一种利用SPE小柱提取茶汤香气物质的方法与流程

本发明属于茶产品风味研究技术领域，具体涉及一种利用spe小柱提取茶汤香气物质的方法。

背景技术：

茶叶是以茶树(camelliasinensisl.)的嫩芽或叶为原料，经特殊加工工艺制成。茶是全球除水以外消费量最大的饮料，具有重要的经济价值。茶汤是茶叶经沸水冲泡形成的水溶液。茶汤中的香气物质主要是一些挥发性物质，茶汤中除含有挥发性物质以外，还含有大量的不挥发性物质，如茶多酚、茶多糖、氨基酸、蛋白质、脂肪酸、有机酸、咖啡碱、植物纤维、果胶、可溶性固形物、色素以及其他多种不溶于水的大分子物质，是一种内含物相当复杂的混合溶液。

根据发酵程度的不同，茶可分为三大类：不发酵茶（比如绿茶）、半发酵茶（比如乌龙茶）、全发酵茶（比如红茶）。现有研究发现，红茶中有约600种挥发性成分，其中对红茶香气起重要作用的约有41种；在乌龙茶和绿茶中大约有200种成分，其中对绿茶香气起重要作用的约占30%(60种)。茶叶中所含的香气物质主要作用在于提供茶的风味和香气，虽然含量只占其干重的0.01%-0.02%，但却是影响茶品质及其市场价值的重要因素。因此，对茶香气物质的提取具有重要意义。

茶香气样品的快速简便提取一直以来都是一个技术难题，其中的焦点问题是如何在短时间内获取高浓度茶香气物质的基础上，不改变香气物质的完整性，同时尽可能消除不挥发性杂质对分析结果造成的影响。

现有技术中，茶汤香气物质的提取方法主要有以下几种：有机提取、同时蒸馏萃取提取法(sde)、低压蒸气蒸馏提取法(sdr)、冲泡提取法、吸附柱法、溶剂辅助香气蒸发提取法(safe)和固相微萃取技术(spme)。其中，有机提取、低压蒸气蒸馏提取法(sdr)、冲泡提取法、吸附柱法等提取方法因其存在杂质难去除，香气样品得率低，有机溶剂消耗大等难以克服的问题已少有人使用。蒸馏萃取提取法(sde)和溶剂辅助香气蒸发提取法(safe)的使用较为普遍。

有机提取法可以提取得到完整的挥发性物质，但是，非挥发性物质例如植物蜡、色素、脂类和实验室塑料所含的塑化剂也会被一并提取出来，会导致分析的复杂化和影响分析结果。

同时蒸馏萃取提取法(sde)可获取高浓度的茶香气物质，但是，在提取过程中，由于持续高温（100℃）会导致香气物质降解、污染、发生氧化和热反应。

和同时蒸馏萃取提取法(sde)相比，减压蒸气蒸馏提取(sdr)法，提取的温度相对较低，能够更好的反映茶叶样品中自身的香气特征，虽然不改变挥发性物质的种类，但是，一些糖苷键合态挥发性物质仍然会水解，并且提取时间较长。

冲泡提取是一种简单而又快速的样品提取方法，能够反映茶叶中挥发性组分的真实情况，对挥发性香气组分的成分改变较小。但使用冲泡提取，挥发性物质的浓缩的产量不及同时蒸馏萃取提取法(sde)所得产量的1/10。此外，使用冲泡提取茶香气物质还存在不挥发性物质难以去除的问题，从而影响分析结果。

吸附柱法是在冲泡方法的基础上进一步修正的方法，即茶样品经沸水提取后，茶汤通过吸附柱分离挥发性物质。此方法需要使用大量的溶剂冲洗吸附柱吸附的挥发性化合物，易导致环境污染。此外，溶剂的选择及冲洗能力都会影响分析结果。

溶剂辅助香气蒸发提取法(safe)，在于整个提取过程中提取环境要求严格，需要超低温(-196℃)和高负压(5×10^-3pa)，能耗大，在提取过程中需要耗费大量有机溶剂。此外，在提取过程中一些不挥发性杂质会被带入香气物质提取物种，影响分析结果，需与吸附法联用除去杂质。

固相微萃取法(spme)使用较为普遍，该方法是基于使用不同极性或非极性吸附剂所包裹的石英玻璃纤维柱的吸附和脱附，进行挥发性物质的提取。该方法的缺陷在于，提取物只能进样1次进行定性分析，无法用于定量分析及后续的其他分析，如aeda分析。

固相萃取技术(spe)在茶香气物质提取方面也有报道，但该方法主要针对纯净的基质，比如茶叶，而对于从复杂基质如茶汤中而言，该方法主要存在以下问题：（1）茶汤中含有大量的不挥发性物质，如茶多酚、茶多糖、氨基酸、蛋白质、脂肪酸、有机酸、咖啡碱、植物纤维、果胶、可溶性固形物、色素以及其他多种不溶于水的大分子物质，香气物质含量极低，这导致茶汤装载于spe小柱后很容易导致spe小柱堵塞，后续方法步骤无法实现；（2）洗脱液不做进一步处理，使得洗脱液中残存的大分子物质(主要是不挥发性物质和水)与香气物质混合在一起，导致进行后续进行gc及gc-ms检测时出现杂质峰掩盖真实峰现象，基线漂移严重，影响定性定量结果的准确性；（3）香气物质的得率较低。

技术实现要素：

针对现有技术的缺陷，本发明提供一种利用spe小柱提取茶汤香气物质的方法，该方法分析准确性高。

一种利用spe小柱提取茶汤香气物质的方法，包括以下步骤：

（1）制备茶汤，放置至室温；

（2）茶汤凝絮处理：向茶汤中加入凝絮剂，混匀后静置30-60min；

（3）茶汤脱絮处理：茶汤离心，将上清液微滤；

（4）香气物质吸附及洗脱：将微滤后的茶汤装载至活化的spe小柱中进行香气物质吸附，吸附完毕后，用纯净水冲洗小柱，最后使用洗脱剂洗脱香气物质并收集洗脱物；

（5）洗脱液净化：向洗脱物中加入净化剂，混匀后离心，取上清液并浓缩并用无水硫酸钠干燥；

其中，spe小柱中填充有填料，所述填料为质量比为8:1:1的聚苯乙烯-二乙烯基苯高聚物、classicnh2（氨基）和classicsaxc18硅胶的混合物；

所述茶汤、凝絮剂、spe小柱中的填料、洗脱剂和净化剂的添加比为(100-200)ml:(1-10)g:(250-500)mg：(6-12)ml：(6-12)ml。

优选地，所述凝絮剂为质量比为（1-6）:（2-5）:（3-8）的阴离子聚丙烯酰胺、聚合硫酸铁和皂土的混合物。

优选地，所述洗脱剂为体积比为（3-6）:（2-5）:（5-8）的二氯甲烷，己烷和特丁基加醚的混合液。

优选地，所述净化剂为体积比为（1-6）:（1-4）:（1-4）的戊烷，丙酮和乙醚的混合液。

优选地，所述活化的spe小柱采用的活化液为体积比为1:1的甲醇和水。

优选地，步骤（1）中所述茶汤的制备方法为：按照料液比（3-5）g:（100-200）ml将茶叶置于纯净水中，在100℃下浸泡5min，取滤液即为茶汤。

优选地，步骤（1）中所述茶汤为茶饮料，所述茶饮料为冰红茶饮料、茉莉花茶饮料或者绿茶饮料。

优选地，步骤（5）中的浓缩为：在真空度为0.05mpa、温度为40℃的条件下减压浓缩30min。

优选地，步骤（3）和步骤（5）中离心的条件均为在4500rpm的转速下，离心10min。

本发明的优点：

本发明提供的方法，克服了现有技术中对提取环境要求严格的缺陷，通过样品检测分析前的凝絮，脱絮，洗脱和净化处理，大大降低了样品分析过程中杂质对分析结果的影响，提高了分析结果的准确性，并提高了香气物质的得率，同时降低了由于杂质存在而导致提取时间过长的缺陷，所用有机溶剂大大减少，降低了环境污染的风险。

附图说明

图1气相色谱柱对实施例3提取的茶汤香气成分的分离效果。

图2气相色谱柱对对比例1提取的茶汤香气成分的分离效果。

图3实施例4对冰红茶提取的提取的茶汤香气成分的分离效果。

图4对比例2对冰红茶提取的提取的茶汤香气成分的分离效果。

具体实施方式

本发明中所采用的spe小柱的填料为质量比为8:1:1的聚苯乙烯-二乙烯基苯高聚物，classicnh2（氨基）和classicsaxc18硅胶三种混合物，其中填料的吸附量250-500mg。

活化spe小柱的方法为：用活化液浸泡和冲洗spe小柱。

所述活化spe小柱的活化液为体积比为1:1的甲醇和水。

实施例1

一种利用spe小柱提取茶汤香气物质的方法，包括以下步骤：

（1）制备茶汤：将3g茶叶置于100ml纯净水中，在100℃下浸泡5min，取滤液即为茶汤100ml，放置至室温；

（2）茶汤凝絮处理：向茶汤中加入1g凝絮剂，混匀后静置30min；所述凝絮剂为质量比为1:2:3的阴离子聚丙烯酰胺、聚合硫酸铁和皂土的混合物；

（3）茶汤脱絮处理：茶汤在4500rpm的转速下，离心10min，将上清液微滤；

（4）香气物质吸附及洗脱：将微滤后的茶汤装载至活化的spe小柱中进行香气物质吸附，吸附完毕后，用纯净水冲洗小柱，最后使用6ml的洗脱剂洗脱香气物质并收集洗脱物；其中，所述洗脱剂为体积比为3:2:5的二氯甲烷、己烷和特丁基加醚的混合液；所述spe小柱中的填料质量为250mg；

（5）洗脱液净化：向洗脱物中加入6ml的净化剂，混匀后在4500rpm的转速下，离心10min，取上清液，在真空度为0.05mpa、温度为40℃的条件下减压浓缩30min，将浓缩物用无水硫酸钠干燥；所述净化剂为体积比为1：1：1的戊烷、丙酮和乙醚的混合液。

实施例2

一种利用spe小柱提取茶汤香气物质的方法，包括以下步骤：

（1）制备茶汤：将5g茶叶置于200ml纯净水中，在100℃下浸泡5min，取滤液即为茶汤200ml，放置至室温；

（2）茶汤凝絮处理：向茶汤中加入10g凝絮剂，混匀后静置60min；所述凝絮剂为质量比为6:5:8的阴离子聚丙烯酰胺、聚合硫酸铁和皂土的混合物；

（3）茶汤脱絮处理：茶汤在4500rpm的转速下，离心10min，将上清液微滤；

（4）香气物质吸附及洗脱：将微滤后的茶汤装载至活化的spe小柱中进行香气物质吸附，吸附完毕后，用纯净水冲洗小柱，最后使用12ml的洗脱剂洗脱香气物质并收集洗脱物；其中，所述洗脱剂为体积比为6:5:8的二氯甲烷、己烷和特丁基加醚的混合液；所述spe小柱中的填料质量为500mg；

（5）洗脱液净化：向洗脱物中加入12ml的净化剂，混匀后在4500rpm的转速下，离心10min，取上清液，在真空度为0.05mpa、温度为40℃的条件下减压浓缩30min，将浓缩物用无水硫酸钠干燥；所述净化剂为体积比为6:4:4的戊烷、丙酮和乙醚的混合液。

实施例3

一种利用spe小柱提取茶汤香气物质的方法，包括以下步骤：

（1）制备茶汤：将3g茶叶置于150ml纯净水中，在100℃下浸泡5min，取滤液即为茶汤150ml，放置至室温；

（2）茶汤凝絮处理：向茶汤中加入3g凝絮剂，混匀后静置40min；所述凝絮剂为质量比为2:2:6的阴离子聚丙烯酰胺、聚合硫酸铁和皂土的混合物；

（3）茶汤脱絮处理：茶汤在4500rpm的转速下，离心10min，将上清液微滤；

（4）香气物质吸附及洗脱：将微滤后的茶汤装载至活化的spe小柱中进行香气物质吸附，吸附完毕后，用纯净水冲洗小柱，最后使用8ml的洗脱剂洗脱香气物质并收集洗脱物；其中，所述洗脱剂为体积比为4:3:6的二氯甲烷，己烷和特丁基加醚的混合液；所述spe小柱中的填料质量为350mg；

（5）洗脱液净化：向洗脱物中加入8ml的净化剂，混匀后在4500rpm的转速下，离心10min，取上清液，在真空度为0.05mpa、温度为40℃的条件下减压浓缩30min，将浓缩物用无水硫酸钠干燥；所述净化剂为体积比为4:2:2的戊烷、丙酮和乙醚的混合液；

实施例4

一种利用spe小柱提取茶汤香气物质的方法，包括以下步骤：

（1）制备茶汤：取200ml冰红茶饮料作为茶汤，所述冰红茶为现有技术中售卖的冰红茶，放置至室温；

（2）茶汤凝絮处理：向茶汤中加入8g凝絮剂，混匀后静置50min；所述凝絮剂为质量比为2:2:6的阴离子聚丙烯酰胺、聚合硫酸铁和皂土的混合物；

（3）茶汤脱絮处理：茶汤在4500rpm的转速下，离心10min，将上清液微滤；

（4）香气物质吸附及洗脱：将微滤后的茶汤装载至活化的spe小柱中进行香气物质吸附，吸附完毕后，用纯净水冲洗小柱，最后使用10ml的洗脱剂洗脱香气物质并收集洗脱物；其中，所述洗脱剂为体积比为5:4:7的二氯甲烷、己烷和特丁基加醚的混合液；所述spe小柱中的填料质量为400mg；

（5）洗脱液净化：向洗脱物中加入10ml的净化剂，混匀后在4500rpm的转速下，离心10min，取上清液，在真空度为0.05mpa、温度为40℃的条件下减压浓缩30min，将浓缩物用无水硫酸钠干燥；所述净化剂为体积比为6:2:4的戊烷、丙酮和乙醚的混合液。

对比例1

采用现有技术对茶汤进行香气物质提取，茶汤的制备方法如下：将3.0g茶叶置于150ml纯净水中，在100℃下浸泡5min，取滤液即为茶汤150ml，放置至室温；

提取方法如下：

将茶汤装载至活化的spe小柱中，过柱完毕后，用水冲洗小柱，然后用3ml洗脱液淋洗spe小柱，所述洗脱液为特丁甲醚，然后收集洗脱液，将收集到的洗脱液作为香气样品。其中，spe小柱同实施例3。

对比例2

采用现有技术对茶汤进行香气物质的提纯，茶汤为实施例4中所采用的冰红茶200ml，放置至室温；

提取方法如下：

将茶汤装载至活化的spe小柱中，过柱完毕后，用水冲洗小柱，然后用3ml洗脱液淋洗spe小柱，所述洗脱液为特丁甲醚，然后收集洗脱液，将收集到的洗脱液作为香气样品。其中，spe小柱同实施例4。

性能检测

采用shimadzugc2010plus气相色谱仪进行成分分析，色谱条件如下：色谱柱类型intercap-wax柱(30m×0.25mmi.d.,0.25μmfilmthickness,shimadzu)，进样口温度200℃，检测器温度250℃，进样方式为分流进样，分流比为5:1，进样量4μl，载气氮气，色谱程序为起始温度40℃，保持5min，然后以3°c/min的速率升温至220℃，保持5min。

定性检测：定性分析采用thermotracegcultra-thermoitq900气质联用仪进行分析，色谱条件同上。

一．将实施例3和对比例1提取得到的香气物质进行检测

气相色谱柱对本发明实施例3提取的香气物质的效果见图1，对比例1提取的香气物质的效果见图2，香气成分定性定量结果见表1。

由图1和图2对比可知，在0-55min时间段内，气相色谱柱对实施例3和对比例1方法制得的香气样品中的香气成分进行良好的分离，但在55min之后，对比例1方法制得的香气样品中杂质未被有效除去，而导致杂质过多，遮盖55min之后的化合物，如表1中的吲哚、香豆素、月桂酸、香草醛及其他未鉴定的化合物(见图2中方框标示区)。这说明，对比例1的方法无法对样品中的杂质进行有效的去除及对香气物质进行有效提取。而采用本发明的方法，在保持茶汤香气成分良好分离的基础上，能更加有效的去除杂质(见图1中方框标示区)，使得香气成分不被杂质遮蔽。

表1.实施例3中的香气化合物

二．将实施例4和对比例2提取得到的香气物质进行检测

气相色谱柱对本发明实施例4和对比例2提取的香气物质的效果分别见图3和图4，两种方法提取的香气化合物的峰面积结果见表2。

表2.实例4和对比例2方法对冰红茶样品香气物质提取效果

注：“/”表示未检出。

由图3和图4可知，两种方法均能对冰红茶样品中的香气物质进行有效提取。色谱分析结果显示（如表2所示），两种提取方法总计分离出95种峰面积≥1000的化合物，其中本发明提供方法（实施例4）分离出了88种化合物，公开发明的方法（对比例2）仅分离出了然而53种化合物。由此说明，本发明提供的方法可提取到更多数量的香气化合物，该方法对香气物质的提取效率更高，效果更好。此外，公开发明的方法提取的香气物质可能含有较多量的杂质，色谱图中可见出现明显的基线漂移（图4），而在本发明方法中基线较稳定（图3）。