化后滚圆，转速1200r/min；
(4)将经挤压滚圆处理后的圆柱形颗粒固体置于流化床中进行干燥处理，进风温度设置为55-65℃，物料温度设定为45℃。干燥风速约2.6m/s，干燥风量约58.2m3/s，流化风速为13.2m/s，流化风量约75.0m3/s，流化风机转速为1600r/s。当物料温度达到40℃以上时说明制得的产品已经干燥完成；
(5)添加一定比例的抗氧化剂和防腐剂后，将得到的成品通过包装机包装在避光真空包装袋中。
实施例4：蛋黄粉的制备
通过实施例3制备得到蛋黄颗粒后，向清洗干净的粉碎机进料口中加入干燥后的蛋黄颗粒，在出料口加置底部封口的收集袋进行样品收集。根据进料后粉碎机处理样品的情况(依据粉碎机齿轮声音判断其加样多少)进行加样控制。
对粉碎得到的蛋黄粉通过80目的筛网进行筛滤，除去颗粒较大的不满足需求的蛋黄粉。
实施例5：蛋黄粉饲料的喂食
本实施例涉及以制备得到的鸡蛋黄粉拌饲断奶仔猪，研究该产品对断奶仔猪的腹泻的生长的影响。
本实验在深圳市光明集团光明种猪场进行，共进行10天饲喂试验。随机设立实验组及对照组仔猪，其中为每种组成的饲料产品设立1个实验组以及1个重复实验组。选取来源相同、饲养管理条件相近的母猪所产刚断奶光明系仔猪共430头，使各组仔猪性别比例和体重基本一致。每组仔猪数目为45头，在不同临近猪栏饲喂。对照组按照猪场正常管理进行教槽料的饲喂，实验组分别以0.5％比例在教槽料中添加依据上述专利方法制备得到的蛋黄粉饲料。
饲喂实验
3组仔猪由专人饲养于的同一栋舍内。预试期1d，再进行饲养试验，正试期为14d。
仔猪自由采食、饮水，采用相同常规饲养管理方法和免疫程序进行疾病预防。每天早上9:00点清槽并计算前一天的采食量，下午15:00对粪便进行观察打分并计算当天腹泻头数。除了每天详细记录各组别的腹泻发生情况以及饲料进食情况以外，还分别于试验第1天和最后1天早上9:00空腹称重，记录各组猪始重和末重。试验中记录各组耗料量、平均日增重、料重比、腹泻率。腹泻率的计算公式：腹泻率(％)＝(腹泻头数×腹泻天数)/(总头数×饲养天数)×100％。
结果与分析
表1蛋黄粉对断奶仔猪生长性能的影响
表1的结果说明蛋黄粉能有效降低断奶仔猪饲喂的料重比，提高经济效益。同时还能显著降低断奶仔猪的腹泻率，有利于提高仔猪存活率和生长速度。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
sequencelisting
<110>深圳市宝舜泰科技产业股份有限公司
<120>一种蛋黄粉、其制备方法及应用
<130>2015
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435