一种结合DHPM及酶解技术制备大青叶香精的方法与流程

本发明涉及一种结合dhpm及酶解技术制备大青叶香精的方法，属于大青叶深加工技术领域。

背景技术：

高压微射流技术（dynamichigh-pressuremicrofluidization，dhpm）是一种集输送、混合、超微粉碎、加压、膨化等多种单元操作于一体的新兴物理处理手段。目前，高压微射流技术主要应用在大分子改性、营养物纳米粒和脂质体制备等方面（《用微射流瞬时高压技术制备高性能百合全粉的方法》，专利号：200710051574.1；《一种高压微射流制备红豆杉叶提取物及其在织物上施加方法》，专利号：201110421443.4；《介观尺度片状蛭石和耐高温聚合物隔热复合膜的制备方法》，专利号：200810039655.4），将其应用于天然香精香料的制备的应用较少。

大青叶(foliumisatidis)是十字花科(cruciferae)菘蓝属(isatis)植物菘蓝(isatisindigoticafort.)的叶，本品性苦味寒，清热解毒、凉血化斑，用于温邪入营，高热神昏，发斑发疹，黄疸，热痢，痄腮，喉痹，丹毒，痈肿，其根在药典中称为板蓝根。大青叶作为一味常用的清热解毒药，具有抗病原微生物、抗内毒素、抗炎、增强免疫功能、解热等药理作用；现代药理研究表明还具有抗菌、抗病毒、增强免疫调节的作用（《大青叶保健酒》，专利号：201210196128.0；《复方大青叶提取物的制备方法》，专利号：201610768019.x；《大青叶/丁香叶非烟草香烟及其制备方法》，专利号：201710061735.9；《一种大青叶提取物的制备方法》，专利号：201010606341.5）。大青叶香料是一类大青叶中重要的天然活性成分的混合物，除本身具有的天然活性香料的一般性能外，还同时具有多种药理活性及在医学方面的应用性。目前国内大青叶香精的提取方法主要有传统的水蒸汽蒸馏法、有机溶剂萃取法等。传统方法普遍存在着各自的缺点，如回收率低、杂质多、溶剂残留及高温引起热敏性成分的破坏等等。

采用dhpm技术处理物料，是近十几年国内外迅速发展起来的萃取技术，是一种较新的不使用或少使用有机溶剂的绿色萃取前处理技术，应用于大青叶香精的制备，对大青叶香精生产现代化具有重要意义。以提高大青叶香精茶香为目的高压微射流技术萃取前处理制备法，并结合超声萃取技术，能够克服常规水蒸汽蒸馏法、有机溶剂萃取对活性物质带来的不利影响，具有显著的无环境污染，工艺简单，且具有高效、省时和成本低等优点。本发明的目的是克服现有技术的不足之处，提供一种结合dhpm及酶解技术制备大青叶香精的方法；得到大青叶香精具有提高大青叶香气感官品质及增加香气成分浓度的优势。该提取方法对目标成分的得率有较大程度高；原料dhpm技术处理简单，高效、省时和成本低，从而为大青叶中制备香精提供了一种绿色环保、前景广阔的技术。

技术实现要素：

要解决的技术问题

本发明的目的是克服现有技术的不足之处，提供一种结合dhpm及酶解技术制备大青叶香精的方法。

技术方案

本发明是通过下述技术方案实现的。

本发明涉及一种结合dhpm及酶解技术制备大青叶香精的方法，所述方法包括以下步骤：

（1）初步粉碎：称取一定量清洗后晾干的大青叶，以超微粉碎机进行初步粉碎到一定粒度后，过筛并备用，得到产物1。

（2）dhpm技术粉碎：取一定步骤（1）所得的产物1样品，按照一定的固液比加入一定浓度的乙醇浸泡，搅拌均匀后使用高压高剪切dhpm技术粉碎机处理，选择一定的微射流均质压力和微射流循环次数，得到产物2。

在该原料处理步骤中，大青叶初步粒度选择在100~300目是适宜的，过细会导致副产物溶出，2粗导致后期的酶解不完全。

固液质量比选择在1:20~1:60，当粉末质量一定而溶剂量过少时，萃取体系的渗透压过高，会阻碍大青叶香精成分的溶出。当料液比在1:20~1:60这一范围内时，随着溶剂量增加，提取率提高，当料液比超过1:60时，提取率下降。

加入浸泡的乙醇浓度选择在60%~90％（v/v），是因为此乙醇浓度可改善原料和提取溶剂分子间的作用力，从而改善原料与提取溶剂的溶解度和选择性。

微射流均质压力选择在100~150mpa，这是由于过高的压力对植物细胞破坏的程度会影响提取率，当微射流均质压力小于100mpa时，会造成破壁作用不明显提取效率无明显变化。

微射流循环次数选择在20~60次，可有效提高大青叶香精成分与提取溶剂的选择性。

（3）大青叶提取液的获取：将步骤（2）所得的产物2在一定的超声功率下提取一定时间后，10000rpm下离心10min，得到产物3。

在该原料处理步骤中，大青叶超声萃取功率选择在300~600w是合适的，理由是该功率条件下原料组织内活性物质的溶出速率最为合适。

大青叶超声萃取处理时间选择在0.5~2h，能提高萃取效率，降低活性成分的破坏率。

（4）大青叶的香料获取：将步骤（3）得到的产物3中添加入一定量的纤维素酶和β-n-乙酰葡萄糖苷酶（质量比为1:1），调节ph为6.0，并在45℃温度条件下酶解4h后，0.01mpa下减压水蒸气蒸馏2h提取大青叶中的香气成分，并通过液氮冷阱吸附回收香气成分，得到产物4。

在该原料处理步骤中，用β-n-乙酰葡萄糖苷酶用量选择在大青叶原料重量的0.2%~1.0%（w/w），可提高酶解的效率，从而避免酶用量浪费。

（5）大青叶香精的获取：将（4）得到的产物4冷却后，以nacl进行破乳，然后以100ml乙醚萃取3次，收集上层精油部分，然后真空浓缩，回收乙醚到近干（乙醚含量低于0.2mg/g），再置于40℃烘箱中恒重后就可得到最终产物大青叶香精。

有益效果

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明得到大青叶香精具有提高大青叶香气感官品质及增加香气成分浓度的优点。该法目标成分的得率高，提取效率高；原料经过dhpm超微粉碎过程处理简单，无环境污染，工艺简单，且具有高效、省时和成本低等优点，从而提供了一种绿色环保、前景广阔的大青叶中制备香精的技术。

本发明制备得到的大青叶香精具有提高大青叶香气感官品质及增加香气成分浓度的作用，通过本方法制备大青叶香精适宜于工业化生产。利用无毒的乙醇水溶液进行提取，并用低沸点的乙醚进行萃取，可以有效地减少溶剂残留，同时，本发明所提供的提取方法，加热的最高温度为45^oc，减少了高温过高造成的热敏性成分的丧失，从而可以起到增加产品香气感官品质和香气成分浓度的效果（如图1所示）

附图说明

图1是与大青叶香精z比较的香气感官评价、香气成分总浓度以及特征成分的相对值的对比图。

具体实施方式

以下给出实施例，对本发明作进一步说明。

实施例1

一种结合dhpm及酶解技术制备大青叶香精的方法，其实施例步骤如下：

（1）初步粉碎：称取一定量清洗后晾干的大青叶，以超微粉碎机进行初步粉碎后过筛，得到200目粒度的产物a1。

（2）dhpm技术粉碎：取步骤（1）所得的大青叶200目粒度的产物a1样品200.0g，加入70%（v/v）浓度的乙醇水溶液8000.0g，搅拌均匀后使用dhpm处理，选择dhpm处理压力为130mpa和微射流循环40次，得到产物a2。

（3）大青叶提取液的获取：将步骤（2）所得的产物a2在400w的超声功率下提取1h后，10000rpm下离心10min，得到产物a3。

（4）大青叶香精粗产物：将步骤（3）得到的产物a3中添加入1.0g纤维素酶和β-n-乙酰葡萄糖苷酶（质量比为1:1），调节ph为6.0，并在45℃温度条件下酶解4h后，0.01mpa下减压水蒸气蒸馏2h提取大青叶中的香气成分，并通过液氮冷阱吸附回收香气成分，得到产物a4。

（5）大青叶香精的获取：将（4）得到的产物a4冷却后，加入10.0gnacl进行破乳，然后加入100ml乙醚萃取3次，收集上层精油部分，然后在0.01mpa真空条件下浓缩1h，得到大青叶香精浓缩产物；蒸干大青叶香精浓缩产物的乙醚到近干（乙醚含量低于0.2mg/g），再置于40℃烘箱中恒重后即得到最终产物大青叶香精a。

本实施例制备得到大青叶香精a的质量为3.01g，大青叶香精a的产率为1.51%。均高于以传统乙醚索氏提取法得到的大青叶香精y的产率0.65%以及传统水蒸气蒸馏提取法得到的大青叶香精z的产率0.42%。

实施例2

一种结合dhpm及酶解技术制备大青叶香精的方法，其实施例步骤如下：

（1）初步粉碎：称取一定量清洗后晾干的大青叶，以超微粉碎机进行初步粉碎后过筛，得到300目粒度的产物b1。

（2）dhpm技术粉碎：取步骤（1）所得的大青叶300目粒度的产物b1样品200.0g，加入60%（v/v）浓度的乙醇水溶液12000.0g，搅拌均匀后使用dhpm处理，选择dhpm处理压力为100mpa和微射流循环30次，得到产物b2。

（3）大青叶提取液的获取：将步骤（2）所得的产物b2在300w的超声功率下提取2h后，10000rpm下离心10min，得到产物b3。

（4）大青叶香精粗产物：将步骤（3）得到的产物b3中添加入2.0g纤维素酶和β-n-乙酰葡萄糖苷酶（质量比为1:1），调节ph为6.0，并在45℃温度条件下酶解4h后，0.01mpa下减压水蒸气蒸馏2h提取大青叶中的香气成分，并通过液氮冷阱吸附回收香气成分，得到产物b4。

（5）大青叶香精的获取：将（4）得到的产物b4冷却后，加入10.0gnacl进行破乳，然后加入100ml乙醚萃取3次，收集上层精油部分，然后在0.01mpa真空条件下浓缩1h，得到大青叶香精浓缩产物；蒸干大青叶香精浓缩产物的乙醚到近干（乙醚含量低于0.2mg/g），再置于40℃烘箱中恒重后即得到最终产物大青叶香精b。

本实施例制备得到大青叶香精b的质量为2.87g，大青叶香精b的产率为1.44%。均高于以传统乙醚索氏提取法得到的大青叶香精y的产率0.65%以及传统水蒸气蒸馏提取法得到的大青叶香精z的产率0.42%。

实施例3

一种结合dhpm及酶解技术制备大青叶香精的方法，其实施例步骤如下：

（1）初步粉碎：称取一定量清洗后晾干的大青叶，以超微粉碎机进行初步粉碎后过筛，得到100目粒度的产物c1。

（2）dhpm技术粉碎：取步骤（1）所得的大青叶100目粒度的产物c1样品200.0g，加入80%（v/v）浓度的乙醇水溶液4000.0g，搅拌均匀后使用dhpm处理，选择dhpm处理压力为150mpa和微射流循环20次，得到产物c2。

（3）大青叶提取液的获取：将步骤（2）所得的产物c2在500w的超声功率下提取0.5h后，10000rpm下离心10min，得到产物c3。

（4）大青叶香精粗产物：将步骤（3）得到的产物c3中添加入1.5g纤维素酶和β-n-乙酰葡萄糖苷酶（质量比为1:1），调节ph为6.0，并在45℃温度条件下酶解4h后，0.01mpa下减压水蒸气蒸馏2h提取大青叶中的香气成分，并通过液氮冷阱吸附回收香气成分，得到产物c4。

（5）大青叶香精的获取：将（4）得到的产物c4冷却后，加入10.0gnacl进行破乳，然后加入100ml乙醚萃取3次，收集上层精油部分，然后在0.01mpa真空条件下浓缩1h，得到大青叶香精浓缩产物；蒸干大青叶香精浓缩产物的乙醚到近干（乙醚含量低于0.2mg/g），再置于40℃烘箱中恒重后即得到最终产物大青叶香精c。

本实施例制备得到大青叶香精c的质量为2.72g，大青叶香精c的产率为1.36%。均高于以传统乙醚索氏提取法得到的大青叶香精y的产率0.65%以及传统水蒸气蒸馏提取法得到的大青叶香精z的产率0.42%。

实施例4

一种结合dhpm及酶解技术制备大青叶香精的方法，其实施例步骤如下：

（1）初步粉碎：称取一定量清洗后晾干的大青叶，以超微粉碎机进行初步粉碎后过筛，得到300目粒度的产物d1。

（2）dhpm技术粉碎：取步骤（1）所得的大青叶300目粒度的产物d1样品200.0g，加入90%（v/v）浓度的乙醇水溶液6000.0g，搅拌均匀后使用dhpm处理，选择dhpm处理压力为110mpa和微射流循环60次，得到产物d2。

（3）大青叶提取液的获取：将步骤（2）所得的产物d2在600w的超声功率下提取1.5h后，10000rpm下离心10min，得到产物d3。

（4）大青叶香精粗产物：将步骤（3）得到的产物d3中添加入0.4g纤维素酶和β-n-乙酰葡萄糖苷酶（质量比为1:1），调节ph为6.0，并在45℃温度条件下酶解4h后，0.01mpa下减压水蒸气蒸馏2h提取大青叶中的香气成分，并通过液氮冷阱吸附回收香气成分，得到产物d4。

（5）大青叶香精的获取：将（4）得到的产物d4冷却后，加入10.0gnacl进行破乳，然后加入100ml乙醚萃取3次，收集上层精油部分，然后在0.01mpa真空条件下浓缩1h，得到大青叶香精浓缩产物；蒸干大青叶香精浓缩产物的乙醚到近干（乙醚含量低于0.2mg/g），再置于40℃烘箱中恒重后即得到最终产物大青叶香精d。

本实施例制备得到大青叶香精d的质量为2.63g，大青叶香精d的产率为1.32%。均高于以传统乙醚索氏提取法得到的大青叶香精y的产率0.65%以及传统水蒸气蒸馏提取法得到的大青叶香精z的产率0.42%。

实施例5

大青叶香精的香气感官评价及香气成分总浓度测定方法

采用《yc/t145.9-2012烟用香精挥发性成分总量》方法测定大青叶香精的香气感官评价及香气成分总浓度，大青叶香精中丁香酸、烟酸、5-羟基-2-吲哚酮、异牡荆素、琥珀酸和水杨酸浓度采用gc/ms方法进行测定，色谱毛细管柱为peg-20m柱（柱长30m，内径0.25mm；液膜厚度0.25μm）；载气为he，流速1.0ml/min；不分流；程序升温，起始温度30℃，保持3min，以10℃/min的速率升温到45℃，然后以4℃/min的速率升温到120℃，最后以12℃/min的速率升温到240℃，保持5min；汽化室温度245℃。质谱条件：ei电离源，电子能量70ev，灯丝发射电流为200μa，离子源温度为200℃，接口温度245℃，检测器电压350v，扫描质量范围为33-450amu。现将实验结果列于图1中。其中：

香气感官评分相对值=大青叶香精感官评分值/大青叶香精z感官评分值×100%；

丁香酸浓度相对值=大青叶香精丁香酸浓度/大青叶香精z丁香酸浓度×100%；

烟酸浓度相对值相对值=大青叶香精烟酸浓度/大青叶香精z烟酸浓度×100%；

5-羟基-2-吲哚酮浓度相对值=大青叶香精5-羟基-2-吲哚酮浓度/大青叶香精z5-羟基-2-吲哚酮浓度×100%；

异牡荆素浓度相对值=大青叶香精异牡荆素浓度/大青叶香精z异牡荆素浓度×100%；

琥珀酸浓度相对值=大青叶香精琥珀酸浓度/大青叶香精z琥珀酸浓度×100%；

水杨酸浓度相对值=大青叶香精水杨酸浓度/大青叶香精z水杨酸浓度×100%；

香气成分总浓度相对值=大青叶香精香气成分总浓度/大青叶香精z香气成分总浓度×100%。