牛樟芝酦酵糙米，其制法及其组合物的制作方法

本发明是关于一种经牛樟芝酦酵的糙米。特别地，本发明是关于一种经由将牛樟芝菌种接入由糙米为培养基质进行酦酵而得的牛樟芝酦酵糙米。

背景技术：

依据历史记载，1773年开兰第一人吴沙从中国福建渡海来台湾开垦宜兰，与当地原住民进行贸易活动，交流频繁，吴沙从原住民取得牛樟芝熬煮食用，直到1985年，牛樟芝始流传到平地，发现其具有良好食用功效，于是各大学及研究机构均积极投入牛樟芝的基源、化学成分、药理活性及人工培养等研究，应用潜力深受学术界肯定。牛樟芝(antrodiacamphorata、antrodiacinnamomea、taiwanofunguscamphoratus)属于非褶菌目、多孔菌科、薄孔菌属、樟芝种，乃多年生蕈菌类。牛樟芝，民间的称呼尚有樟芝、樟菇、樟菰、樟内菇、牛樟菇、红樟等，是台湾特有种的菇类，在天然状况下只生长在台湾特有的常绿阔叶大乔木牛樟树(cinnamomumkanehirai)树干内中空的心材上，截至目前为止，世界上仅发现于台湾，堪称为世界的珍宝。

牛樟芝所含的化合物大致可归类为多醣体(polysaccharides)、三萜类(triterpenoids)、双萜类(diterpenes)、倍半萜烯类化合物(sesquiterpenes)、倍半萜内酯(sesquiterpenelactones)、苯类(benzenoids)、苯醌衍生物(benzoquinonederivatives)、超氧歧化酶(superoxidedismutase)、多炔类(polyacetylenes)、腺苷(adenosine)、马来酸(maleicacid)和琥珀酸(succinicacid)的衍生物，蛋白质(含免疫蛋白)、酚类化合物(phenoliccompounds)、固醇类(steroids)和挥发性物质(牛樟芝的香味)等。许多第一次被发现和命名的成分都以牛樟芝学名中之属名开头，例如antcin、antrocin、antrodin、antrocamphin及antroquinonol等。不论椴木栽培的牛樟芝子实体或固态和液态培养的牛樟芝菌丝体都曾被发现具有抗氧化、抗发炎、保肝、抗酒精性肝炎、抗过敏、降血脂、神经保护及抗癌等功效。

自1991年之后，牛樟芝的研究开始起步，2000年之后渐受重视，牛樟芝人工培植有牛樟椴木栽培法，其能获得类似野生牛樟芝的成分。另外，亦有牛樟芝固态培养法及液体培养法，其中固态培养法又称太空包栽培法，将牛樟芝菌种以包含有纤维物、醣类、五谷杂粮类等太空包进行菌丝体培养。利用固体培养基栽培牛樟芝，虽然能获得与野生子实体相近的成分，但是培养时间需要约六个月，且培养成本稍高；而液体培养法系利用酦酵槽进行菌种液体酦酵以收取菌丝体，虽具有培养时间短(约14天)的优点，但缺点是无法取得野生牛樟芝特有的三萜类成分，且与野生牛樟芝子实体所共有的成分相去甚远。目前市面上常见的牛樟芝产品，大多是利用液态及固态酦酵生产菌丝体或子实体，其目的在于不会造成砍树的环保顾虑。

现有技术已有尝试将牛樟芝菌种接种于果肉或瓜果食材中进行培养，例如中国台湾专利i551683披露一种，包含将牛樟芝接种于百香果果肉，以将该百香果果肉作为用于培养牛樟芝的一种基质，其宣称可以提升牛樟芝的多醣体含量；以及中国台湾专利i551686披露一种牛樟芝培养方法，包含将牛樟芝植入南瓜，在24～26℃的温度下培养3～6周，使该牛樟芝利用该南瓜所含的营养成分生长。然而，目前尚无文献披露仅利用单一种谷物，尤其是糙米，做为牛樟芝的培养基质。

稻米是世界过半数人口的主食，而超过90％的世界稻作面积是在米食大洲“亚洲”，其在产米国家经济方面扮演着相当重要的角色。糙米是稻米经过简单加工脱壳后所产的一种米，其仍保留部分外层组织，如皮层、糊粉层和胚芽；稻米中60％-70％的维生素、矿物质和大量必需氨基酸都聚集在上述的外层组织内，且拥有比白米高出6倍的膳食纤维，可以预防、减缓便秘，所以糙米向来被视为是一种健康食材。糙米中含有独特且丰富的生育醇(tocopherols,toc)、生育三烯醇(tocotrienols,t3)及γ-谷维素(γ-oryzanol)、γ-氨基丁酸(γ-aminobutyricacid,gaba)、阿魏酸、多酚类化学物及膳食纤维等机能性成分，具有降血脂、降胆固醇、预防心血管疾病、抗氧化及抗癌等功效。流行病学或临床研究上，均证明这些机能性成分具有不同程度的预防疾病作用，如改善体质、调节生理机能及增进健康。

中国台湾专利i331506披露一种牛樟芝人工栽培方法，将牛樟芝菌种接种于包含白米、小米、高梁或小麦的五谷杂粮、椰子水、根茎类作物及糖类的培养基中培养长出子实体，以取代牛樟树作为培养牛樟芝的营养源。该专利的方法虽可通过常见谷类资材作为牛樟芝的营养源来节省栽培时间与成本，但是其培养基质组成复杂，不能当做食材使用，且培养时间长(六个月以上)，子实体的生成不稳定。本发明是首先利用糙米做为牛樟芝培养的营养基质进行酦酵培养，在短时间内生产类似牛樟芝子实体，其含有多种牛樟芝的特有化学成分，以及糙米中的主要营养成分；此外，根据本发明方法制得的牛樟芝酦酵糙米，除了可用作为保健食品的素材外，也可当作直接烹煮的食材使用。

技术实现要素：

本发明基于以上的目的发现，将牛樟芝菌种接入仅由糙米作为营养基质的培养基进行酦酵，可生产牛樟芝类子实体，并进一步分析所得的牛樟芝酦酵糙米的组成分，证实其除保有原糙米的特殊营养成分如生育醇、生育三烯醇及γ-谷维素等之外，亦包含牛樟芝的特有活性成分，包括1,4-二甲氧基-2,3-亚甲氧基-5-甲基苯(1,4-dimethoxy-2,3-methylenedioxy-5-methyl-benzene，非三萜类)、樟菇酸c(antcinc)、2,2’,5,5’-四甲氧基-3,4,3’,4’-双亚甲二氧基-6,6’-二甲基双酚(2,2’,5,5’-tetramethoxy-3,4,3’,4’-bimethylenedioxy-6,6’-dimethyl-biphenyl，酚类)、樟菇酸h(antcinh)、去氢硫色多孔菌酸(dehydrosulphurenicacid)、安卓凯因c(antrocamphinc，非三萜多炔类)、樟菇酸b(antcinb)、樟菇酸g(antcing)、樟菇酸a(antcina)、15-乙酰基去氢硫色多孔菌酸(15-acetyldehydrosulfurenicacid)及去氢齿孔菌酸(dehydroeburicoicacid)等。

于是，本发明的一方面是关于，一种牛樟芝酦酵糙米，其特征在于，将牛樟芝菌种以糙米为营养基质进行酦酵培养而得，所述经牛樟芝酦酵的糙米包含糙米的特殊营养成分及牛樟芝的特有活性成分。

在本发明的一些具体实施例，所述的牛樟芝酦酵糙米包含生育醇、生育三烯醇及γ-谷维素等糙米的特殊营养成分。在本发明的一项具体实施例，所述的牛樟芝酦酵糙米包含1,4-二甲氧基-2,3-亚甲氧基-5-甲基苯、樟菇酸c、2,2’,5,5’-四甲氧基-3,4,3’,4’-双亚甲二氧基-6,6’-二甲基双酚、樟菇酸h、去氢硫色多孔菌酸、安卓凯因c、樟菇酸b、樟菇酸g、樟菇酸a、15-乙酰基去氢硫色多孔菌酸及去氢齿孔菌酸等牛樟芝的特有活性成分。

本发明的另一方面，关于一种制备牛樟芝酦酵糙米的方法，特征在于包含将牛樟芝菌种接入仅由糙米作为培养基质，于温度21～23℃、湿度65～70％下进行酦酵培养一至二个月，较佳为40天，至牛樟芝类子实体完全布满于该培养基；及收取该牛樟芝酦酵糙米。

本发明的一些具体实施例，所述的方法进一步包含将所收取的牛樟芝酦酵糙米在70～80℃下进行干燥20～30小时，较佳的，在70～80℃下以热风干燥约24小时，或以冷冻干燥约48小时。本发明的其他具体实施例，所述的方法进一步包含将所述经过干燥的牛樟芝酦酵糙米研磨成干燥糙米粉末。本发明的另一些具体实施例，所述的方法进一步包含将所述的牛樟芝酦酵糙米以水及酒精萃取及浓缩，而得一牛樟芝酦酵糙米萃取浓缩液。本发明的其他具体实施例，所述的方法进一步包含将所述的牛樟芝酦酵糙米萃取浓缩液进行干燥及研磨，得一牛樟芝酦酵糙米萃取物粉末。

本发明的另一方面，是关于一种食品组合物，其特征在于，包含所述经过干燥的牛樟芝酦酵糙米或糙米粉末或牛樟芝酦酵糙米萃取物。

本发明使用的牛樟芝菌株包括antrodiacinnamomeabcrc35396(atcc200183)，antrodiacinnamomeabcrc36401(tarisl-7)，antrodiacinnamomeakj-hl等。

附图说明

图1显示本发明实施例一所制得牛樟芝酦酵糙米的糙米特殊营养成分分析结果。

图2a为本发明实施例一所制得牛樟芝酦酵糙米的乙醇萃取物的hplc分析图谱。

图2b为未接种牛樟芝的酦酵糙米样本(作为对照组，其酦酵培养条件与图2a的牛樟芝酦酵糙米相同)。

图2c为接种牛樟芝菌种而未经酦酵的未酦酵糙米样本(作为另一对照组，其牛樟芝菌接种条件与图2a的牛樟芝酦酵糙米相同)

图2d为空白组。

具体实施方式

本说明书中所称的“糙米”(亦称为玄米)，是指稻谷脱去外壳后，留下胚芽与米糠的部分。所称“糙米的特殊营养成分”是指存在糙米中对身体有益的机能性成分，主要包含生育醇(tocopherols,toc)、生育三烯醇(tocotrienols,t3)、γ-谷维素(γ-oryzanol)、γ-氨基丁酸(γ-aminobutyricacid,gaba)、阿魏酸、多酚类化合物及膳食纤维等。

本说明书中所称的“牛樟芝特有活性成分”是指特有存在牛樟芝中具有药用生理活性的成分，主要包含多醣体(polysaccharides)、三萜类(triterpenes)、双萜类(diterpenes)、倍半萜烯类化合物(sesquiterpenes)、倍半萜内酯(sesquiterpenelactones)、苯类(benzenoids)、苯醌衍生物(benzoquinonederivatives)、超氧歧化酶(superoxidedismutase)、多炔类(polyacetylenes)、腺苷(adenosine)、马来酸(maleicacid)和琥珀酸(succinicacid)的衍生物，蛋白质(含免疫蛋白)、酚类化合物(phenoliccompounds)、固醇类(steroids)、维生素类(如维生素b、烟碱酸等)、微量元素(如钙、磷、锗等)、核酸、胺基酸、木酚素、γ-胺基丁酸(gaba)和血压稳定物质(如antrodiaacid)等。

本发明的其他特色及优点将在下列实施例中被进一步举例与说明，而该实施例仅作为辅助说明，并非用于限制本发明的范围。

实施例一、牛樟芝酦酵糙米的制备

培养基的制备：将糙米与水以1：1.1比例混合，置入玻璃广口瓶中，每瓶含培养基重约100～120克，在121℃下进行灭菌1小时。接菌：取约2mmx3mm方块的牛樟芝菌种(antrodiacinnamomeakj-hl)或使用液态及固态菌种，接种于前述的糙米培养基。培养条件：温度：21～23℃，湿度：65～70％，换气频率：每隔12小时，换气5分钟，二氧化碳浓度：1000～2000ppm，在无光照下培养1至2个月。

经40天酦酵培养后，在糙米培养基已布满呈现淡黄色的牛樟芝类子实体，收取牛樟芝酦酵糙米，以70～80℃的热风干燥约24小时，或以冷冻干燥约48小时，得到经干燥的牛樟芝酦酵糙米。所得的经干燥牛樟芝酦酵糙米可直接做为食材，炊煮成糙米饭或压制成谷片，或可用于制作玄米茶的材料；亦可进一步经研磨成牛樟芝酦酵糙米粉末，添加入其他食材或饮料中作为营养调和剂，制成养生食品组合物，如养生糙米浆、糙米牛奶、糙米饼等。

实施例二、牛樟芝酦酵糙米萃取浓缩液的制备

将如实施例一所制得的牛樟芝酦酵糙米，以水及酒精作为溶剂，在95℃下进行萃取5小时，得到牛樟芝酦酵糙米萃取液。再将牛樟芝酦酵糙米萃取液以不锈钢筛网(150mesh)进行过滤。

接着将经过滤的萃取液移至真空浓缩机，在温度52±2℃进行浓缩，待滤液浓缩至浓缩标准线后，取出浓缩液，置入流动层喷雾干燥机内(温度62±2℃、泵转速35rpm、风机转速40rpm)，进行喷雾干燥。取出干燥的萃取物，经磨粉(筛网孔径90mesh)及过筛(筛网孔径60mesh)后，得到牛樟芝酦酵糙米萃取物粉末。

实施例三、牛樟芝酦酵糙米的稻米特殊营养成分分析

为确定糙米经牛樟芝酦酵后是否仍保有其特殊的营养成分，遂针对酦酵糙米中的生育醇(tocopherols)、生育三烯醇(tocotrienols)及γ-谷维素(γ-oryzanol)等活性成分进行测试。

活性成分萃取

取0.5g牛樟芝酦酵糙米样品于3ml的正己烷，混和均匀，在60℃水浴振荡萃取20分钟。然后以2000rpm离心15分钟后取上清液，以同样方法抽取两次。最后，合并三次萃取的上清液，以0.45μm滤膜过滤，取滤液，以备hplc分析(参照，huang&ng,journalofchromatographya1218:4709-4713,2011)。

活性成分分析

本实例所使用的高效液相层析仪(hplc)为hitachi系统装置，包括：层析泵(modell-2100/2130)、紫外-可见分光侦测器(modelu-1800)及荧光侦测器(modell-2485)。糙米活性成分的分析，系利用荧光侦测器于波长290nm(激发波长)及330nm(发射波长)进行。分析条件如下：移动相含正己烷、异丙醇、乙酸乙酯及醋酸；分离管柱为inertsilsil100a，5μm，4.6x250mm；移动相流速为0.7ml/min。

结果如图1所示，本发明的牛樟芝酦酵糙米在酦酵后，经n-己烷萃取后，进行hplc分析，仍保有糙米的特殊营养成分，包括生育醇(图中α-toc代表α-生育醇，β-toc代表β-生育醇，γ-toc代表γ-生育醇，δ-toc代表δ-生育醇)、生育三烯醇(α-t3代表α-生育三烯醇，β-t3代表β-生育三烯醇，γ-t3代表γ-生育三烯醇，δ-t3代表δ-生育三烯醇)及γ-谷维素(γ-oryzanol代表γ-谷维素)等。

实施例四、牛樟芝酦酵糙米的牛樟芝活性成分分析

为确定本发明的牛樟芝酦酵糙米是否含有牛樟芝的特有活性成分，遂针对牛樟芝酦酵糙米中的三萜类、非三萜类安卓凯因c及酚类等活性成分进行测试。

萃取液制备步骤：取20mg牛樟芝酦酵糙米样品置于1.5ml微量离心管，加入0.8ml95％酒精(1:40,w/v)，混合均匀。在室温下，将混合物在超音波水浴中震荡1小时，之后在6000rpm下进行离心5分钟，取上清液以孔径0.45μm滤膜过滤至1.5ml微量离心管中，以95％酒精润洗并定量至1ml，将萃取液贮存于-20℃以备进行hplc分析(参照，linetal.,journalofagriculturalandfoodchemistry59:7626-7635,2011)。

hplc分析条件：管柱为lunac18(2)(5μm,4.6x250mm,phenomenex)；侦测波长为254nm；移动相含a:0.1％醋酸(h2o含0.1％(v/v)aceticacid)、b：甲醇(meoh)、c：乙腈(acetonitrile,acn)；移动相流速如下表。

分析结果如图2所示。由图2a的hplc图谱显示(图2a中a代表1,4-二甲氧基-2,3-亚甲氧基-5-甲基苯；b代表樟菇酸c；c代表2,2’,5,5’-四甲氧基-3,4,3’,4’-双亚甲二氧基-6,6’-二甲基双酚；d代表樟菇酸h；e代表去氢硫色多孔菌酸；f代表安卓凯因c；g代表樟菇酸b；h代表樟菇酸g；i代表樟菇酸a；j代表15-乙酰基去氢硫色多孔菌酸及k代表去氢齿孔菌酸)，即本发明的牛樟芝酦酵糙米确实含有牛樟芝的特有活性指标成分，包括1,4-二甲氧基-2,3-亚甲氧基-5-甲基苯、樟菇酸c、2,2’,5,5’-四甲氧基-3,4,3’,4’-双亚甲二氧基-6,6’-二甲基双酚、樟菇酸h、去氢硫色多孔菌酸、安卓凯因c、樟菇酸b、樟菇酸g、樟菇酸a、15-乙酰基去氢硫色多孔菌酸及去氢齿孔菌酸。而没有接种牛樟芝的酦酵糙米(对照组，图2b)，及接种牛樟芝菌种而未经酦酵的糙米(未酦酵糙米，图2c)，其hplc分析图谱与空白组(图2d)类似，皆不含有任何牛樟芝特有的活性成分。显示，本发明牛樟芝酦酵糙米含有的牛樟芝特有活性成分，是需经过糙米与牛樟芝菌种酦酵培养所产生。

本发明首创以富含营养价值的糙米做为培养牛樟芝的营养基质，经酦酵培养后获得同时含有糙米的特殊营养成分及牛樟芝的特有活性成分的牛樟芝发酵糙米。由于本发明仅使用糙米作为牛樟芝的酦酵培养基，其成分单纯，故所得的牛樟芝酦酵糙米可直接进行烹煮食用。且糙米本身即为已知具有高营养价值的食材，经与牛樟芝酦酵培养后，除保有原糙米特殊营养成分之外，更获得牛樟芝的特有活性成分，可由此进一步提升其利用于制备养生产品的产业价值及广度。