本发明属于食品加工
技术领域：
，特别是涉及一种黑果枸杞酵素及其制备工艺和用途。
背景技术：
：黑果枸杞花青素含量居浆果之首，具有清除自由基、抗氧化功能；黑果枸杞提取物具有降血脂、降血糖、抗氧化、免疫调节、延缓衰老、预防及治疗心血管疾病和抗癌的功效。在目前黑枸杞产品开发中，除黑枸杞原果产品外，大多数企业及研究者注重于原果压片、色素压片、果汁饮料等产品开发，但液态饮料产品在产品加工中难免采用高温杀菌环节，产品加工过程中受热程度高，产品花青素氧化降解明显，产品中最终花青素含量极低，使其保健价值大打折扣。酵素产品采用复杂配方及复杂的微生物菌系进行发酵，产品保存中依靠高酸度，高固形物含量，有益微生物优势菌落抑制腐败微生物，低水分活度等特性延长产品保存期，特别是高酸度环境有利于花青素的稳定性。技术实现要素：有鉴于此，本发明提供了一种黑果枸杞酵素，按重量份计，原料包括：黑果枸杞10～25份，红果枸杞0～10份，玛咖2～4份，蕨麻3～5份，沙棘粉2-5份，其余为水、甜味剂和碳源物质。所述碳源物质为菌种发酵提供碳源。进一步，按重量份计，原料包括：黑果枸杞10份，红果枸杞10份，玛咖3份，蕨麻5份和沙棘粉2份，或，黑果枸杞25份，红果枸杞0份，玛咖2份，蕨麻5份和沙棘粉3份，或，黑果枸杞20份，红果枸杞5份，玛咖4份，蕨麻3份和沙棘粉5份。进一步，所述甜味剂为蜂蜜或木糖醇，所述碳源物质为碳水化合物，甜味剂为13-20份，碳水化合物为20-25份，进一步甜味剂为13份，碳水化合物为20份。进一步，所述黑果枸杞和红果枸杞既可用鲜果也可用干果，果实打浆后使用，采用鲜果时鲜果加无菌水后直接打浆，采用干果时加水浸泡并杀菌然后打浆。进一步，所述玛咖和蕨麻打浆后使用，打浆前先用水浸泡并煮制，然后过滤除去部分滤液，剩余部分打浆。本发明还提供了黑果枸杞酵素的制备工艺，包括如下步骤：(1)原料打浆黑果枸杞或红果枸杞可采用鲜果或干果，若为鲜果，则鲜果加入无菌水直接打浆；若为干果，先将干果加入水中浸泡，并加热至70-90℃杀菌，然后打浆；玛咖和蕨麻先用水浸泡，并加热至90-100℃杀菌，然后过滤除去部分滤液，剩余部分打浆；(2)第一阶段发酵将沙棘粉、枸杞浆、玛咖浆、蕨麻浆和四分之一重量的碳源物质混匀成浆液，并接菌种密封发酵，菌种的接种量占混合浆液重量百分比为3％～4％，发酵温度为25～28℃，进一步发酵温度为28℃，发酵时间为5-10天；(3)第二阶段发酵将第一阶段发酵的液体加入同等体积的无菌水并过滤除渣，然后加入甜味剂及剩余碳源物质在步骤(2)所述条件下继续发酵15-45天；(4)浓缩或调配。浓缩后直接制成液态酵素饮品，或者，根据消费者口感需求，加入常规使用的配料，比如甜味剂或香精，制成不同口感的饮品。浓缩采用常规的浓缩技术，比如膜浓缩。进一步，所述步骤(1)中鲜果与无菌水的重量比为1:(1-2)；干果与水的重量比为1：(2-4)；玛咖或蕨麻与水的重量比为1:(2-6)；加热杀菌时间为30～45min。进一步，所述步骤(2)中接种所用菌种为植物乳杆菌、红茶菌和酵素菌的混合菌，三种菌种的重量比为1:1:1，3:1:2或3:1:3,或接种所用菌种为单一菌种植物乳杆菌或酵素菌。酵素菌种可采用商业发酵剂，应包含乳酸菌、酵母等微生物菌种，适用于果蔬酵素产品的生产，可加快发酵速度，有利于丰富发酵及产品中的微生物类型。本产品研发中采用的酵素菌来源于市售商业发酵剂，商品名称为“速效酵素菌剂”，生产商为西安惠可欣微生物研究中心，公司地址西安市长安区镐京工业园。进一步，所述步骤(4)中浓缩后还有干燥的步骤。干燥采用常规干燥技术，比如喷雾干燥，干燥后可获得固态酵素产品。本发明还提供了黑果枸杞酵素抗疲劳的用途。进一步提供了黑果枸杞酵素在降低机体血清尿素和乳酸含量，维持机体肝糖原高水平方面的应用。玛咖，即玛卡，拉丁文名lepidiummeyeniiwalp.。传统上用于强壮身体，提高生育力，改善性功能，抗抑郁，抗贫血等，还具有抗氧化、降血脂、抗肿瘤的效果。蕨麻，(拉丁学名：potentillaanserinal.)，别称人参果。具有壮骨、利尿消肿等功效。沙棘，(拉丁学名：hippophaerhamnoideslinn.)，具有抗疲劳和增强机体活力及抗癌等特殊药理性能，有降减血浆胆固醇、减少血管壁中胆固醇含量的作用，能防治高血脂症和动脉粥样硬化症，并有促进伤口愈合的作用。本发明的有益效果是：本发明以黑果枸杞为主要原料生产酵素产品，产品生产中无需高温加热环节，产品中的花青素可得到有效保存，在保持水果酵素产品特点的基础上，可充分发挥黑枸杞花青素的保健功效。经过发酵，使原料中的活性物充分浸出，并使淀粉、多糖类物质得到充分转化，因此，黑枸杞酵素产品富含玛咖、蕨麻等配料的营养及活性物成分。采用发酵工艺改变产品口味特性，克服枸杞、玛咖药性味过浓，带有苦涩味的缺陷，使产品风味及口感更容易被消费者接受。本发明通过配方及工艺优化，保证有益微生物适应特殊的配料，使活菌数增值达到有效水平，通过配料使产品具有抗疲劳、抗氧化、美容之功效。具体实施方式实施例1一种黑果枸杞酵素，按重量份计，黑果枸杞酵素的原料包括：黑果枸杞10份，红果枸杞10份，玛咖3份，蕨麻5份，沙棘粉2份，蜂蜜13份，红糖20份，其余为水。黑果枸杞酵素的制备工艺，包括如下步骤：(1)原料打浆干净的黑果枸杞或红果枸杞鲜果加入无菌水直接打浆；鲜果与无菌水的重量比为1:2；干净的玛咖或蕨麻先用水浸泡，玛咖或蕨麻与水的重量比为1:2，并加热至90℃杀菌45min，过滤除去40％的水煮液，将滤后的固形物与剩余水煮液打浆，打浆中可加入不超过发酵液总体积的20％的无菌水；(2)第一阶段发酵将沙棘粉、枸杞浆、玛咖浆、蕨麻浆和四分之一重量的红糖混匀成浆液，并接菌种密封发酵，所用菌种为植物乳杆菌、红茶菌和酵素菌的混合菌，三种菌种的重量比为1:1:1，菌种的接种量占混合浆液重量百分比为4％，发酵温度为28℃，发酵时间为5天；(3)第二阶段发酵将第一阶段发酵的液体加入同等体积的无菌水并过滤除渣，然后加入蜂蜜及剩余红糖在步骤(2)所述条件下继续发酵15天；(4)膜浓缩。浓缩后直接制成液态酵素饮品。实施例2一种黑果枸杞酵素，按重量份计，黑果枸杞酵素的原料包括：黑果枸杞25份，红果枸杞0份，玛咖2份，蕨麻5份，沙棘粉3份，蜂蜜17份，红糖23份，其余为水。黑果枸杞酵素的制备工艺，包括如下步骤：(1)原料打浆干净的黑果枸杞或红果枸杞干果加入水中浸泡，并加热至70℃杀菌30min，然后打浆；干果与水的重量比为1:4；干净的玛咖或蕨麻先用水浸泡，玛咖或蕨麻与水的重量比为1:6，并加热至100℃杀菌45min，过滤除去60％的水煮液，将剩余水煮液及固形物一起打浆，并加入一定的无菌水，水量不超过总发酵液体积的20％；(2)第一阶段发酵将沙棘粉、枸杞浆、玛咖浆、蕨麻浆和四分之一重量的红糖混匀成浆液，并接菌种密封发酵，所用菌种为植物乳杆菌、红茶菌和酵素菌的混合菌，三种菌种的重量比为3:1:2，菌种的接种量占混合浆液重量百分比为3％，发酵温度为25℃，发酵时间为10天；(3)第二阶段发酵将第一阶段发酵的液体加入同等体积的无菌水并过滤除渣，然后加入蜂蜜及剩余红糖在步骤(2)所述条件下继续发酵45天；(4)膜浓缩(5)喷雾干燥干燥后包装得到固体酵素产品。实施例3一种黑果枸杞酵素，按重量份计，黑果枸杞酵素的原料包括：黑果枸杞20份，红果枸杞5份，玛咖4份，蕨麻3份，沙棘粉5份，木糖醇20份，白糖25份，水。黑果枸杞酵素的制备工艺，包括如下步骤：(1)原料打浆干净的黑果枸杞或红果枸杞干果加入水中浸泡，并加热至90℃杀菌30min，然后打浆；干果与水的重量比为1:3；干净的玛咖或蕨麻先用水浸泡，玛咖或蕨麻与水的重量比为1:4，并加热至90℃杀菌45min，过滤除去40％滤液，剩余部分打浆；(2)第一阶段发酵将沙棘粉、枸杞浆、玛咖浆、蕨麻浆和四分之一重量的白糖混匀成浆液，并接菌种密封发酵，所用菌种为植物乳杆菌，菌种的接种量占混合浆液重量百分比为3～4％，发酵温度为28℃，发酵时间为5天；(3)第二阶段发酵将第一阶段发酵的液体加入同等体积的无菌水并过滤除渣，然后加入四分之三重量的木糖醇及剩余白糖在步骤(2)所述条件下继续发酵15天；(4)调配加入剩余蜂蜜，以及占总重量0.5％山梨酸钾制成液态饮品。一、工艺优化1.玛咖原料处理方式的选择以实施例1所述原料配方生产酵素，玛咖原料采用破碎直接发酵、原玛咖煮制过滤后打浆发酵、玛咖液发酵三种方式应用于酵素产品配料中，通过对感官质量、微生物发酵速度影响来选择玛咖在酵素产品中生产中的处理方式，试验结果如下。表1玛咖处理方式对酵素产品及发酵产酸的影响破碎直接发酵玛咖煮制，除去部分滤液后打浆发酵玛咖液发酵口感有明显苦味有玛咖淡淡的香味有明显苦味发酵5d后ph5.34.55.4感官质量评分758874玛咖的添加方式可直接影响酵素产品的风味，以原玛咖直接发酵或将玛咖水提物作为酵素原料，酵素产品的苦味过于明显，对大多数消费者来讲很难接受。玛咖的添加也会影响微生物生长速度，影响产酸，考虑到在酵素制造过程中，能被微生物转化的玛咖成分主要是碳水化合物，因此，对玛咖原料采用水煮的方式，除去一部分活性成分和带有明显药味的物质，有利于微生物生长，可以在较短时间内完成发酵过程，同时，产品的感官质量评分较高。玛咖的部分水提物可采用浓缩的方式保存，用于开发口服液等产品，也可在酵素完成发酵过程后，在酵素产品中进行强化添加，以提高玛咖活性成分的含量。因此，在酵素生产中，首先，玛咖进行水煮，除去部分一部分水煮液，以便降低产品中的苦味成分，然后适量加水打浆，并与其它原料一起发酵。反复试验结果表明玛咖与水的比例为1:3，水煮时间为45min，然后除去50％-60％的水煮液，加适量的无菌水打浆，无菌水的添加量为发酵液总体积的20％。2.蕨麻原料处理方式的选择以实施例1所述原料配方生产酵素，蕨麻原料采用破碎直接发酵、蕨麻煮制过滤后打浆发酵、蕨麻水提液发酵三种方式应用于酵素产品配料中，通过对感官质量、微生物发酵速度影响来选择玛咖在酵素产品中的应用，试验结果如下。表2蕨麻处理方式对酵素产品及发酵产酸的影响破碎直接发酵蕨麻煮制，过滤后打浆发酵蕨麻提取液口感有明显苦涩味对产品口味无明显影响有苦涩味发酵5d后ph4.34.54.2感官质量评分828780蕨麻经过水煮后，可减轻加速产品的苦涩味，经水煮打浆后用于酵素产品生产，在保证产品良好口味的基础上，能保证蕨麻中的碳水化合物得到有效转化。因此，在酵素产品生产中，蕨麻采用水煮后除去部分水煮液，然后加水打浆。蕨麻的处理方式对微生物的生长基本没有影响。蕨麻与水的比例为1:3，水煮时间为45min，然后除去50％-60％的水煮液，加适量的无菌水打浆，无菌水的添加量为发酵液总体积的20％。3.黑果枸杞处理方式对发酵结果的影响黑枸杞采用流水快速清洗，清洗后90℃水浴杀菌，清洗后紫外灯照射三种方式，研究对发酵结果的影响。黑枸杞原料必须进行一定程度的杀菌处理，防止黑枸杞表面的杂菌过度生长而影响发酵过程，尤其是霉菌的生长会导致发酵过程的失败。黑枸杞与水的比例采用1:4，黑枸杞复水后，打浆，并在90℃水浴杀菌30min。表3黑枸杞处理方式对酵素产品及发酵的影响流水快速清洗90℃水浴杀菌紫外灯照射发酵状态大量气泡，表面长霉无明显产气，无霉菌生长大量气泡，表面长霉发酵5d后ph4.34.54.24.黑枸杞酵素发酵方式的选择黑枸杞酵素的生产采用了自然发酵(黑枸杞不杀菌)和杀菌后，接种特定微生物菌种的方法，试验的结果如下。结果显示，自然发酵虽然可以在一定时间内使酸度降低到4.3左右，但酵素液表面有大量霉菌生产，酵素带有明显异味，甚至腐败的味道。表4发酵方式对酵素产品及发酵的影响5.黑枸杞酵素发酵温度的选择试验结果以黑枸杞酵素感官质量，发酵速度，发酵状态为指标，综合评价发酵温度对黑枸杞酵素质量的影响，试验结果见下表。表5黑枸杞酵素发酵温度对产品感官质量及产酸速度的影响试验结果由温度试验结果可见，温度越高，发酵速度越快，产品发酵5d的酸度越低，但发酵温度过高，容易使产品过酸，同时，产品伴随有不愉快的气味，产品感官质量较差，黑枸杞酵素的发酵温度在25-28℃比较适宜。发酵温度低于18℃，微生物生长较慢，发酵过程缓慢。二、抗疲劳实验1、实验材料spf级balb/c小鼠110只，雄性，体重18～22g，由中国农业科学院兰州兽医研究所提供。动物饲养室温度为20～24℃，湿度为40％～65％。所有动物无病原菌，自由饮食，所食饲料为spf级小鼠专用饲料，由北京科奥协力饲料有限公司提供。饮用灭菌水，适应期为7d。2、实验步骤及结果(1)剂量分组将66只18-22g的小鼠在实验条件下适应7d后，按体重随机分为三组，a组服用实施例1所述酵素产品，b组服用在实施例1基础上添加了菊粉的酵素产品，阴性对照组(给予灭菌水)。每组22只。然后每天早上8:30～10:00经口灌胃，灌胃容积为0.2ml/(只.d)。连续灌胃25d后进行功能评价，试验期间自由饮食。添加菊粉的酵素产品具体为菊粉添加量为5重量份，在步骤(3)中与蜂蜜和剩余部分红糖一起加入进行第二阶段发酵。a组服用酵素原料配方按重量份计，黑果枸杞10份，红果枸杞10份，玛咖3份，蕨麻5份，沙棘粉2份，蜂蜜13份，红糖20份。b组服用酵素原料配方按重量份计，黑果枸杞20份，玛咖3份，蕨麻5份，沙棘粉2份，蜂蜜13份，红糖20份，菊粉5份。(2)负重游泳实验运动耐力的提高是抗疲劳能力加强最直接的表现，游泳时间的长短可以反映动物运动疲劳的程度。末次给予受试样品30min后，从各组随机取出5只小鼠，使其负重5％体重的铅皮置于游泳箱中游泳。水深不少于30cm，水温25±1.0℃，记录小鼠自游泳开始至死亡的时间，即小鼠负重游泳时间。表6酵素产品对小鼠负重游泳时间(st)的影响疲劳的最主要表现是运动耐力的下降，运动耐力是反映机体疲劳最直接、最客观的指标。负重游泳时间可反映小白鼠抗疲劳的能力。黑果枸杞酵素产品对小鼠负重游泳时间的影响见表6。由表6可知，对小鼠灌胃25d后，与对照组相比较，剂量组组小鼠负重游泳时间明显延长(p<0.05)。结果表明，黑枸杞酵素产品可以延长小鼠负重游泳时间，提高小鼠抗疲劳能力，其中a组为优势剂量组。(3)肝糖原测定测定原理蒽酮可与游离糖或多糖起反应，反应后溶液呈蓝绿色，于620nm处有最大吸收。测定其光密度，可以确定糖原的含量。测定方法末次给予受试样品30min后，从各组随机取出8只小鼠，将其处死，取肝脏经生理盐水漂洗后用滤纸吸干，精确称取100mg，加入8ml三氯醋酸，每管匀浆1min，将匀浆液倒入离心管，以3000r/min离心15min，将上清液转移至另一试管中。取1ml上清液放入10ml离心管中，加入95％乙醇4ml，用干净塞子塞上，室温下竖立放置过夜。沉淀完全后3000r/min离心15min，倒掉上清液使试管竖立放置10min。制作试剂空白和标准管：试剂空白：吸2ml蒸馏水到干净离心管。标准管：吸0.5ml葡萄糖标准液(含100mg/dl葡萄糖)和1.5ml蒸馏水放入同样的管子。此时对空白管、标准管及各测定管分别加入10ml蒽酮试剂，液流(蒽酮试剂)直接进入管子中央，保证充分混合好。从管子中注入蒽酮试剂起，将管子放在冷水龙头下冲凉。在所有管子都达到凉水温度后，将其浸于沸水浴(水浴深度略高于管子液面)15min，然后移到冷水浴。将管内液体移入比色管，在620nm波长下，用试剂空白管调零后测定吸光度。根据所称取的肝脏重量换算成肝糖原含量(以mg/g肝表示)，并进行统计分析。肝糖原含量计算公式如下：式中：du：样品管吸光度ds：标准管吸光度0.5：为0.5ml葡萄糖标准溶液中的葡萄糖含量0.9：为将葡糖糖换算成糖原的系数提取液体积：为8ml肝组织克数：为0.1g糖原的含量能说明疲劳发生的快慢或程度，肝糖原的作用主要是在饥饿或运动状态下分解进入血液，以维持血糖的稳定，这在耐力运动中尤为重要，肝糖原的储备不足可能会导致疲劳提前发生。黑枸杞酵素产品对小鼠肝糖原含量影响的试验结果见表8。由表8可知，各组比较，试验组肝糖原水平明显高于对照组(p<0.01)。结果表明，黑枸杞酵素产品对维持肝糖原的高水平含量有十分积极的作用，其中a组为优势剂量组。(4)血清尿素测定测定原理：样品中尿素在氯化高铁－磷酸溶液中与二乙酰肟和硫胺脲共煮，形成一种红色的化合物diazine，其颜色的深浅与尿素含量成正比。与同样处理的尿素标准管比较，可求出尿素的含量。测定方法：末次给予受试样品30min后，从各组随机取出8只小鼠，在温度为30℃的水中不负重游泳90min，休息60min后拔眼球采全血0.5ml。置4℃冰箱约3h，血凝固后2000pm/min离心15min，取血清备用。按照尿素试剂盒进行操作，测定尿素氮的含量。试剂盒操作步骤按下表7进行：表7血尿酸试剂盒操作充分混匀，置于沸水浴10min，再于冷水中冷却。在520nm波长处，以蒸馏水调零，测定各管吸光度值。尿素含量计算公式如下：式中：标准液浓度值为200mg/l。表8酵素产品对小鼠肝糖原含量和血清尿素氮(bun)的影响血清尿素是蛋白质代谢的终产物，在激烈运动时血清尿素含量增高。研究表明，机体血清尿素含量随运动强度的增加而增加，机体对负荷的适应能力越差，血清尿素的增加就越明显。因此血清尿素可以灵敏的反映疲劳，是评价长时间中等强度机体疲劳最常用的的指标。在功能评价时血清尿素氮的含量直接代表了血清尿素氮水平。黑枸杞酵素对小鼠血清尿素氮含量的影响试验结果见表8。由表8可知，各组比较，对照组与两个剂量组有显著差异(p<0.01)，剂量组组小鼠血清尿素氮水平低于对照组；两个剂量组之间无显著差异。表明黑黑枸杞酵素产品可以适当降低小鼠血清尿素水平。(5)血乳酸测定测定原理在铜离子催化下，乳酸与浓硫酸在沸水中反应，乳酸转化为乙醛，乙醛与对羟基联苯反应产生紫色化合物，在波长560nm处有强烈的光吸收，故可进行定量测定。测定方法：末次给予受试样品30min后，从各组随机取出8只小鼠，不负重在30℃水中游泳10min后停止。于游泳前、游泳结束时以及游泳后休息20min,对小鼠进行内眦取血，每次20μl。自配试剂测定：于5ml试管中加入0.48ml1％naf溶液，准确吸取全血20μl加入试管底部，再加入1.5ml蛋白沉淀剂，振荡混匀，于3000r/min离心10min，取上清液，按下表9操作。表9血乳酸测定上述步骤完成后，摇匀，置30℃水浴30min，取出后放入沸水浴中加热90s，取出冷却至室温，在560nm处测定吸光值。血乳酸含量计算公式如下：式中：au：测定管吸光度as：标准管吸光度剧烈运动时，由于机体缺氧，丙酮酸在乳酸脱氢酶的催化下还原为酸性代谢产物血乳酸。血乳酸浓度升高时可引起组织ph值下降，破坏机体内环境的平衡，影响正常代谢，并引起肌肉收缩力和运动力的下降。因此，血乳酸在机体中的蓄积是导致运动性疲劳的一个重要原因。剧烈运动后血乳酸水平反映机体的疲劳程度，减少血乳酸的产生或加快血乳酸的清除，都可延缓疲劳的发生或加速疲劳的消除。血乳酸水平可以反映有氧代谢能力、疲劳的产生和消除速度，是判断是否疲劳的一个重要因素。表10酵素产品对血乳酸值(bla)的影响黑果枸杞酵素对小鼠血乳酸值的影响试验结果见表10。由表10可知，各组对血乳酸曲线下面积进行比较，剂量组组低于对照组(p<0.01))。结果表明，黑果枸杞酵素产品不但能减少运动过程中乳酸的产生，还能及时帮助机体快速清除体内乳酸，从而达到抗疲劳的作用。(6)安全性评价在功能性指标的同时，每组动物分别称体重及心脏、肝脏、肾脏、脾脏的湿重，将各试验剂量组小鼠的心脏、肝脏、肾脏、脾脏的湿重与对照组进行比较，最后进行统计分析。两个配方的酵素产品对小鼠体重影响的测定结果见表11。由表11可知，试验各组小鼠的初期体重均无显著差异(p>0.05)。灌胃25d后，其体重均呈增长趋势，但末期各试验剂量组小鼠的体重与对照组比较均无显著性差异(p>0.05)，结果表明黑枸杞酵素产品无明显增加小鼠体重的作用。表11酵素产品对小鼠体重(bw)的影响表12酵素产品对小鼠脏器湿重的影响两种酵素产品对小鼠脏器湿重的影响测定结果见表12。由表12可知，对所有小鼠灌胃25d后，称量各试验组小鼠的脏器，计算后各试验剂量组小鼠的脏器湿重与对照组比较均无显著性差异(p>0.05)，结果表明黑果枸杞酵素产品对小鼠脏器重量的影响不大，食用黑果枸杞酵素产品无毒副作用。以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的
技术领域：
，均同理包括在本发明的专利保护范围内。当前第1页12