多菌种混合发酵秸秆的方法与流程

本申请涉及饲料领域，特别是一种多菌种混合发酵秸秆的方法。
背景技术：
：农作物秸秆是自然界中最为丰富的可再生资源之一，是潜在的动物饲料资源，我国农作物秸秆的综合利用技术正朝着多元化的方向发展,主要的利用途径有秸秆还田利用技术、秸秆饲料利用技术、秸秆原料利用技术以及秸秆能源利用技术等。秸秆还田是秸秆综合利用的一条主要途径，但秸秆还田存在很多问题：由于人均耕地少，机械化程度较低，耕地复种指数高，倒茬时间短，秸秆还田后不能有效降解，而且秸秆碳氮比高，还田费用过高，给秸秆还田带来困难，严重影响农民积极性；每年还有大量的秸秆没有被充分利用，大量被焚烧，大量被抛入水体，造成环境污染，形成了社会公害。秸秆主要成分有：纤维素、半纤维素、木质素、水分和少量粗蛋白、脂肪等有机物。其营养价值低，适口性差，消化率低，秸秆中钙、磷含量低，硅酸盐含量高，直接作为饲料的饲喂效果并不好（张秀芬等，1991）。因此秸秆用作饲料，需要对其进行一定的加工处理。现有秸秆饲料的加工处理方法可分为即物理法、化学法、生物处理法三种类型。物理法可部分破坏秸秆纤维的晶体结构，削弱纤维素、木质素之间的结合，增加秸秆与畜禽消化液的接触面积，能减少咀嚼时间及饲料的浪费，但该方法对于粗饲料营养价值几乎没有提高，秸秆中的粗纤维等含量也没有减少，对消化率的提高不大，并且饲料在瘤胃中停留的时间缩短，导致发酵不完全，牛羊易引起反刍停滞。化学法主要通过破坏木质素与纤维素的结合，增加化学试剂的接触面积来提高秸秆饲料的消化率，但该方法因成本太高，易照成污染，目前在生产中几乎很少被推广应用。生物处理法是目前综合效益最佳的秸秆处理方法，进一步可分为青贮、微贮发酵、酶解等方法；微贮发酵是农作物秸秆提高其营养价值的秸秆处理方法，其通过加入对木质素、纤维素有较强降解能力的菌种进行发酵，从而促进秸秆中纤维素、半纤维素和木质素的分解，改善秸秆的适口性，提高其消化率，并增加营养；其作用机理一是使半纤维素-木聚糖链和木质素聚合物的酯链降解，增加了秸秆的柔软性和膨胀度，使瘤胃微生物能直接与纤维素接触，有利于消化；二是在发酵过程中，部分木质纤维素类物质被转化为糖类；三是由于微贮饲料中所含酶和其他生物活性物质的作用，提高了反刍动物瘤胃微生物区系的纤维酶和降解酶的活性，从而提高了对秸秆的消化能力。但微贮发酵技术中，发酵产物受菌种和发酵条件的影响较大，现有技术中单一菌种的发酵效果不能满足牲畜牲口适口性、营养性及经济效益的需求。技术实现要素：针对上述问题，本发明提供一种绿色木霉（trichodermavivid）和红芝（ganoderma）混合发酵秸秆纤维，同时对秸秆发酵培养基及培养条件进行优化，获得秸秆纤维素、半纤维素、木质素降解率。一种多菌种混合发酵秸秆的方法，其具体步骤如下：将红芝种子液（含菌量y约为10g/l）按照体积比15%接种于秸秆培养基上，30℃培养8天，然后按照体积比15%接种绿色木霉种子液（该种子液含菌量约为0.8g/l），30℃继续培养8天，即获得发酵后的秸秆；本发明中，绿色木霉种子液优选绿色木霉zjuv18种子液（绿色木霉zjuv18参见文献：“紫外线诱变纤维素酶高产菌株的筛选及其酶活力”张君胜等，贵州农业科学，2011）。所述秸秆培养基包括质量比为1：1.5的固体培养基和液体培养基；所述固体培养是由稻草秸秆与麸皮按照质量比7：3混合获得；将溶液倒入固体干料中充分搅拌均匀，分装入500ml三角瓶中，装液量为50g/瓶，121℃灭菌30min；所述液体培养基配制方法如下：硫酸铵40g，尿素10g，磷酸二氢钾10g，碳酸钙10g，七水硫酸镁5g，氯化钴2g溶于3l水中。本发明中，红芝种子液是通过如下方法获得的：将红芝菌株接种到pda平皿培养基上，28℃条件下，150r/min振荡培养4-6h；选取菌苔前端接种于白腐真菌増富培养基中，28℃恒温摇床(150r/min)培养4~6d，至长出较多可见的白色菌丝球。所述绿色木霉种子液是通过如下方法获得的：将菌株（优选绿色木霉zjuv18）接种到pda平皿培养基上培养培养4d，用无菌水洗下经活化的孢子，将菌株接入绿色木霉増富培养基中，置28℃、150r/min，振荡培养24h，菌株处于对数生长期。通过本申请提供的多菌种混合发酵秸秆的方法，所获得的发酵终产物纤维素的降解率达到43.1%，半纤维素降解率达到41.9%，木质素的降解率达到40%，较优化之前的35.7%、36.9%、21.8%分别提升21%、14%、83%，其中木质素降解率经优化后提升较明显。附图说明图1为不同培养时间各菌株的滤纸酶活动态示意图。具体实施方式稻草秸秆：采集自江苏省泰州市海陵区农田，自然风干。经测定稻草纤维素、半纤维素以及木质素含量分别为：37.93%、28.89%和6.92%。80℃烘干，粉碎过40目筛。pda培养基：马铃薯200g，加水800ml，煮沸30min，用四层纱布过滤，加入葡萄糖20g，琼脂18g，补足水至1000ml,ph值自然，121℃灭菌20min。绿色木霉増富培养基：葡萄糖15g，蛋白胨10g，酵母膏10g，硫酸铵2.5g，磷酸二氢钾6g，氯化钙1g，七水硫酸镁0.8g，碳酸钙0.4g，加水溶解定容至1l，调节ph至4.8。分装入500ml三角瓶中，装液量为100ml/瓶。121℃灭菌20min。白腐真菌增富培养基：取新鲜马铃薯200g，去皮并切成小块，放入1000ml水中煮沸约20min，用8层纱布过滤后加入20g葡萄糖，并补水至1000ml，加入10g秸秆粉，100ml每瓶分装于500ml三角瓶，121℃灭菌30min。固体发酵产培养基（2kg干料）：稻草粉1400g，麸皮600g；称取硫酸铵40g，尿素10g，磷酸二氢钾10g，碳酸钙10g，七水硫酸镁5g，氯化钴2g溶于4l水中；将溶液倒入固体干料中充分搅拌均匀，分装入500ml三角瓶中，装液量为50g/瓶，121℃灭菌30min。显色剂：称取3，5—二硝基水杨酸3.15g，加水500ml搅拌溶解，水浴至45℃，然后逐步加入氢氧化钠溶液（20gnaoh溶于100ml水中）100ml，同时不断搅拌，直至完全溶解，再逐步加入酒石酸钾钠91.0g、苯酚2.50g和无水亚硫酸钠2.50g，搅拌至溶解，冷却到室温后，定容至1000ml。过滤，取滤液贮存于棕色瓶中，避光保存。室温下存放7d后可以使用，有效期为6个月。（1%）：准确称取1.000g羧甲基纤维素钠用ph4.8乙酸缓冲液溶解并定容至100ml。水杨素（1%）：准确称取0.25g水杨素用ph4.8乙酸缓冲液溶解并定容至25ml。溶液（0.160mmol/l）：取0.0l223gazureb（天青b）染料，用200ml蒸馏水溶解，然后定溶至250ml。22溶液：用微量进样器移取57ul30%的h2o2溶液，然后用蒸馏水定容至250ml。22溶液：用微量进样器移取45.6ul30%的h2o2溶液，然后用蒸馏水定容至25oml。乳酸钠缓冲液（ph4.5）：（1）乳酸钠0.56ml乳酸钠于100ml水中；（2）乳酸0.45ml于100ml水中。用乳酸溶液调乳酸钠溶液ph为4.5即可。邻联甲苯胺：称取0.0714g邻联甲苯胺，溶于100ml水中。％水杨酸苷溶液：准确称取0.5g水杨酸苷于100ml小烧杯中，用少量0.05mol/lph4.5的柠檬酸缓冲液溶解后，移入100ml容量瓶中并用0.05mol/lph4.5的柠檬酸缓冲液定容至100ml，充分混匀。4℃冰箱中保存备用，用于测定β-葡萄糖苷酶活力。菌株来源：绿色木霉（trichodermavivid）zjuv18参见文献：“紫外线诱变纤维素酶高产菌株的筛选及其酶活力”张君胜等，贵州农业科学，2011，由江苏农牧科技职业学院微生物实验室保存。白腐菌株：包括平菇（pleurotusostreatus）、红芝（ganoderma）、黄孢原毛平革菌（phanerochaetechrysosporium）均购自武汉食用菌栽培研究所。实施例1混合菌株筛选实验1、菌株活化将冰箱中保存的绿色木霉及白腐真菌（平菇、红芝、黄孢原毛平革菌）的菌株接种到pda平皿培养基上，28℃培养，待长出孢子再转接，一般转接活化2～3次。绿色木霉培养4d，白腐真菌培养6d，于4℃保存备用。2、种子扩增绿色木霉：用无菌水洗下经活化的孢子，将菌株接入三角瓶液体绿色木霉増富培养基中，置28℃、150r/min，振荡培养24h。培养后的含菌量大致为0.8g/l(菌丝干重)。白腐真菌：选取菌丝长势旺盛的平板，取菌苔前端接种于白腐真菌増富培养基中，28℃恒温摇床(150r/min)培养4~6d，至长出较多可见的白色菌丝球，培养后的含菌量大致为10g/l(菌丝干重)。3、固体发酵将培养好的种子液按10%的接种量，接种到固体发酵培养基上，28℃恒温培养。4、制备粗酶液取发酵后的湿曲1g，用10ml的0.1mol/l的乙酸-乙酸钠缓冲液振荡洗涤1h，30℃浸提2h，过滤除杂，3000r/min离心10min，取上清液即为质量比为1:10的粗酶液。5、测定酶活力5.1dns法测定纤维素酶活性（滤纸酶活力fpa）①取4支15ml具塞刻度的试管，各加0.2ml酶液，再加0.1mph4.8乙酸缓冲液1.8ml；②取其中3支作为测定管，各加入50mg滤纸(1×6cm)一条，于50℃保温酶解反应1h，(先预热5分钟)；另一支作为空白管同时置50℃恒温水浴1h；③分别加入dns显色液2ml，空白管同时加50mg的滤纸；④放沸水浴锅反应10min，冷却后加蒸馏水至15ml，以空白管调零，在550nm吸收峰下用分光光度计测od值。纤维素酶活力=u/g(ml)式中:w:从葡萄糖标准曲线中查得的葡萄糖的浓度n:酶液的稀释倍数t:酶促反应的时间m:所加酶液的体积葡萄糖标准曲线绘制方法：葡萄糖标准溶液的配制：无水葡萄糖80℃烘干至恒重，准确称取100mg溶于100ml水中，加1mg叠氮化钠防腐，4℃冷藏备用。取15ml具塞刻度试管7支，加入葡萄糖标准溶液0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2ml，加蒸馏水2.0、1.8、1.6、1.4、1.2、1.0、0.8ml，加dns试剂2ml，混匀后在沸水浴中加热10min，取出立即用冷水冷却，用水定容至15ml，摇匀，测od值，以吸光度为横坐标，葡萄糖的含量为纵坐标，绘制标准曲线。5.2木质素酶活性测定（1）锰过氧化物酶（mnp）活性测定取50mmol/l的乳酸钠缓冲液（ph4.5）3.4ml，1.6mmol/l的mnso4溶液0.1ml，0.4ml的培养基滤出溶液，预热至37℃加入1.6mmol/l的h2o2溶液0.1ml启动反应。测定240nm处最初3min内吸光度，1个酶活力单位用每分钟每克培养基滤液增加0.1od来表示。（2）木质素过氧化物酶（lip）活性测定取125mmol/l的酒石酸钠缓冲液（ph3.0）1ml，0.160mmol/l的azureb溶液500μl，培养基滤出液500μl，30℃下加入2mmol/l的h2o2溶液500μl启动反应，测波长651nm反应最初3min内吸光度变化。1个酶活力单位用每分钟每克培养基滤液增加0.1od来表示。（3）漆酶（lac）测定将0.5ml3.36mmol/l邻联甲苯胺3.4ml，0.1mol/l醋酸缓冲溶液（ph4.6）和0.1ml酶液混合于28℃反应10min，在600nm测吸光度，1个酶活力单位用每分钟每克培养基滤液增加0.1od来表示。6、混合菌株发酵筛选6.1菌株兼容性实验分别将3种白腐真菌与绿色木霉同时点接入同一pda平板上，28℃静置培养6天，观察其生长情况，比较同一平板上两菌种的生长优势，以便进行下一步混合发酵试验。经过6天的pda平板培养，绿色木霉的绿色菌丝占据了将近整个平板，而平菇、红芝及黄孢原毛平革菌3种白腐真菌的菌落都较小。说明绿色木霉生长优势比白腐真菌大，前者对后者产生了竞争抑制性作用，如果将两种菌株同时接种发酵，绿色木霉的菌丝生长速度较快，会夺取培养基的大部分营养成分，抢占生长空间，白腐真菌的生长会受到绿色木霉的抑制。因此混菌发酵时，需将绿色木霉与白腐真菌分开进行二步混合发酵，即先在固态培养基中接入弱势的白腐真菌，待其生长一定时间后，再接入绿色木霉。不同培养时间各菌株的滤纸酶活（u/ml）如表1和图1所示：由表1和图1可见，绿色木霉在培养第4天时出现酶活高峰，达到816.7u/ml，白腐真菌在培养8-10d时，开始表现出纤维素酶活高峰，但纤维素酶活较绿色木霉要低的多。各菌株滤纸酶活并不是随培养时间的增加产酶也随之增加，原因是菌体快速繁殖，到达对数生长后期，由于营养物质消耗殆尽及溶解氧浓度低下，酶菌活力降低，从而使产酶量降低，绿色木霉生长速度较白腐真菌快，所以较早达到产酶高峰。根据各菌株滤纸酶活动态变化，确定绿色木霉降解秸秆纤维素最佳时间为3-4d，白腐真菌为8-10d。6.2秸杆降解菌的混合发酵试验白腐真菌和绿色木霉菌的发酵组合如表2所示：表2注：h表示白腐真菌，t表示绿色木霉，h4-t4组合表示在固体培养基中先接入白腐真菌，培养4天后再接入绿色木霉培养4天，共同培养8天，表中其他组合均以此类推6.2.1平菇和绿色木霉组合发酵稻草秸秆平菇与绿色木霉zjuv18组合对稻草的降解率如表3所示：表3注：同列标不同字母表示差异显著（p<0.05），同列标相同字母表示差异不显著（p＞0.05）从表中可以看出，纤维素降解率最高的组合有h8-t8、h8-t6、h12-t8，其中h8-t8显著高于其他各组（p<0.05）。半纤维素降解率最高的组合有h8-t8、h12-t8，其中h8-t8显著高于其他各组（p<0.05）。木质素降解率最高的组合有h8-t8、h12-t4、h12-t6、h12-t8，均显著高于其他组合（p<0.05）。从总体降解率来看，较高的组合为h8-t8和h12-t8，但h8-t8组合发酵需要的时间为16天，较h12-t8能节省4天发酵时间，故最佳组合为h8-t8，即先接种平菇培养8d再接种绿色木霉二次发酵8天，其纤维素降解率为35.1%，半纤维素的降解率为37.5%，木质素降解率达到16.8%。6.2.2黄孢原毛平革菌和绿色木霉组合发酵稻草秸秆黄孢原毛平革菌和绿色木霉zjuv18对稻草培养基的纤维素、半纤维素、木质素的降解率如表4所示：表4注：同列标不同字母表示差异显著（p<0.05），同列标相同字母表示差异不显著（p＞0.05）从表中可以看出，黄孢原毛平革菌与绿色木霉zjuv18组合发酵稻草秸秆，纤维素降解率最高的组合有h8-t8、h8-t6、h4-t8，这3个组合均显著高于其他各组（p<0.05）。半纤维素降解率最高的组合有h8-t8、h8-t6、绿色木霉zjuv18（20d）、h4-t8、h12-t8，其中h8-t8显著高于其他各组（p<0.05）。木质素降解率最高的组合有h8-t6、h8-t8、h12-t4、h12-t6、h12-t8，均显著高于其他组合（p<0.05）。从总体降解率来看，最优的组合为h8-t8和h8-t6。6.2.3红芝和绿色木霉组合发酵稻草秸秆红芝和绿色木霉zjuv18对稻草培养基的纤维素、半纤维素、木质素的降解率如表5所示：表5注：同列标不同字母表示差异显著（p<0.05），同列标相同字母表示差异不显著（p＞0.05）从表中可以看出，红芝与绿色木霉zjuv18组合发酵稻草秸秆，纤维素降解率最高的组合有h8-t8、h8-t6，这2个组合均显著高于其他各组（p<0.05）。半纤维素降解率最高的组合有h8-t8、h8-t6，其中h8-t8显著高于其他各组（p<0.05）。木质素降解率最高的组合有h8-t8、h12-t4、h12-t6、h12-t8，其中h8-t8、h12-t4均显著高于其他组合（p<0.05）。从总体降解率来看，最优的组合为h8-t8。6.2.4白腐真菌和绿色木霉发酵稻草秸秆最优组合各白腐真菌最优组合对稻草培养基的纤维素、半纤维素、木质素的降解率如表6所示：表6注：同列标不同字母表示差异显著（p<0.05），同列标相同字母表示差异不显著（p＞0.05）从上表中可以看出，经过3种白腐真菌与绿色木霉各最佳发酵组合之间的对比，纤维素降解率各组合差异均不显著（p＞0.05），半纤维素降解率黄孢原毛平革菌组合显著低于平菇、及红芝组合（p<0.05），木质素降解率红芝组合显著高于其他3组（p<0.05）。3种白腐真菌与绿色木霉zjuv18的各种发酵时间组合中，纤维素、半纤维素、木质素降解率总体最优组合为：先接种红芝培养8d，再接种绿色木霉zjuv18二次发酵8天。其纤维素降解率达到35.7%，半纤维素降解率达到36.9%，木质素降解率达到21.8%。结合各菌株纤维素及木质素酶活的测定结果，绿色木霉zjuv18纤维素降解能力较强，生长相对较快。白腐真菌木质素降解能力较强，生长速度相对较慢。混菌发酵既要考虑到各菌种产酶量及发酵时间的关系，又要根据菌株本身对生长环境，营养成分的需求，接种间隔时间较长，培养基成分不足以维持二次发酵接种菌的生产，产酶会受限制。接种时间较短，生长优势菌种又会抢夺资源，影响先接种菌的产酶。经过个不同发酵时间段的组合筛选，最终确定红芝与绿色木霉组合对秸秆降解效果最好。实施例2发酵条件筛选试验1、不同的秸秆和麸皮比例对降解效果的影响于28℃培养，自然ph下，用红芝h8-t8组合进行混菌发酵，终止发酵后来测定半纤维素、纤维素和木质素的降解率如表7所示：表7注：同列标不同字母表示差异显著（p<0.05），同列标相同字母表示差异不显著（p＞0.05）从表中可以看出，纤维素、半纤维素和木质素的降解率随固体培养基中秸秆与麸皮的比例不同而发生变化，适当添加麸皮有助于促进菌种发酵过程中各相关酶的产生。当稻草麸皮比为7:3时，降解效果最好。纤维素的降解率最高的比例分别是7:3、8:2，三者差异不显著（p>0.05）。半纤维素的降解率最高的比例分别是7:3、8:2、6:4，两者差异不显著（p>0.05）。木质素的降解率最高的比例分别是7:3、8:2，两者差异不显著（p>0.05）。原因可能是作为一种辅助碳源，麸皮中含有促进微生物生长的因子，培养基中加入少量的麸皮能够提高产酶能力。添加麸皮过多又会使酶活降低，麸皮添加过量会增加培养基的粘度，从而影响培养基的通气性，不利真菌生长产酶，所以降解率会降低。2、不同培养基料水比对降解效果的影响设置固体发酵培养基中料水比分别为1:1、1:1.5、1:2、1:2.5、1:3五种比例，其他条件一致，于28℃培养，自然ph下，用红芝h8-t8组合进行混菌发酵，终止发酵后来测定半纤维素、纤维素和木质素的降解率，结果如表8所示：表8固体发酵培养基中不同料水比对稻草秸秆的降解率注：同列标不同字母表示差异显著（p<0.05），同列标相同字母表示差异不显著（p＞0.05）从表中可以看出，在料水比为1:1.5的情况下，纤维素、半纤维素及木质素降解率均最高。纤维素及半纤维素的降解率料水比分别为1:1.5和1:2时最高，两者差异不显著（p>0.05）。木质素的降解率料水比为1:1.5时显著高于其他个组（p＜0.05）。在发酵过程中，培养基的气体交换能力是影响菌种对秸秆降解作用的重要因素之一。而气体交换量很大一部分是由固、液相之比决定。含水量过高或过低都会抑制真菌的生长产酶。3、不同接种量对降解效果的影响设置红芝和绿色木霉zjuv18的接种量分别都为5%、10%、15%、20%、25%五种比例，其他条件一致，于28℃培养，自然ph下，用红芝h8-t8组合进行混菌发酵，终止发酵后来测定半纤维素、纤维素和木质素的降解率如表9所示：表9不同接种量对稻草秸秆的降解率注：同列标不同字母表示差异显著（p<0.05），同列标相同字母表示差异不显著（p＞0.05）从表中可以看出，两菌种的接种量在10%、15%时，纤维素和半纤维素的降解率显著高于其他各组（p＜0.05），木质素降解率接种量在15%时显著高于其他各组（p＜0.05）。分析原因可能是由于接种量过低，一方面微生物生长缓慢，延长发酵周期；另一方面，目的菌种生长优势确立较慢，容易受到杂菌污染。而接种量过高，又会导致微生物前期生长过于迅速，培养基中营养物质前期被大量消耗，并且微生物老化速度较快，从而不利于产酶，降解率不高。4、不同发酵温度对降解效果的影响设置发酵温度分别为24℃、26℃、28℃、30℃、32℃五种比例，其他条件一致，自然ph下，用红芝h8-t8组合进行混菌发酵，终止发酵后来测定半纤维素、纤维素和木质素的降解率如表10所示：表10不同接种量对稻草秸秆的降解率注：同列标不同字母表示差异显著（p<0.05），同列标相同字母表示差异不显著（p＞0.05）从表中可以看出，纤维素的降解率在发酵温度为26℃、28℃、30℃是最高，三者差异不显著（p>0.05），其中温度为28℃时，纤维素降解率最高。半纤维素的降解率最高的26℃、28℃、30℃、32℃，四种温度下差异均不显著（p>0.05）。木质素降解率最高的是26℃、28℃、30℃，三种温度下差异均不显著（p>0.05），但均显著高于其他两种发酵温度（p＜0.05）。温度高低主要影响发酵菌种的生长速度、产酶能力及酶活力，从而及秸秆中各成分的降解。温度过高，发酵培养基中自腐真菌和绿色木霉生长受到抑制，会降低秸秆的降解率；温度过低，则会导致固体发酵的进度减缓。5、正交试验结果分析在单因素试验基础上，选用秸秆麸皮比、培养基料水比、接种量和发酵温度进行4因子3水平的正交试验设计，正交设计采用表11、12所示：表11正交试验因素水平表表12红芝-绿色木霉混合发酵条件正交试验结果根据正交试验的极差分析，从表中可以看出各试验因素对试验指标的影响大小排序，影响纤维素降解率的试验因素排序为b>c>a>d，影响半纤维素降解率的试验因素排序为b>a>c>d，影响木质素降解率的试验因素排序为b>c>a>d。综合以上来看，对稻草秸秆降解率影响最大的因子为料水比，也就是固体发酵培养基的含水量，其次是菌种接种量及添加麸皮的比例，发酵温度的影响在因素水平范围里相对较小。经过优化，得出的最优培养方案为：a2b1c2d3，即稻草秸秆与麸皮比7:3，固体培养料与水比1:1.5，接种量为15%，发酵温度为30℃。在这种培养方案下，纤维素的降解率达到43.1%，半纤维素降解率达到41.9%，木质素的降解率达到40%，较优化之前的35.7%、36.9%、21.8%分别提升21%、14%、83%，其中木质素降解率经优化后提升较明显。根据优化方案，获得最佳培养基配方（以2kg干料为例）：稻草粉1400g，麸皮600g；称取硫酸铵40g，尿素10g，磷酸二氢钾10g，碳酸钙10g，七水硫酸镁5g，氯化钴2g溶于3l水中；将溶液倒入固体干料中充分搅拌均匀，分装入500ml三角瓶中，装液量为50g/瓶，121℃灭菌30min。最佳发酵条件：首先接种15%扩增好的红芝种子液（一般28℃条件下，150r/min振荡培养4-6h，至长出较多大小均匀的白色菌丝球），30℃条件下培养到第8天，再按照接种量15%接种扩增好的绿色木霉zjuv18种子液（一般28℃条件下，150r/min振荡培养24h-36h，处于对数生长期）同温度下再培养8d。实施例3混菌发酵的干物质消化率测定1、制备饲料样品根据实施例2筛选的最优组合及条件，制作稻草秸秆发酵饲料作为饲料样品，培养方法：首先接种15%（体积比）扩增好的红芝种子液（一般28℃条件下，150r/min振荡培养4-6h，至长出较多大小均匀的白色菌丝球），30℃条件下培养到第8天，再按照接种量15%（体积比）接种扩增好的绿色木霉zjuv18种子液（一般28℃条件下，150r/min振荡培养24h-36h，处于对数生长期）同温度下再培养8d；发酵条件：稻草秸秆与麸皮比7:3，固体培养料与水比1:1.5，接种量为15%（体积比），发酵温度为30℃。最佳培养基配方（2kg干料）：稻草1400g，麸皮600g；称取硫酸铵40g，尿素10g，磷酸二氢钾10g，碳酸钙10g，七水硫酸镁5g，氯化钴2g溶于3l水中；将溶液倒入固体干料中充分搅拌均匀，分装入500ml三角瓶中，装液量为50g/瓶，121℃灭菌30min。对照组采用自然风干的稻秸，苜蓿作为标准饲料样品，营养成分见表13：表13标准饲料样品、饲料样品及对照组的营养成分（%）2、原料即试剂羊粪液的制备：给6只健康的羊挂上集粪袋,收集1小时内排泄的粪样称重，把羊粪放入白磁盘中，按每50g鲜粪加预热好的kansas缓冲营养液300ml，带上手套将羊粪研细，充分搅拌之后用4层纱布过滤。配置好的鲜羊粪液放入39℃恒温箱中，并通入co2调节ph值在6.8~6.9范围内备用。kansas缓冲营养液：a液组成为，kh2po4，10g/l；mgso4.7h2o，0.5g/l；nacl,0.5g/l；cacl.h2o，0.1g/l。b液组成为：na2co3，15.0g/ml；na2s.9h2o，1.0g/100ml。使用时，每1000mla液和20mlb液混匀即成。胃蛋白酶：国药集团生产，活性为1:1000。3、检测步骤（1）称取200mg（精确到0.0001g）发酵饲料，放入30ml的玻璃试管中。饲料样品每个设置3个重复，每批样品的测定同时设置4个空白管，4至5个培养管作标准苜蓿草粉的干物质消化率的测定。（2）每个培养管内加入15mlkansas缓冲营养液，39℃水浴锅预热。（3）预热后，每个培养管加入5ml羊粪液，同时充二氧化碳气体，用橡胶塞塞住管口，放于39℃培养箱内培养。（4）在培养的第2、4、6、8、10、24小时。分别轻轻摇动离心管，使发酵饲料样品颗粒均匀分散于消化液中。（5）经过48小时培养以后，从培养箱内取出培养管，每个试管中分别加入3ml的酸性胃蛋白酶，胃蛋白酶是用100ml3n盐酸溶解10g胃蛋白酶配制而成，然后摇动均匀试管，调节ph值在1.2~1.6范围内，然后40℃恒温培养。（6）加入胃蛋白酶之后，分别在第2、4、6、8、10、24h时，各摇动1次试管。（7）经48小时的消化后，每个离心管加入5%hgcl2溶液1ml终止反应。（8）将培养管离心10min，转速3500rpm，倒掉上清液。再加蒸馏水5ml同转速和时间再离心一次，倒掉上清液，置于105℃烘干并称重。干物质消化率（ivdmd）的计算公式：ivdmd%=100-（w3-w1-w2）/w0*dm。其中：w0--样品重（g）；w1--105℃下离心管恒重（g）；w2--空白管残渣干重（g）；w3--离心管加残渣105℃恒重（g）；dm----样品干物质含量（%）。校正系数f的计算公式：f=dmdh/dmdx其中：dmdh—标准饲草样品（苜蓿草粉）干物质消化率的平均数（%）；dmdx—测试中某次测得标准饲草样品干物质消化率（%）。试验所测定的干物质消化率数据采用spss19.0软件进行统计分析。4、实验结果饲料消化率见表14：表14采集的羊粪液测定饲料样品的消化率(%)饲料样品对照（稻草）干物质消化率%65.17±1.45**28.78±1.13经测定，红芝与绿色木霉混合发酵稻草秸秆最优组合h8-t8发酵后的饲料干物质消化率达到65.17%，比对照组提高了1.26倍，差异极显著（p<0.01）。本试验采用羊粪液对经优化好的秸秆发酵饲料的干物质消化率进行测定。测得的稻草秸秆发酵饲料的消化率大大高于不经发酵的稻草秸秆，主要是由于经过红芝和绿色木霉的混合发酵，秸秆中的木质素被红芝部分降解，从而释放出了纤维素和半纤维素，而绿色木霉有较强的纤维素酶活，对纤维素等的降解能力较强，可以将秸秆中的纤维组分降解转化成易被消化吸收的糖类，从而提高动物对秸秆饲料的消化率。把经过红芝和绿色木霉混合发酵后的稻草秸秆用作饲料，一方面消化率得到提高，另一方面，微生物发酵过程中还会产生许多对动物有利的代谢产物，菌体本身也是一种优良蛋白。实施例4秸秆发酵饲料在湖羊育肥中的应用选取4-5月龄左右，体重接近，生长发育良好，体质健康的湖羊40只。试验组粗料为红芝与绿色木霉zjuv18混菌发酵的稻草秸秆（实施例3），对照组为普通稻草秸秆粉。两组饲喂精料完全相同，精料配方为玉米60%、麦麸20%、菜籽饼10%、小麦7%、石粉1.5%、食盐0.5%、添加剂1%。稻草秸秆采集自江苏省泰州市海陵区农田，收割后无霉变，自然风干。1、试验步骤将所选择的40只羊，采用配对设计，选取条件尽可能一致的湖羊两两配对并编号，同配对两只羊分别将发酵饲料和稻草秸秆粉作为粗饲料进行饲喂。试验预试期为10天，正试期为50天。试验前对所有羊只进行驱虫，每天每只羊饲喂粗料1.7kg，精料每天每只补饲0.3kg。预试期和试验结束时分别空腹称重并记录。试验期内，试验组和对照组羊均自由采食及饮水。圈舍保持干燥、清洁。2、实验结果2.1试验期湖羊的采食情况见表15表15n试验组对照组精料平均日采食量kg80.30.3粗料平均日采食量kg81.39±0.21*1.01±0.17从上表可以看出，在精料限饲的情况下，试验组平均每只羊每日粗料采食量为1.39kg，是对照组的1.38倍，显著高于对照组羊的采食量（p<0.05）。说明羊比较喜食经发酵的秸秆饲料，主要原因是秸秆经微生物发酵处理后，具有良好的适口性，秸秆中纤维等组分被充分降解，营养成分容易被消化吸收，且红芝发酵后的秸秆饲料有一种特殊的香味，羊喜食。2.2增重效果试验期湖羊的增重情况见表16：表16组别n试前平均体重（kg）试后平均体重（kg）平均日增重（g）试验组824.57±1.4530.09±2.21110.40±10.6**对照组824.91±1.2228.55±2.0972.80±9.7从上表可以看出，经过50天的饲养试验，试验组羊平均日增重110.40g，经t检验试验组与对照组差异显著（p<0.01）。可见，混菌稻草秸秆发酵饲料饲喂湖羊的效果明显优于普通的粉碎稻草秸秆，食用发酵饲料的羊平均日增重比对照组提高了51.65%。一方面由于羊的采食量增加，另一方面经发酵后的秸秆中纤维组分被降解成利于消化吸收的物质，而且发酵饲料中的蛋白含量相对较高，使得试验组羊的日增重显著高于对照组。2.3经济效益分析在50d的试验期内，试验组每只育肥羊平均日增重110.4g，消耗精料0.3kg，粗料（稻草秸秆发酵饲料）消耗1.39kg；对照组每只羊平均日增重72.8g，消耗精料0.3kg，粗料（稻草秸秆）消耗1.01kg。精料价格2.5元/kg，试验组秸秆发酵饲料价格0.4元/kg，对照组秸秆粉0.2元/kg，活羊售价40元/kg。照此计算，试验全期试验组比对照组每只羊能多获利57.5元，经济效益可观。当前第1页12