一种酸鲊肉的纯种发酵制备方法与流程

本发明属于食品加工领域，具体涉及一种酸鲊肉的纯种发酵制备方法。

背景技术：

酸鲊肉是指以新鲜的猪肉为原料，加入玉米粉(或糯米粉)、调味料等辅料，在自然条件下利用微生物的厌氧发酵作用而形成的一种乳酸细菌型发酵肉制品。酸鲊肉制品的生产具有相当悠久的历史，2000多年前的史书《齐民要术》中就有了关于“酸肉”的记载，其在我国重庆、贵州、四川、湖南、广西等的土家族、苗族、侗族、傣族、毛南族等少数民族地区被广泛食用。酸鲊肉具有肉质细嫩、风味独特、营养丰富、保存期长等特点，同时具有降血清胆固醇、调节胃肠道等生理保健功能，因而也越来越受到广大消费者的喜爱。

酸鲊肉制品属于我国少数民族地区的传统特色发酵食品，不同地域环境、不同民族在酸鲊肉加工过程中所采用的原辅料以及发酵工艺有所差别，因而形成了不同的地域风味，同时也赋予了酸鲊肉制品浓郁的民族特色。渝东南地区土家特色酸鲊肉的传统加工工艺如下：猪五花肉→切片→加入米粉、食盐、香辛料、腐乳汁、米酒、糟辣椒等混合→揉制装坛→密封发酵→成品；而湘西、贵州地区酸鲊肉制品的传统加工工艺如下：去骨猪肉→切条→食盐腌制→加入糯米粉或米饭、茶叶等混合→装坛→密封发酵→成品。

目前国外文献尚未见酸鲊肉的相关报道。在国内，酸鲊肉制品还没有实现工业化生产，只在旅游区和大型的农贸市场可以买到，可见这种产品具有巨大的市场潜力。酸鲊肉的传统加工方式多是自然发酵即多菌种混合发酵，要实现其工业化生产还存在以下问题：传统发酵产品品质不稳定；传统发酵方式存在安全隐患；发酵周期较长。纯种发酵是19世纪中后期，发酵生物学说建立后产生的。现代发酵工业大多采用纯种发酵，它具有使有益菌快速生长、过程控制简单、目标产物生成速度快等优点，解决了传统发酵产品发酵慢、产品每批的品质有差距以及存在安全隐患的问题，符合发酵食品大批量生产的快速易控的要求，更适合于工业化生产发酵食品。

因此，形成一套产品质量较高的酸鲊肉纯种发酵加工工艺，为实现渝东南地区土家特色酸鲊肉制品的产业化升级提供实验室研究数据，既具有创新性又具有现实意义。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种酸鲊肉的纯种发酵制备方法。

为实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：

1、一种酸鲊肉的纯种发酵制备方法，所述制备方法包括以下步骤：

(1)肉制品原料准备：将猪肉切成片状，按照1:1～3:1的质量比加入米粉，再加入2～6％的糖，混匀后在紫外灯下进行灭菌处理20～40min；

(2)菌种悬液的制备：首先将植物乳杆菌进行菌种活化，再经过冷冻离心后用无菌生理盐水配制得到1×10⁶～1×10⁸cfu/ml的菌种悬浮液；

(3)前期发酵：按照6～10％的质量百分比将步骤(2)中制备得到的菌种悬液均匀喷洒到步骤(1)中的肉制品原料上，在30～40℃条件下经过24～36h的前期发酵，制备得到前期发酵产物；

(4)后期发酵：向步骤(3)中的前期发酵产物中加入质量分数为2～6％的食盐、0.02～0.06％的香辛料以及0～4％的辣椒，混合均匀，在15～25℃下发酵25～30d即可得到酸鲊肉。

优选的，步骤(1)中所述猪肉与米粉的质量比为2:1。

优选的，步骤(1)中所述糖的加入量为猪肉质量的4％。

优选的，步骤(1)中所述灭菌处理的时间为30min。

优选的，步骤(2)中所述菌种活化的方法为：将植物乳杆菌冻干菌解冻后在mrs平板培养基上进行24h的划线培养2次，所述培养的温度为36±1℃。

优选的，步骤(2)中所述冷冻离心在高速冷冻离心机中进行，所述冷冻离心的温度为4℃、转速为8000～10000r/min，所述冷冻离心的时间为5～10min。

优选的，步骤(2)中所述菌种悬浮液的浓度为1×10⁸cfu/ml。

优选的，步骤(3)中所述菌种悬液的喷洒量为猪肉质量的8％，所述发酵的温度为34℃，所述发酵的时间为30h。

优选的，步骤(4)中所述食盐的添加量为猪肉质量的4％，所述香辛料的添加量为猪肉质量的0.04％，所述辣椒的添加量为2.0％，所述发酵的温度为25℃，所述发酵的时间为25d。

本发明的有益效果在于：

1、本发明提供一种酸鲊肉的纯种发酵制备方法的发酵周期短，从传统的35d发酵时间缩短至25d，能够加速酸鲊肉的制备进程；

2、通过本发明的纯种发酵制备方法而制备得到的酸鲊肉具有以下优点：有害物质亚硝酸盐的含量由传统发酵时的80mg/kg降低至30mg/kg；组胺含量由传统发酵时的24.78mg/kg降低至11.45mg/kg；由大肠菌群传统发酵时的3.6mpn/g降低至＜3.0mpn/g，从而达到增强公共卫生的目的。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图：

图1为本发明的一种酸鲊肉的纯种发酵制备方法的制备流程图；

图2为前期发酵过程中米粉添加量对酸鲊肉的综合评价和ph值的影响；

图3为前期发酵过程中糖添加量对酸鲊肉的综合评价和ph值的影响；

图4为前期发酵过程中乳酸菌接种量对酸鲊肉的综合评价和ph值的影响；

图5为前期发酵过程中发酵温度对酸鲊肉的综合评价和ph值的影响；

图6为前期发酵过程中发酵时间对酸鲊肉的综合评价和ph值的影响；

图7后期发酵过程中食盐添加量对酸鲊肉的影响，其中a图为对发酵周期的影响；b图为综合评价的影响；

图8后期发酵过程中香辛料添加量对酸鲊肉的影响，其中a图为对发酵周期的影响；b图为综合评价的影响；

图9后期发酵过程中辣椒添加量对酸鲊肉的影响，其中a图为对发酵周期的影响；b图为综合评价的影响；

图10后期发酵过程中发酵温度对酸鲊肉的影响，其中a图为对发酵周期的影响；b图为综合评价的影响。

具体实施方式

下面将对本发明的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。

本发明一种酸鲊肉的纯种发酵制备方法的流程如图1所示。

实施例1

按照不同的比例加入米粉制备酸鲊肉：

(1)肉制品原料准备：将猪肉切成片状，按照3:1、2:1、1:1、1:2、1:3的质量比加入米粉，再加入4％的糖，混匀后在紫外灯下进行灭菌处理20min；

(2)菌种悬液的制备：首先将植物乳杆菌进行菌种活化即将植物乳杆菌冻干菌解冻后在mrs平板培养基上进行24h的划线培养2次，所述培养的温度为36±1℃，即可得到带培养基的活化菌种，再将活化菌种连同培养基一起放入高速冷冻离心机中，在4℃下以8000r/min的转速冷冻离心10min后得到去除培养基的活化菌种，用无菌生理盐水作溶剂配制得到1×10⁸cfu/ml的菌种悬浮液；

(3)前期发酵：按照8％的质量百分比将步骤(2)中制备得到的菌种悬液均匀喷洒到步骤(1)中的肉制品原料上，在30℃条件下经过30h的前期发酵，制备得到前期发酵产物；

(4)后期发酵：向步骤(3)中的前期发酵产物中加入质量分数为2％的食盐、0.04％的香辛料、2％的辣椒，混合均匀，在15℃下发酵28d即可得到酸鲊肉。

测定按照原料肉与米粉的不同比例制备得到的酸鲊肉的综合评分以及ph值，其结果如图2所示。

实施例2

加入不同的糖制备酸鲊肉：

(1)肉制品原料准备：将猪肉切成片状，按照1:1的质量比加入米粉，分别加入0％、2％、4％、6％、8％的糖，混匀后在紫外灯下进行灭菌处理20min；

(2)菌种悬液的制备：首先将植物乳杆菌进行菌种活化即将植物乳杆菌冻干菌解冻后在mrs平板培养基上进行24h的划线培养2次，所述培养的温度为36±1℃，即可得到带培养基的活化菌种，再将活化菌种连同培养基一起放入高速冷冻离心机中，在4℃下以8000r/min的转速冷冻离心10min后得到去除培养基的活化菌种，用无菌生理盐水作溶剂配制得到1×10⁸cfu/ml的菌种悬浮液；

(3)前期发酵：按照8％的质量百分比将步骤(2)中制备得到的菌种悬液均匀喷洒到步骤(1)中的肉制品原料上，在30℃条件下经过30h的前期发酵，制备得到前期发酵产物；

(4)后期发酵：向步骤(3)中的前期发酵产物中加入质量分数为2％的食盐、0.04％的香辛料、2％的辣椒，混合均匀，在15℃下发酵28d即可得到酸鲊肉。

测定加入不同含量的糖制备得到的酸鲊肉的综合评分以及ph值，其结果如图3所示。

实施例3

接种不同量的菌种悬液的制备酸鲊肉：

(1)肉制品原料准备：将猪肉切成片状，按照1:1的质量比加入米粉，再加入4％的糖，混匀后在紫外灯下进行灭菌处理20min；

(2)菌种悬液的制备：首先将植物乳杆菌进行菌种活化即将植物乳杆菌冻干菌解冻后在mrs平板培养基上进行24h的划线培养2次，所述培养的温度为36±1℃，即可得到带培养基的活化菌种，再将活化菌种连同培养基一起放入高速冷冻离心机中，在4℃下以8000r/min的转速冷冻离心10min后得到去除培养基的活化菌种，用无菌生理盐水作溶剂配制得到1×10⁸cfu/ml的菌种悬浮液；

(3)前期发酵：按照0％、2％、4％、6％、8％、10％的质量百分比将步骤(2)中制备得到的菌种悬液均匀喷洒到步骤(1)中的肉制品原料上，在30℃条件下经过30h的前期发酵，制备得到前期发酵产物；

(4)后期发酵：向步骤(3)中的前期发酵产物中加入质量分数为2％的食盐、0.04％的香辛料、2％的辣椒，混合均匀，在15℃下发酵28d即可得到酸鲊肉。

测定接种不同量的菌种悬液后制备得到的酸鲊肉的综合评分以及ph值，其结果如图4所示。

实施例4

在不同的温度下进行前期发酵制备酸鲊肉：

(1)肉制品原料准备：将猪肉切成片状，按照1:1的质量比加入米粉，再加入4％的糖，混匀后在紫外灯下进行灭菌处理20min；

(2)菌种悬液的制备：首先将植物乳杆菌进行菌种活化即将植物乳杆菌冻干菌解冻后在mrs平板培养基上进行24h的划线培养2次，所述培养的温度为36±1℃，即可得到带培养基的活化菌种，再将活化菌种连同培养基一起放入高速冷冻离心机中，在4℃下以8000r/min的转速冷冻离心10min后得到去除培养基的活化菌种，用无菌生理盐水作溶剂配制得到1×10⁸cfu/ml的菌种悬浮液；

(3)前期发酵：按照8％的质量百分比将步骤(2)中制备得到的菌种悬液均匀喷洒到步骤(1)中的肉制品原料上，分别在20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃条件下经过30h的前期发酵，制备得到前期发酵产物；

(4)后期发酵：向步骤(3)中的前期发酵产物中加入质量分数为2％的食盐、0.04％的香辛料、2％的辣椒，混合均匀，在15℃下发酵28d即可得到酸鲊肉。

测定在不同的温度下进行前期发酵制备得到的酸鲊肉的综合评分以及ph值，其结果如图5所示。

实施例5

制备前期发酵不同的酸鲊肉：

(1)肉制品原料准备：将猪肉切成片状，按照1:1的质量比加入米粉，再加入4％的糖，混匀后在紫外灯下进行灭菌处理20min；

(2)菌种悬液的制备：首先将植物乳杆菌进行菌种活化即将植物乳杆菌冻干菌解冻后在mrs平板培养基上进行24h的划线培养2次，所述培养的温度为36±1℃，即可得到带培养基的活化菌种，再将活化菌种连同培养基一起放入高速冷冻离心机中，在4℃下以8000r/min的转速冷冻离心10min后得到去除培养基的活化菌种，用无菌生理盐水作溶剂配制得到1×10⁸cfu/ml的菌种悬浮液；

(3)前期发酵：按照8％的质量百分比将步骤(2)中制备得到的菌种悬液均匀喷洒到步骤(1)中的肉制品原料上，在30℃条件下经过6h、12h、18h、24h、30h、36h、42h的前期发酵，制备得到前期发酵产物；

(4)后期发酵：向步骤(3)中的前期发酵产物中加入质量分数为2％的食盐、0.04％的香辛料、2％的辣椒，混合均匀，在15℃下发酵28d即可得到酸鲊肉。

测定前期发酵时间不同时制备得到的酸鲊肉的综合评分以及ph值，其结果如图6所示。

实施例6

后期发酵时加入不同含量的食盐制备酸鲊肉：

(1)肉制品原料准备：将猪肉切成片状，按照2:1的质量比加入米粉，再加入4％的糖，混匀后在紫外灯下进行灭菌处理40min；

(2)菌种悬液的制备：首先将植物乳杆菌进行菌种活化即将植物乳杆菌冻干菌解冻后在mrs平板培养基上进行24h的划线培养3次，所述培养的温度为36±1℃，即可得到带培养基的活化菌种，再将活化菌种连同培养基一起放入高速冷冻离心机中，在4℃下以10000r/min的转速冷冻离心5min后得到去除培养基的活化菌种，用无菌生理盐水作溶剂配制得到1×10⁸cfu/ml的菌种悬浮液；

(3)前期发酵：按照8％的质量百分比将步骤(2)中制备得到的菌种悬液均匀喷洒到步骤(1)中的肉制品原料上，在34℃条件下经过30h的前期发酵，制备得到前期发酵产物；

(4)后期发酵：向步骤(3)中的前期发酵产物中分别加入质量分数为0％、2.0％、4.0％、6.0％、8.0％的食盐、0.06％的香辛料、4％的辣椒，混合均匀，在25℃下发酵即可得到酸鲊肉，并记录各个含有不同食盐含量酸鲊肉的发酵时间，如图7中a所示。

测定制备得到的酸鲊肉的综合评分，其结果如图7中b所示。

实施例7

后期发酵时加入不同含量的香辛料制备酸鲊肉：

(1)肉制品原料准备：将猪肉切成片状，按照2:1的质量比加入米粉，再加入4％的糖，混匀后在紫外灯下进行灭菌处理40min；

(2)菌种悬液的制备：首先将植物乳杆菌进行菌种活化即将植物乳杆菌冻干菌解冻后在mrs平板培养基上进行24h的划线培养3次，所述培养的温度为36±1℃，即可得到带培养基的活化菌种，再将活化菌种连同培养基一起放入高速冷冻离心机中，在4℃下以10000r/min的转速冷冻离心5min后得到去除培养基的活化菌种，用无菌生理盐水作溶剂配制得到1×10⁶cfu/ml的菌种悬浮液；

(3)前期发酵：按照8％的质量百分比将步骤(2)中制备得到的菌种悬液均匀喷洒到步骤(1)中的肉制品原料上，在34℃条件下经过30h的前期发酵，制备得到前期发酵产物；

(4)后期发酵：向步骤(3)中的前期发酵产物中加入质量分数为4.0％的食盐、4％的辣椒，在分别加入0.00％、0.02％、0.04％、0.06％、0.08％的香辛料，混合均匀，在25℃下发酵即可得到酸鲊肉，并记录各个含有不同香辛料含量酸鲊肉的发酵时间，如图8中a所示。

测定制备得到的酸鲊肉的综合评分，其结果如图8中b所示。

实施例8

后期发酵时加入不同含量的辣椒制备酸鲊肉：

(1)肉制品原料准备：将猪肉切成片状，按照2:1的质量比加入米粉，再加入4％的糖，混匀后在紫外灯下进行灭菌处理40min；

(2)菌种悬液的制备：首先将植物乳杆菌进行菌种活化即将植物乳杆菌冻干菌解冻后在mrs平板培养基上进行24h的划线培养3次，所述培养的温度为36±1℃，即可得到带培养基的活化菌种，再将活化菌种连同培养基一起放入高速冷冻离心机中，在4℃下以10000r/min的转速冷冻离心5min后得到去除培养基的活化菌种，用无菌生理盐水作溶剂配制得到1×10⁶cfu/ml的菌种悬浮液；

(3)前期发酵：按照8％的质量百分比将步骤(2)中制备得到的菌种悬液均匀喷洒到步骤(1)中的肉制品原料上，在34℃条件下经过30h的前期发酵，制备得到前期发酵产物；

(4)后期发酵：向步骤(3)中的前期发酵产物中加入质量分数为4.0％的食盐、0.06％的香辛料，再分别加入0％、2％、4％、6％、8％的辣椒，混合均匀，在25℃下发酵即可得到酸鲊肉，并记录各个含有不同辣椒含量酸鲊肉的发酵时间，如图9中a所示。

测定制备得到的酸鲊肉的综合评分，其结果如图9中b所示。

实施例9

在不同的温度下进行后期发酵制备酸鲊肉：

(1)肉制品原料准备：将猪肉切成片状，按照2:1的质量比加入米粉，再加入4％的糖，混匀后在紫外灯下进行灭菌处理40min；

(2)菌种悬液的制备：首先将植物乳杆菌进行菌种活化即将植物乳杆菌冻干菌解冻后在mrs平板培养基上进行24h的划线培养4次，所述培养的温度为36±1℃，即可得到带培养基的活化菌种，再将活化菌种连同培养基一起放入高速冷冻离心机中，在4℃下以10000r/min的转速冷冻离心5min后得到去除培养基的活化菌种，用无菌生理盐水作溶剂配制得到1×10⁶cfu/ml的菌种悬浮液；

(3)前期发酵：按照8％的质量百分比将步骤(2)中制备得到的菌种悬液均匀喷洒到步骤(1)中的肉制品原料上，在34℃条件下经过30h的前期发酵，制备得到前期发酵产物；

(4)后期发酵：向步骤(3)中的前期发酵产物中加入质量分数为0％、2.0％、4.0％、6.0％、8.0％的食盐、0.06％的香辛料、4％的辣椒，混合均匀，分别在15℃、20℃、25℃、30℃、35℃条件下进行发酵即可得到酸鲊肉，并记录不同后期发酵的温度制备酸鲊肉的发酵时间，如图10中a所示。

测定制备得到的酸鲊肉的综合评分，其结果如图10中b所示。

实施例10

按照不同的比例加入米粉制备酸鲊肉：

(1)肉制品原料准备：将猪肉切成片状，按照2:1的质量比加入米粉，再加入4％的糖，混匀后在紫外灯下进行灭菌处理30min；

(2)菌种悬液的制备：首先将植物乳杆菌进行菌种活化即将植物乳杆菌冻干菌解冻后在mrs平板培养基上进行24h的划线培养2次，所述培养的温度为36±1℃，即可得到带培养基的活化菌种，再将活化菌种连同培养基一起放入高速冷冻离心机中，在4℃下以8000r/min的转速冷冻离心10min后得到去除培养基的活化菌种，用无菌生理盐水作溶剂配制得到1×10⁸cfu/ml的菌种悬浮液；

(3)前期发酵：按照8％的质量百分比将步骤(2)中制备得到的菌种悬液均匀喷洒到步骤(1)中的肉制品原料上，在34℃条件下经过30h的前期发酵，制备得到前期发酵产物；

(4)后期发酵：向步骤(3)中的前期发酵产物中分别加入质量分数为4.0％的食盐、0.06％的香辛料、4％的辣椒，混合均匀，在25℃下发酵25d即可得到酸鲊肉。

通过实施例1～5的条件参数以及测试的结果采用响应面法优化酸鲊肉前期发酵条件

前期发酵条件的响应面试验设计如表1所示：

表1box-behnken设计试验因素水平及编码

响应面法优化酸鲊肉前期发酵条件

①发酵条件对综合评分的影响

a、回归模型的建立

以发酵时间(x1)、发酵温度(x2)、接种量(x3)、糖添加量(x4)、肉与米粉比例(x5)为自变量，以综合评分(y1)、ph值(y2)为因变量，建立回归模型。回归方程为：

y1＝9.12+0.025x1-0.056x2-0.038x3-0.019x4-0.05x5+0.025x1x3+0.025x1x4+0.025x2x4-0.025x3x4-0.12x1²-0.16x2²-0.13x3²-0.11x4²-0.20x5²(1)

酸鲊肉前期发酵条件的响应面分析试验设计及结果如表2所示。

表2酸鲊肉前期发酵条件的响应面分析试验设计及结果

b、回归模型方差分析：其结果如表3所示。

表3综合评分回归模型方差分析

由表3可知，模型极显著(p＜0.0001)，因变量与所考察自变量之间的线性关系显著(r²＝0.9296)，模型调整复相关系数r²adj＝0.8734，说明该模型能解释92.96％响应值的变化，拟合程度较好，失拟项不显著(p＞0.05)。离散系数(c.v.)表示试验的精确度，其值越小，试验结果的可靠性越高，本试验的c.v.＝0.49％，在可接受范围内，说明试验结果可靠，本试验所得二次回归方程能很好地对响应值进行预测。由回归方程系数显著性检验可知，模型(1)的一次项x2和x5(p＜0.01)影响极显著，x1和x3(p＜0.05)影响显著；二次项均(p＜0.01)影响极显著；交互项(p＞0.05)影响均不显著。

②发酵条件对ph值的影响

a.回归模型的建立

以发酵时间(x1)、发酵温度(x2)、接种量(x3)、糖添加量(x4)、肉与米粉比例(x5)为自变量，以ph值(y2)为因变量，建立回归模型。回归方程为：

y2＝4.19-0.059x1-(9.375e-003)x2-(5.625e-003)x3-0.021x4+0.052x5-(5.000e-003)x1x4-(2.5000e-003)x2x4+(2.500e-003)x3x5+0.010x4x5-(2.917e-003)x1²+0.021x2²+0.025x3²+0.016x4²+0.076x5²(2)，

b、回归模型方差分析，其结果如表4所示。

表4ph值回归模型方差分析

注：**表示差异极显著，p<0.01；*表示差异显著，p<0.05。

由表4可知，模型极显著(p＜0.0001)，因变量与所考察自变量之间的线性关系显著(r²＝0.9834)，模型调整复相关系数r²adj＝0.9701，说明该模型能解释98.34％响应值的变化，拟合程度极好，失拟项不显著(p＞0.05)。离散系数(c.v.)表示试验的精确度，其值越小，试验结果的可靠性越高，本试验的c.v.＝0.25％，在可接受范围内，说明试验结果可靠，本试验所得二次回归方程能很好地对响应值进行预测。由回归方程系数显著性检验可知，模型(2)的一次项x1、x2、x4和x5(p＜0.01)影响极显著，x3(p＜0.05)影响显著；二次项x2²、x3²、x4²和x5²均(p＜0.01)影响极显著，x1²(p＞0.05)；交互项(p＞0.05)影响均不显著。

综合上述不同发酵条件对腐乳品质综合评分以及发酵周期的影响，经软件优化得出酸鲊肉前期发酵的最佳工艺条件为：发酵时间30.51h、发酵温度34.08℃、菌种接种量7.75％、糖添加量3.83％、肉与米粉的比例为1.88:1，此时感官品质的综合评分为9.129，ph值为4.183。

③验证试验

为检验试验结果与真实情况的一致性，对上述优化条件进行验证试验。同时考虑到实际操作的便利，将最佳工艺条件修正为：发酵时间30h、发酵温度34℃、菌种接种量8％、糖添加量4％、肉与米粉的比例为2:1，在此条件下进行3次平行试验，得到综合品质评分为9.1，ph值为4.17，与模型预测值相比较，其相对误差小于1％。因此，经响应面法优化所得的发酵最佳工艺参数准确可靠，具有实际应用价值。

通过实施例6～9的条件参数以及测试的结果采用响应面法优化酸鲊肉后发酵条件

后期发酵条件的响应面试验设计如表5所示：

表5后期发酵条件的boxbehnken设计试验因素水平及编码

①发酵条件对综合评分的影响

a、回归模型的建立：以发酵温度(x1)、食盐添加量(x2)、香辛料添加量(x3)、辣椒添加量(x4)为自变量，以综合评分(y1)为因变量，建立回归模型。回归方程为：

y1＝9.18+0.017x1+0.017x2+0.033x3+0.033x4+0.025x1x3+0.025x1x4+0.025x2x3-0.025x2x4-0.057x1²-0.13x2²-0.11x3²-0.082x4²(3)，

得到酸鲊肉后期发酵条件的响应面分析试验设计及结果如表6所示。

表6酸鲊肉后期发酵条件的响应面分析试验设计及结果

b、回归模型方差分析，其结果如表7所示。

表7综合评分回归模型方差分析

注：**表示差异极显著，p<0.01；*表示差异显著，p<0.05。

由表7可知，模型极显著(p＜0.0001)，因变量与所考察自变量之间的线性关系显著(r²＝0.9228)，模型调整复相关系数r²adj＝0.8456，说明该模型能解释92.28％响应值的变化，拟合程度较好，失拟项不显著(p＞0.05)。离散系数(c.v.)表示试验的精确度，其值越小，试验结果的可靠性越高，本试验的c.v.＝0.40％，在可接受范围内，说明试验结果可靠，本试验所得二次回归方程能很好地对响应值进行预测。由回归方程系数显著性检验可知，模型(3)的一次项x1、x2(p＞0.05)影响均不显著，x3和x4(p＜0.01)影响极显著；二次项x1²、x2²、x3²、x4²均(p＜0.01)影响极显著；交互项(p＞0.05)影响均不显著。

②发酵条件对发酵周期的影响

a.、回归模型的建立：以发酵温度(x1)、食盐添加量(x2)、香辛料添加量(x3)、辣椒添加量(x4)为自变量，以发酵周期(y2)为因变量，建立回归模型。回归方程为：

y2＝27.21-1.50x1+1.08x2+1.00x3+0.75x4(4)。

b、回归模型方差分析，其结果如表8所示。

表8发酵周期回归模型方差分析

注：**表示差异极显著，p<0.01；*表示差异显著，p<0.05。

由表8可知，模型极显著(p＜0.0001)，因变量与所考察自变量之间的线性关系显著(r²＝0.9534)，模型调整复相关系数r²adj＝0.9456，说明该模型能解释95.34％响应值的变化，拟合程度极好，失拟项不显著(p＞0.05)。离散系数(c.v.)表示试验的精确度，其值越小，试验结果的可靠性越高，本试验的c.v.＝1.28％，在可接受范围内，说明试验结果可靠，本试验所得二次回归方程能很好地对响应值进行预测。由回归方程系数显著性检验可知，模型(4)的一次项x1、x2、x3、x4(p＜0.01)影响极显著。

综合上述不同发酵条件对腐乳品质综合评分以及发酵周期的影响，经软件优化得出酸鲊肉前期发酵的最佳工艺条件为：发酵温度24.59℃、食盐添加量3.63％、香辛料添加量0.04％、辣椒添加量2.22％，此时感官品质的综合评分为9.14，发酵周期为25.69d。

③验证试验：

为检验试验结果与真实情况的一致性，对上述优化条件进行验证试验。同时考虑到实际操作的便利，将最佳工艺条件修正为：发酵温度25℃、食盐添加量4％、香辛料添加量0.04％、辣椒添加量2.0％，在此条件下进行3次平行试验，得到综合品质评分为9.2，发酵周期为25d，与模型预测值相比较，其相对误差小于1％。因此，经响应面法优化所得的发酵最佳工艺参数准确可靠，具有实际应用价值。

结合以上分析，可以得出最佳的纯种发酵方法制备酸鲊肉的条件，如实施例10中所示，将实施例10中制备得到的酸鲊肉与经过传统发酵得到的酸鲊肉在水分、食盐、蛋白质、总酸、氨基酸态氮、脂肪、亚硝酸盐、组胺、ph值等理化指标，大肠菌群、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、单增李斯特菌等微生物指标、感官指标以及发酵时间方面进行比较，其结果如9所示，

表9纯种发酵酸鲊肉和传统发酵酸鲊肉的感官、理化指标和发酵周期对比分析结果

而纯种发酵酸鲊肉和传统发酵酸鲊肉的微生物指标对比分析结果如图10所示，

表10纯种发酵酸鲊肉和传统发酵酸鲊肉的微生物指标对比分析结果

可以看出，经过本发明的纯种发酵box-behnken设计试验优化方法制备得到的酸鲊肉在其它方面无明显差异的情况下能够将发酵周期缩短至25d，同时能够将有害物质亚硝酸盐的含量由传统发酵时的80mg/kg降低至30mg/kg；组胺含量由传统发酵时的24.78mg/kg降低至11.45mg/kg；由大肠菌群传统发酵时的3.6mpn/g降低至＜3.0mpn/g，从而真正达到增强公共卫生的目的。

最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。