含中药材提取物的动物饲料组合物的制作方法

本发明涉及动物饲料组合物，尤其涉及一种含中药材提取物的动物饲料组合物。

背景技术：

当今时代，人类或动物吃的蔬菜或饲料由于重茬的灾害导致的微量元素缺乏和环境污染导致疾病不断增多，因此普遍在直接或间接地过多服用抗生剂等药物，对抗生剂产生耐药性的病毒及细菌对人类与动物造成更多危害。

经表明，特别是家畜缺乏微量元素而出现生殖障碍无法正常繁殖等，当缺乏微量元素的情况下对人类或动物的健康有害。因此，目前结合各种因素开发动物饲料供给家畜。相关技术文献参见韩国授权专利第10-0863607号。

另外，随着当前高龄化，骨质疏松症、骨折、关节炎等骨质疾病呈急剧上升趋势。生体总是通过造骨细胞的骨形成和破骨细胞的骨吸收达到平衡以保持体内平衡。骨质疏松症是因造骨细胞与破骨细胞失衡，破骨细胞的骨吸收比造骨细胞的骨形成占据优势而发生的疾病，目前已知的造成骨质疏松症的原因有闭经等女性卵巢功能低下引起的雌性激素缺乏、老化及运动不足、类固醇系列药物的副作用等。因此，为了有效治疗或预防骨质疏松症，需要增加造骨细胞的活性或抑制诱发骨吸收的破骨细胞的活性。

因此，需要研究含有人类或动物缺乏的营养素的物质或者能够预防可能在人类或动物发生的疾病的物质。

技术实现要素：

技术问题

本发明的目的在于提供一种能够有效预防或治疗骨相关疾病的含有中药材提取物的动物饲料组合物。

技术方案

为达成上述目的，本发明的一个实施例公开一种将含有干食用蛙、女贞子及熟地黄的中药材提取物作为有效成分的动物饲料组合物。

技术效果

根据本发明一个实施例的将中药材提取物作为有效成分的动物饲料组合物对预防及治疗骨质疏松症、关节炎、骨折、骨软化症等骨相关疾病方面具有非常好的效果。

并且，根据本发明一个实施例的动物饲料组合物抑制负责骨吸收的破骨细胞的分化，因此对预防及治疗骨质疏松症等骨质疾病具有非常好的效果，能够作为动物用饲料的添加剂。

附图说明

图1为显示与本发明一个实施例相关的动物饲料组合物中所含中药材提取物(dbt)对破骨细胞分化因子(rankl)诱导破骨细胞分化方面的效果的示意图；

图2为显示与本发明一个实施例相关的动物饲料组合物中所含中药材提取物(dbt)抑制破骨细胞生成的效果的示意图；

图3为显示与本发明一个实施例相关的动物饲料组合物中所含中药材提取物(dbt)抑制破骨细胞的骨吸收的效果的示意图；

图4为显示与本发明一个实施例相关的动物饲料组合物中所含中药材提取物(dbt)抑制破骨细胞的trap表现的效果的示意图；

图5为显示与本发明一个实施例相关的动物饲料组合物中所含中药材提取物(dbt)抑制破骨细胞的mmp-9表现的效果的示意图；

图6为显示与本发明一个实施例相关的动物饲料组合物中所含中药材提取物(dbt)抑制破骨细胞的组织蛋白酶k(cathepsink)表现的效果的示意图；

图7为显示与本发明一个实施例相关的动物饲料组合物中所含中药材提取物(dbt)抑制破骨细胞的nfatc1表现的效果的示意图；

图8为显示与本发明一个实施例相关的动物饲料组合物中所含中药材提取物(dbt)抑制破骨细胞的c-fos表现的效果的示意图；

图9为显示与本发明一个实施例相关的动物饲料组合物中所含中药材提取物(dbt)的细胞毒性结果的示意图。

具体实施方式

以下说明与本发明一个实施例相关的含中药材提取物的动物饲料组合物及其制造方法。

本说明书中所使用的单数表现形式在说明书无其他明确说明的情况下还包括复数表现形式。在本说明书中，“构成”或“包括”等术语不应理解为必须包括所有说明书中记载的各构成要素或各步骤，而是应理解为可以不包括其中部分构成要素或部分步骤，或理解为还可以包括其他构成要素或步骤。

本发明一个实施例的动物饲料组合物中所含中药材提取物可通过多种方法提取得到。

具体地，包括蛙在内的多种成分的中药材提取物可通过冷水提取、热水提取、有机溶剂提取或蒸馏等方法提取得到。关于提取的所述提取液，可以直接使用所述中药材提取物，也可以减压浓缩或冻结干燥提取的所述提取液制备中药材提取物。

例如，通过选自水、低级酒精及其混合溶液构成的群的溶剂提取获得中药材提取物。本发明一个实施例的中药材提取物不仅可以表示使用水或特定溶剂从中药材提取获得的物质本身，还可以表示通过菌株发酵提取获得的所述物质或用乙醚等有机溶剂进一步细分提取或通过柱(column)划分等加工处理得到的提取加工物等。

所述中药材可含如下成分。

所述中药材可含干食用蛙。所述食用蛙味甘性凉。并且，所述食用蛙具有去热解毒、补虚、补气、利尿消肿之功效。并且，所述食用蛙可消除因疲劳、体力下降引起的火，解决血中牢固凝结部分，消除血中燥热，对生长缓慢的动物(例如：猪)效果显著。并且，所述食用蛙对急性腹胀、痈及阴部疖肿治疗也效果显著。

所述中药材还可以包括女贞子、鸡血藤及红花子中至少一种，相对于所述干食用蛙1重量份，其比例分别为1.5至3.5重量份。

所述中药材还可以包括熟地黄、黄芪、白术、杜冲、五加皮、牛膝、秦艽、金毛狗脊、补骨脂、骨碎补、续断、锁阳、仙茅及饴糖中至少一种，相对于所述干食用蛙1重量份，其比例分别为0.5至1.5重量份。

所述中药材还可以包括独活及羌活中至少一种，相对于所述干食用蛙1重量份，其比例分别为0.2至1.5重量份。

所述中药材还可以包括菟丝子、蛇床子、贡砂仁、桂枝及甘草中至少一种，相对于所述干食用蛙1重量份，其比例分别为0.1至1.3重量份。

具体可如下制备：

首先，可以筛选上述包括食用蛙在内的多种中药成分中至少一部分并制成适当大小。对于制成的所述中药材，可以以重量为基准用约1至50倍分量的水、乙醇、甲醇等c1至c4的低级酒精或其混合溶剂通过在例如5℃至100℃进行约1至100小时的搅拌提取、热汤提取、冷浸提取，回流提取或超声波提取等提取方法对获得的提取液进行过滤、浓缩或干燥得到中药材提取物。必要的情况下可以用水或低级酒精、乙醚等有机溶剂对所述提取物进行进一步提取并使用。

本发明一个实施例的中药材提取物能够有效阻碍破骨细胞的分化。并且，本发明一个实施例的中药材提取物抑制负责骨吸收的trap、mmp-9、组织蛋白酶k(cathepsink)的表现，能够抑制破骨细胞的分化与活性增加时出现的nfatc1、mitf等遗传基因的表现。

另外，本发明一个实施例的中药材提取物可通过制造将沉香提取物作为有效成分的药物组合物或功能性食品的一般剂型化方法制得。此处，中药材提取物中除沉香提取物之外还可以根据需要含有多种辅助生药材、维生素、矿物质、膳食纤维及其他医用-食品用辅助剂(例如，赋形剂、增强剂、涂层剂等)等。

破骨细胞(osteoclast)是造血母细胞的单核衍生细胞，其与成骨细胞(osteoblast)共同对骨生长、骨材形成及治愈骨折起到重要作用。破骨细胞分化所需因子有核因子kb受体活化因子配体(receptoractivatorofnuclearfactorkappabligand；rankl)、肿瘤坏死因子α(tumornecrosisfactorα；tnfα)、nf-kb、odf(osteoclastdifferentiationfactor)等。

尤其，rankl是破骨细胞分化必不可少的因子。老鼠的raw264.7单核球细胞通过rankl(receptoractivatorofnuclearfactorkappabligand)融合并分化为多核破骨细胞(multinucleatedosteoclast)。rankl分泌于活性化的造骨细胞或骨髓干细胞或成纤维细胞且与位于破骨前体细胞及破骨细胞表面的rank(receptoractivatorofnuclearfactorkappab)结合促进mapk的活性，叫做nf-kb的转录因子进入核内增加与破骨细胞分化相关的遗传因子即trap(tartrate-resistantacidphosphatase)、mmp-9(metalloproteinase-9)、组织蛋白酶k(cathepsink)等的表现使得吸收骨。并且，分化的破骨细胞通过traf6(tnfassociatedfactor6)及c-fos信号传递使得nfatc1(nuclearfactorofactivatedtcell1)之类的转录因子活性化。

破骨前体细胞通过这些一连的分化过程形成破骨细胞，形成的破骨细胞能够通过trap、mmp、组织蛋白酶k(cathepsink)等的作用吸收骨诱发骨质疏松症。

本发明一个实施例的动物饲料组合物含中药材提取物等，因此能够有效抑制破骨细胞分化，用于骨质疏松症的预防或治疗。

所述动物饲料组合物可将中药材提取物作为其有效成分，可通过本领域公知的药品制备方法添加药学上允许的载体。

所述可使用载体例如可以是乳糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、木糖醇、赤藓糖醇、麦芽糖醇、淀粉、洋槐胶(acaciagum)、藻酸胶、明胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羟苯甲酯、羟苯丙酯、滑石粉、硬脂酸镁及矿物油等，但本发明不限于此。

并且，所述脂肪酶抑制剂还可以包括填充剂、抗凝剂、润滑剂、润湿剂、香料、乳化剂或防腐剂等。本发明一个实施例的动物饲料组合物可以分别根据通常的方法剂型化成散剂、颗粒剂、锭剂、胶囊剂、悬浊液、乳剂、糖浆、气雾剂等口服型剂型、外用剂、栓剂及灭菌注射溶液的形态使用。

本发明的含中药材提取物的所述动物饲料组合物还可以为了预防或治疗骨质疏松症、骨关节炎而临床使用。关于向患者投入的所述中药材提取物的投入量、投入次数及投入时间等，可以根据患者的性别、年龄、状态、体重、环境等条件选择性地加减调节。但是，一般可以一日投入三次且具体在各餐之间投入，可以按0.1mg至2000mg的量分一至数次投入。

本发明一个实施例的功能性食品含中药材提取物等，因此能够在骨质疏松症、骨关节炎等方面发挥改善效果。本说明书中所指的食品不仅包括可直接摄取状态的食品，还包括食材、食品添加剂、食品材料等的概括性概念。所述功能性食品可单独直接添加所述中药材提取物使用，但也可以添加用于预防、治疗骨质疏松症的已知物质或新型物质及有助于骨骼健康的公知物质或新型物质以增强作用。并且，可以使用食用色素、食用香料、生药草、水果、低聚糖、酮酸、柠檬酸等一般添加剂使得味道及香气宜人。

含所述中药材提取物的功能性食品可包括饼干类、冰淇淋制品类、乳加工品类、肉制品类、鱼肉制品类、面类、饮料、调味食品、人造黄油、起酥油、披萨等。

所述饼干类包括面包、饼类、干果类、糖类、巧克力类、口香糖、果酱类等，所述冰淇淋制品类可包括冰淇淋类、冰果类、冰淇淋粉末类等。

所述乳加工品类可包括牛乳类、低脂肪牛乳类、乳糖分解牛乳、加工乳类、山羊奶、发酵乳类、脱脂乳类、酸牛奶类、精制奶油类、脱脂乳、天然奶酪、加工奶酪、奶粉类、乳清类等。

所述肉制品类可包括肉加工品、蛋加工品、汉堡等，鱼肉制品类可包括鱼饼、火腿、香肠、腊肉等。

所述面类可包括拉面类、干面类、生面类、即时炒面类、豪华干面类、改良熟面类、冷冬面类、意大利面类等，所述饮料可包括水果饮料、蔬菜类饮料、碳酸饮料、豆乳类、酸奶等乳酸菌饮料、混合饮料等。并且，所述调味食品可包括酱油、大酱、辣椒酱、甜面酱、清国酱、混合酱、食醋、沙司类、番茄酱、咖喱、调味品等。

并且，与本发明一个实施例相关的含中药材提取物的动物饲料组合物可制成固型丸、液态饲料、半固态浆形态。

以下具体说明与本发明一个实施例相关的实验例。以下实验例是为帮助理解本发明而提供的，本发明的范围不受这些实施例的限制。以下实验例将用dbt表示中药材提取物。

1.中药材提取物(dbt)的制备

将含干食用蛙的中药材碾碎成小块后在30％乙醇5l、耗时三小时重复三次回流提取操作后，浓缩提取液获得中药材提取物(dbt)。获得率为17.3％。

2.破骨细胞分化实验

1)培养raw264.7细胞

利用dmem(dulbecco'smodifiedeaglemedium)/10％fbs(fetalbovineserum)/pc-sm培地在co2细胞培养基培养raw264.7细胞，细胞数为5x103细胞/孔(5x103cells/well)，利用96孔板(96wellplate)进行培养。培养24小时后丢弃培养液并换成添加有10％fbs、50ng/mlrankl、1ng/mltgfb的a-mem培养细胞。向培养液添加了各种浓度的中药材提取物(dbt)。每两天换一次相同的培地进行了培养。

2)破骨细胞分化及生成测定

用rankl将raw264.7细胞诱导到破骨细胞后，染色被公认为成熟破骨细胞的表现标志(marker)的抗酒石酸盐酸性磷酸酶(tartarate-resistanceacidphosphatase；trap)确认了trap-positive细胞。用pbs清洗两次分化的细胞，用3.7％甲醛-柠檬酸盐-丙酮(formaldehyde-citrate-acetone)溶液固定10分钟并用蒸馏水清洗两次。用包括按相同比例混合2％trap快速的石榴石(fastgarnet)gbc碱溶液与nano3溶液得到的溶液与5％石脑油as-bi磷酸(naphthaas-biphosphoricacid)、4％醋酸(aceticacid)、2％酒石酸(tartaricacid)的溶液对固定的细胞进行处理并在常温放置30分钟以上。用光学显微镜进行观察并计数核为三个以上的trap阳性(trap-positive)多核细胞(trap(+)mncs)计数并作为破骨细胞生成指标。

图1为显示与本发明一个实施例相关的动物饲料组合物中所含中药材提取物(dbt)在破骨细胞分化因子(rankl)诱导破骨细胞分化方面的效果的示意图。

如图所示，用rankl处理的情况下促进了破骨细胞分化，本发明一个实施例的中药材提取物(dbt)抑制trap(+)mncs的形成从而显著抑制破骨细胞分化。由此可知本发明一个实施例的中药材提取物(dbt)具有通过抑制破骨细胞的分化阻断骨吸收的效果。

3)破骨细胞功能的测定

关于破骨细胞的活性，通过测定trap活性测定了抑制与否。测定trap活性方面使用了从sigma公司购买的成套工具(sigma-387a)。将trap活性换算为吸光度值对于对照群的比例表示，通过t-test验证了有意性(*p<0.05，**p，0.01，***p，0.001)。

图2为显示与本发明一个实施例相关的动物饲料组合物中所含中药材提取物(dbt)抑制破骨细胞生成的效果的示意图。

如图所示，图2为显示中药材提取物(dbt)抑制参与破骨细胞的骨吸收的抗酒石酸盐酸性磷酸酶(tartarate-resistanceacidphosphatase；trap)的活性的效果的坐标图。由此可知本发明一个实施例的中药材提取物(dbt)通过显著抑制trap的活性有效抑制破骨细胞的活性。

4)破骨细胞遗传基因表现的测定

(1)分离总rna

为分离rna而去除培养细胞培地后用磷酸盐缓冲液(4pbs)清洗(washing)了三次。收集细胞后在750×g离心分离10分钟，然后用冰凉pbs(icecoldpbs)清洗两次。向沉淀的细胞添加裂解缓冲液(lysisbuffer)溶解后在12,000×g离心分离10分钟取用上层。再次放在含1m蔗糖(sucrose)的三羟甲基氨基甲烷缓冲液(trisbuffer)上后在36,000rpm离心分离160分钟。取多核糖体丸(polysomepellet)溶解在十二烷基磺酸钠缓冲液(sdsbuffer)后在37℃孵化(incubation)30分钟。添加醋酸钠缓冲液(sod.acetatebuffer)后用苯酚/cskl3溶液提取。添加nacl至0.2m后添加etoh并在-20℃保管12小时。用75％etoh清洗两次沉淀物后进行干燥。调整遗传基因表现所需rna量使得对照群与试验群中mrna量相同后用电泳确认并使用。

(2)cdna的制备

向分别从对照群及试验群分离的总rna液10μl(含10ugrna)添加低聚糖(oligo)dt1μl(2ug/μl)后小心地混合，然后在90℃孵化(incubation)五分钟。在室温放置约10分钟使得引物(primer)退火(annealing)后保持在4℃并添加试剂。添加5x塞克利缓冲液(cyscriptbuffer)4μl、0.1m二硫苏糖醇(dtt)2μl、dutp混合核苷酸(nucleotidemix)1μl、dutpcydye标记核苷酸(cydye-labellednucleotide)0.1μl、塞克利逆转录酶(cyscriptreversetranscriptase)1μl、h2o0.9μl使得达到20μl后小心翼翼地用手倾斜(tipping)混合。之后在42℃孵化(incubation)90分钟后放置在冰上。此处，各添加2μl的2.5mnaoh后在37℃孵化(incubation)15分钟，添加10μl的2m羟乙基哌嗪乙硫磺酸缓冲液(hepesbuffer)(freeacid即游离酸)进行中和。各试剂购自amershambioscience。

(3)实时定量聚合酶链反应(realtimepolymerasechainreaction)(实时定量pcr；realtime-pcr)

向各光学管(opticaltube)(optical96-wellreactionplatewithbarcodeandopticaladhesivefilms，appliedbiosystems，cat.no.4314320)添加三倍的sybrgreenmix2.5μl(sigma-aldrich，cat.no.s9430)、上述合成的cdna1μl、10pmol/μl一对引物组合(primerpairmix)1μl、2.5mm的dntp2μl，10xtag聚合酶的缓冲(polymerasebuffer)2.5μl，标签聚合酶(tagpolymerase)0.3μl与14.7μlh2o，并放大到95℃5分钟1周期，95℃30秒，45℃30秒，72℃60秒40周期，95℃20分钟1周期。引物(primer)利用了在反转录酶-聚合酶链锁反应(rt-pcr)使用的物质。结束聚合酶链反应(pcr)后取出管，然后用反应液5μl在3％琼脂糖凝胶(agarosegel)测定聚合酶链反应特异性(pcrspecificity)，用7000序列检测系统(sequencedetectionsystem)(appliedbiosystems，cat.no.4349157)分析了实时定量pcr(realtimepcr)结果。

用于pcr的primer如下表1所示。

【表1】

图3为显示与本发明一个实施例相关的动物饲料组合物中所含中药材提取物(dbt)抑制破骨细胞的骨吸收的效果的示意图。

图3所示坐标图为中药材提取物(dbt)对参与破骨细胞的骨破坏的trap的活性的抑制效果。

图4为显示与本发明一个实施例相关的动物饲料组合物中所含中药材提取物(dbt)抑制破骨细胞的trap表现的效果的示意图。

由图4所示坐标图可知对破骨细胞的trap表现抑制效果随着中药材提取物(dbt)的量增加而增大。

图5为显示与本发明一个实施例相关的动物饲料组合物中所含中药材提取物(dbt)抑制破骨细胞的mmp-9表现的效果的示意图。

由图5可知对破骨细胞的mmp-9表现抑制效果随着中药材提取物(dbt)的量增加而增大。

图6为显示与本发明一个实施例相关的动物饲料组合物中所含中药材提取物(dbt)抑制破骨细胞的组织蛋白酶k(cathepsink)表现的效果的示意图。

由图6所示坐标图可知对破骨细胞的组织蛋白酶k(cathepsink)表现抑制效果随着中药材提取物(dbt)的量增加而增大。

图7为显示与本发明一个实施例相关的动物饲料组合物中所含中药材提取物(dbt)抑制破骨细胞的nfatc1表现的效果的示意图。

由图7所示坐标图可知对破骨细胞的nfatc1表现抑制效果随着中药材提取物(dbt)的量增加而增大。

图8为显示与本发明一个实施例相关的动物饲料组合物中所含中药材提取物(dbt)抑制破骨细胞的c-fos表现的效果的示意图。

由图8所示坐标图可知对破骨细胞的c-fos表现抑制效果随着中药材提取物(dbt)的量增加而增大。

图9为显示与本发明一个实施例相关的动物饲料组合物中所含中药材提取物(dbt)的细胞毒性结果的示意图。

由图9所示坐标图可知细胞的毒性不随中药材提取物(dbt)的量增加而增大。

如上所述，动物饲料组合物中所含中药材组合物由向安全、效果好的天然药材添加食用蛙的中药材构成，对骨代谢性疾病的治疗及预防效果显著。

如上所述，本发明一个实施例的将中药材提取物作为有效成分的动物饲料组合物对骨质疏松症、关节炎、骨折、骨软化症等骨相关疾病的预防或治疗具有非常好的效果。

并且，根据本发明一个实施例的动物饲料组合物抑制负责骨吸收的破骨细胞的分化，因此对预防及治疗骨质疏松症等骨质疾病具有非常好的效果，能够作为动物用饲料的添加剂。

以上说明的含中药材提取物的动物饲料组合物及其制备方法不局限于上述说明实施例的构成及方法，可以通过所有实施例或选择性地组合其中一部分实施例对所述实施例进行多种变形。