本发明属于小麦水解蛋白深加工
技术领域：
，涉及一种利用小麦水解蛋白制备肠膜营养肽微球的方法。
背景技术：
：谷氨酰胺是肌体应激状态下的一种“条件必需氨基酸”，是肠道粘膜细胞代谢必需的营养物质，对于维持肠道粘膜上皮结构完整性十分重要。尤其是在疲劳、感染、外伤等严重应激状态下，肠道粘膜上皮细胞内谷氨酰胺很快耗竭。当肠道缺乏谷氨酰胺或食物、消化液等刺激时，肠道粘膜会发生萎缩，绒毛变稀、变短甚至脱落、肠道免疫功能严重受损。临床实践证明，肠外提供谷氨酰胺可有效防止肠道粘膜萎缩，增强肠道细胞活性，改善肠道免疫功能，维持正常肠道粘膜重量、结构及蛋白质含量，减少肠道细菌及内毒素易位。我国是小麦生产和消费大国。目前，小麦加工副产物-小麦水解蛋白(俗称谷朊粉)的产量在15万吨左右，占世界产量的30％以上。作为一种性质独特的蛋白，小麦水解蛋白紧密的三维网状结构和氨基酸结合方式导致其溶解性极低，限制了功能特性的发挥。值得注意的是，小麦水解蛋白氨基酸组成中谷氨酸含量高达35％以上，且大部分以谷氨酰胺形式存在，使得以小麦水解蛋白为原料通过生物酶解技术制备谷氨酰胺肽成为可能，也为小麦水解蛋白高值化利用提供了新的思路。现代消化理论认为分子量低于1000Da的低聚肽易于被机体直接消化吸收，具有转运速度快，耗能低的特点，特别是能够消除与游离氨基酸的吸收竞争，大大提高蛋白质的吸收利用率。但是当存在高浓度的谷氨酰胺肽时，有一部分谷氨酰胺肽无法充分利用，本发明以小麦水解蛋白为原料，采用小麦水解蛋白酶解与微球制备技术有机结合，从而实现了高谷氨酰胺低聚小麦肽以及肠膜营养肽微球有效制备，经动物试验证实，相较于高谷氨酰胺低聚小麦肽，该肠膜营养肽微球具有突出的肠道营养功效。本发明对于拓宽小麦水解蛋白应用范围，提高小麦水解蛋白附加值具有重要现实意义。技术实现要素：本发明提供了一种具有肠道营养功效的小麦谷氨酰胺肽微球的制备方法。本发明是通过下列技术方案实现的：一种利用小麦水解蛋白制备肠膜营养肽微球的方法，包括以下步骤：(1)配置小麦水解蛋白料液将小麦水解蛋白原料加水至蛋白质量浓度为5％-10％，调整悬浊液温度为60℃，并采用磁力搅拌的方法，持续搅拌30-45min，形成均匀悬浮液，备用；(2)分步酶解调节步骤(1)中悬浮液的pH值为7.0，维持温度50℃，添加悬浮液质量1.5-2.5％的Protamex复合蛋白酶进行酶解1h后，将反应液在95℃水浴条件下灭酶活15min，调节pH值为8.5，温度60℃，添加反应液质量1-2％的Alcalase碱性蛋白酶进行酶解1.5h，将反应液在95℃水浴条件下灭酶活15min后，通过分子截留量3kDa-10kDa的超滤膜进行超滤，滤出小分子目标肽，并收集截留的大分子底物；将收集到的大分子底物重复酶解过程1-2次，直至沉淀中蛋白含量低于5％；(3)小分子目标肽干燥将步骤(2)中所滤出的小分子目标肽，经冷冻干燥去除水分，制得小麦谷氨酰胺肽粉；(4)肠膜营养肽微球制备配置质量浓度2％的海藻酸钠水溶液，将步骤(3)中的小麦谷氨酰胺肽粉加入海藻酸钠水溶液中，搅拌均匀后，加入质量浓度1％壳聚糖溶液和质量浓度2％氯化钙水溶液，混匀后，温育1-2h，经冷冻干燥或喷雾干燥法去除水分，制成小麦谷氨酰胺肽微球，即肠膜营养肽微球。上述技术方案中，所述小麦水解蛋白粉的原料为谷朊粉或由小麦粉提取制备的小麦水解蛋白，其蛋白质含量≥80％。上述技术方案中，步骤(4)中海藻酸钠与小麦谷氨酰胺肽粉质量比为1：2-3。本发明的有益效果在于：(1)本发明中所使用的小麦水解蛋白粉，由武汉科泰生化科技股份有限公司提供，是一种蛋白质含量高，水溶性好的小麦水解蛋白粉，避免了小麦水解蛋白粉遇水结团、酶解效率低下的问题。(2)当存在高浓度的谷氨酰胺肽时，有一部分谷氨酰胺肽无法充分吸收利用，本发明的肠膜营养肽微球通过控制谷氨酰胺从该微球中的释放速率，降低谷氨酰胺进入机体的吸收速率，从而起到更佳的肠道营养功效。本发明以小麦水解蛋白为原料，采用小麦水解蛋白酶解与微球制备技术有机结合，从而实现了小麦谷氨酰胺肽以及肠膜营养肽微球有效制备，经动物试验证实，相较于高谷氨酰胺低聚小麦肽，该肠膜营养肽微球具有突出的肠道营养功效。(3)本发明中，肠膜营养肽微球在胃酸作用下分解出谷氨酰胺和壳聚糖，壳聚糖进入肠道后，可以增殖肠道内的有益菌群，抑制有害菌群，促进肠道蠕动，清除大肠内的宿便和毒素，调节肠道功能。同时壳聚糖和谷氨酰胺能改善动物肠粘膜结构，提高消化器官功能，增加回肠、十二指肠等的肠绒毛长度，改善肠道内环境，促进肠绒毛的生长发育，增加肠道对营养物质的吸收。(4)本发明制得的肠膜营养肽微球具有突出的肠膜营养功效，可作为临床用药或食品、保健品、饲料的配料，拓宽了小麦水解蛋白应用范围，对于提高小麦水解蛋白附加值具有重要现实意义。附图说明图1肠膜营养肽微球体外释放曲线。具体实施方式以下结合附图和具体实施例对本发明作进一步的详细描述：下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的原料、试剂等，如无特殊说明，均为市售购买产品。本发明使用的小麦水解蛋白粉，由武汉科泰生化科技股份有限公司提供，武汉科泰生化科技有限公司生产的小麦水解蛋白粉是以面粉为原料提取的可溶性植物(小麦)蛋白，是一种以多肽、小分子蛋白和氨基酸形式存在的水溶性小麦蛋白，是一种具有高蛋白含量(80％以上)，溶解度高(95％以上)、并含很高的谷氨酰胺(30％左右)及高卫生标准(食品级)、低灰分(小于1.2％)的蛋白质。本发明所用的复合蛋白酶Protamex(1.5Au/g)由丹麦诺维信公司提供，碱性蛋白酶(Alcalase2.4L)由丹麦诺维信公司提供。实施例1：肠膜营养肽微球制备的制备1、一种利用小麦水解蛋白制备肠膜营养肽微球的方法，包括以下步骤：(1)配置小麦水解蛋白料液将10g小麦水解蛋白原料加水至蛋白质量浓度为5％-10％，调整悬浊液温度为60℃，并采用磁力搅拌的方法，持续搅拌30-45min，形成均匀悬浮液，备用；(2)分步酶解调节步骤(1)中悬浮液的pH值为7.0±0.5，维持温度50±2℃，添加悬浮液质量1.5-2.5％的Protamex复合蛋白酶进行酶解1h后，将反应液在95℃水浴条件下灭酶活15min，调节pH值为8.5，温度60℃，添加反应液质量1-2％的Alcalase碱性蛋白酶进行酶解1.5h，将反应液在95℃水浴条件下灭酶活15min后，通过分子截留量3kDa-10kDa的超滤膜进行超滤，滤出小分子目标肽，并收集截留的大分子底物；将收集到的大分子底物重复酶解过程1-2次，直至沉淀中蛋白含量低于5％；(3)小分子目标肽干燥将步骤(2)中所滤出的小分子目标肽，经冷冻干燥去除水分，得到5.8g小麦谷氨酰胺肽粉；(4)肠膜营养肽微球制备配置质量浓度2％的海藻酸钠水溶液，将步骤(3)中的小分子目标肽加入海藻酸钠水溶液中，其中海藻酸钠与小麦谷氨酰胺肽粉质量比为1：2-3，搅拌均匀后，加入质量浓度1％壳聚糖溶液和质量浓度2％氯化钙水溶液，混匀后，温育1-2h，喷雾干燥法去除水分，制得2.1g小麦谷氨酰胺肽微球，即肠膜营养肽微球。进一步的，小麦水解蛋白原料为谷朊粉或由小麦粉提取制备的小麦水解蛋白，其质量指标符合蛋白(干基)≥80％，灰分(干基)≤2.0，粗脂肪(干基)≤2.0，淀粉(干基)≤15％。本发明中，肠膜营养肽微球在胃酸作用下分解出谷氨酰胺和壳聚糖，壳聚糖进入肠道后，可以增殖肠道内的有益菌群，抑制有害菌群，促进肠道蠕动，清除大肠内的宿便和毒素，调节肠道功能。同时壳聚糖和谷氨酰胺能改善动物肠粘膜结构，提高消化器官功能，增加回肠、十二指肠等的肠绒毛长度，改善肠道内环境，促进肠绒毛的生长发育，增加肠道对营养物质的吸收。2、肠膜营养肽微球包封率和释放性能测试以ZetasizerNanoZS90的激光粒度测定仪对肠膜营养肽微球进行粒度测定，少量样本(约10mg)溶于10ml去离子水中进行测定，超声分散5min，测定粉末的平均粒径在1.5±0.2um。肠膜营养肽微球包封率和载药率：取0.8g肠膜营养肽微球置于200mL0.5mol/L的HCl溶液60℃回流8h，待微球完全溶解，3000倍稀释后，采用高效凝胶过滤色谱法对肠膜营养肽微球中谷氨酰胺的含量进行检测；同时将小麦谷氨酰胺肽粉3×106倍稀释后，采用高效凝胶过滤色谱法对小麦谷氨酰胺肽粉中的谷氨酰胺的含量进行检测；肠膜营养肽微球的包封率(％)＝(微球中谷氨酰胺的质量/投入小麦谷氨酰胺肽中谷氨酰胺的质量)×100％；肠膜营养肽微球的载药量(％)＝(微球中谷氨酰胺的质量/肠膜营养肽微球的质量)×100％，见表1。表1肠膜营养肽微球的性能肠膜营养肽微球总质量2.10微泡中谷氨酰胺含量(ug·mL-1)0.94微泡总含谷氨酰胺质量(g)1.48载药量(％)70.5小麦谷氨酰胺肽中谷氨酰胺含量(ug·mL-1)1.14小麦谷氨酰胺肽中谷氨酰胺总质量(g)2.28g包封率(％)64.9小麦谷氨酰胺肽中谷氨酰胺比值(％)39.3肠膜营养肽微球体外释放：将肠膜营养肽微球放入透析袋中，加入磷酸盐缓冲溶液(PBS，pH＝6.5)，用透析夹夹紧，置于PBS中，同时水浴控制温度37℃。分别在1、2、4、6、8、10、12h从外部溶液中取样，同时补充PBS。采用高效凝胶过滤色谱法对肠膜营养肽微球体外释放不同时段(1、2、4、6、8、10、12h)外部溶液中谷氨酰胺的含量进行检测谷氨酰胺的含量进行检测，并计算谷氨酰胺累计释放量及累计释放百分比，计算结果见表2，以时间为横轴，谷氨酰胺累计释放百分比作图，如图1所示。计算公式为：累计释放百分比＝某时刻的谷氨酰胺累计释放量/总包载的谷氨酰胺量×100％，见表2。表2肠膜营养肽微球体外释放由表2可知，微球在12h之内释放76.6％，具有良好的缓释效果，可通过控制谷氨酰胺从该微球中的释放速率，降低谷氨酰胺进入机体的吸收速率，从而起到更佳的肠道营养功效。本实施例中采用高效凝胶过滤色谱法对谷氨酰胺的含量进行检测，色谱条件如下：HLPC色谱仪型号：LC-20A；色谱柱：NH￠4.6×250mm，色谱柱号：312316；流动相：乙腈/磷酸二氢钾＝30/70(V/V)，其中磷酸二氢钾浓度为0.05mol/L：取6.8g磷酸二氢钾，加水至1000mL，用磷酸调节PH值为4.0；检测波长：UV215nm；流速：1.0ml/min；柱温：35℃。实施例2：肠膜营养肽微球对幼仔肠膜的作用研究实验分组：A组：小麦水解蛋白粉；B组：小分子目标肽(本发明中小分子目标肽经冷冻干燥或喷雾干燥法去除水分，制成小分子目标肽粉)；C组：肠膜营养肽微球；D组：0.9％生理盐水(1)肠膜营养肽微球对仔猪肠膜的作用研究取12头30日龄、体重相近的仔猪，平均分为4个组。实验设A组：饲喂小麦水解蛋白粉(3g/kg/d)；B组：饲喂小麦谷氨酰胺肽粉(3g/kg/d)；C组：饲喂肠膜营养肽微球(3g/kg/d)；D组：饲喂0.9％生理盐水3ml，从当天开始，各组除基础饲料喂食，随意摄水正常饲喂外，按实验各组设计的剂量喂食1次/d。进行一周饲喂后，将实验仔猪放血处死，外科手术方法打开腹腔，取出十二指肠组织，生理盐水冲洗干净后，放入10％中性甲醛中固定，常规脱水，石蜡包埋，切片HE染色后光镜下观察十二指肠黏膜结构的变化，结果见表3。表3仔猪十二指肠粘膜结构的变化由表3可知，相较于D组的正常饲喂，A组、B组和C组均对仔猪的十二指肠黏膜有促进生长发育作用，相较于A组小麦水解蛋白粉、B组小麦谷氨酰胺肽粉，C组肠膜营养肽微球对幼犬肠粘膜生长发育的促进作用更强，肠绒毛长度变长且隐窝深度变浅，肠绒毛长度/隐窝深度比值变大，从而使得仔猪的生产性能升高。(2)肠膜营养肽微球对幼犬肠膜的作用研究取24只体重3.0±0.5kg幼犬，平均分为4个组。实验设A组：饲喂小麦水解蛋白粉(2g/kg/d)；B组：饲喂小麦谷氨酰胺肽粉(2g/kg/d)；C组：饲喂肠膜营养肽微球(2g/kg/d)；D组：饲喂0.9％生理盐水2ml，从当天开始，各组除基础饲料喂食，随意摄水正常饲喂外，按实验各组设计的剂量喂食1次/d。进行一周饲喂后，将实验幼犬放血处死，外科手术方法打开腹腔，取出十二指肠、回肠组织，生理盐水冲洗干净后，放入10％中性甲醛中固定，常规脱水，石蜡包埋，切片HE染色后光镜下观察十二指肠和回肠的小肠绒毛高度，结果见表4。表4幼犬十二指肠和回肠的肠绒毛高度十二指肠的肠绒毛长度/um回肠的肠绒毛长度/umA组557.9±4.3427.6±4.3B组587.5±3.5496.5±3.5C组645.7±2.4539.4±2.4D组443.7±9.1355.1±9.1由表4可知，相较于D组的正常饲喂，A组、B组和C组均对幼犬的十二指肠和回肠有促进生长发育作用，相较于A组小麦水解蛋白粉、B组小麦谷氨酰胺肽粉，C组肠膜营养肽微球对幼犬肠粘膜生长发育的促进作用更强，另外C组中肠绒毛长度更加均匀，肠粘膜的消化机能更健全。本研究表明，依据该发明方法所制备的肠膜营养肽微球对幼仔具有显著的促进肠粘膜生长发育的效果，具有理想的肠道营养功效。本发明制得的肠膜营养肽微球具有突出的肠膜营养功效，可作为临床用药或食品、保健品、饲料的配料，拓宽了小麦水解蛋白应用范围，对于提高小麦水解蛋白附加值具有重要现实意义。最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围中。当前第1页1 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