一种米糠益生菌酵素的制备方法与流程

本发明涉及一种米糠益生菌酵素的制备方法，属于食品加工
技术领域：
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背景技术：
：酵素是一类具有保健功效的天然酶类，多数是利用乳酸菌、酵母菌、醋酸菌等多种有益微生物对水果、蔬菜等原料进行发酵，而得到具有较高的蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶及超氧化物歧化酶活性的一类生物发酵制品，因此酵素也称为酶。酵素在多种益生菌的作用下，不仅可以保留水果、蔬菜中原有的营养物质，还能产生一些新的生物活性物质，具有消炎抑菌、抗氧化、抗衰老、提高免疫力、保护肝脏等功效，兼备良好的营养价值和保健作用。米糠是在把稻谷加工成稻米的过程中留下谷皮和胚芽的混合型物质，是处理稻谷之后剩余下来的首要副产品，富含米糠蛋白、米糠肽、米糠多糖、米糠油、膳食纤维、维生素、矿物质等多重营养成分和多种天然生物活性物质，具有通便、降低胆固醇等药用价值。但是，米糠比较粗糙，难以咀嚼消化，食用起来不合人们口味，难以吞咽，不容易被接受，一般不能作为食物。中国专利文献cn106360317a公开了一种高可溶蛋白的米糠膳食纤维的制备方法，该方法为：以低温脱脂米糠粕为原料，清洗除杂后，采用静水压技术处理，灵芝酵素酶解、真空低温微波干燥、低温振动床超微粉碎，获得目标产物高可溶蛋白的米糠膳食纤维；中国专利文献cn103361171a公开了用米糠制备米糠油和米糠蛋白以及菲汀的方法，该方法是以米糠为起始原料，以溶剂浸提法提取得到米糠油，提取米糠油之后的脱脂米糠再以水提取得到米糠蛋白质，剩余的糠渣经酸水浸提，浸提液经加碱沉淀得到高纯度菲汀。现有技术仅仅是将米糠中某种或某几种营养成分提取出来，米糠的利用率较低。技术实现要素：针对现有技术的不足，本发明提供了一种米糠益生菌酵素的制备方法。本发明不提取某些成分而是将米糠全面利用，以米糠为原料采用特定组合菌进行发酵，该米糠益生菌酵素营养成分丰富，制备方法简单。本发明技术方案如下：一种米糠益生菌酵素的制备方法，步骤如下：(1)将米糠膨化粉、赤砂糖、蜂蜜、菊粉、水混匀后，超声处理30-50min，得米糠发酵液；所述米糠膨化粉是将米糠粉495-650重量份和雪莲果粉5-50重量份混匀膨化制得；(2)将嗜热链球菌、保加利亚乳杆菌、嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌和酿酒酵母菌混匀得混合菌，将混合菌加入30-37℃水中，保持水温为30-37℃振荡培养1-1.5h，使菌种恢复活性，得益生菌活化液；(3)将步骤(2)得到的益生菌活化液按照体积百分比1-5％的接种量接种到步骤(1)得到的米糠发酵液中，30-37℃厌氧发酵23-28天，过滤后即得米糠益生菌酵素。根据本发明优选的，步骤(1)中所述米糠发酵液由以下重量份原料组成：米糠膨化粉500-700份、赤砂糖200-250份、蜂蜜100-150份、菊粉80-100份、水15000-20000份。根据本发明优选的，步骤(1)中所述米糠发酵液由以下重量份原料组成：米糠膨化粉500-615份、赤砂糖210-240份、蜂蜜120-140份、菊粉85-95份、水16000-19000份。进一步优选的，所述米糠膨化粉是将米糠粉495-595重量份和雪莲果粉5-20重量份混匀膨化制得；然后磨粉过100-200目筛。进一步优选的，所述菊粉原料中菊粉含量占干基的质量百分比大于等于90％。根据本发明优选的，步骤(2)中所述混合菌由以下重量份的菌株组成：嗜热链球菌5-10份、保加利亚乳杆菌1-5份、嗜酸乳杆菌1-5份、植物乳杆菌5-10份和酿酒酵母菌1-5份。根据本发明优选的，步骤(2)中所述混合菌由以下重量份的菌株组成：嗜热链球菌6-8份、保加利亚乳杆菌2-3份、嗜酸乳杆菌2-3份、植物乳杆菌6-8份和酿酒酵母菌2-3份。根据本发明优选的，步骤(2)中所述振荡培养的转速为100-200rpm。根据本发明优选的，步骤(2)中所述益生菌活化液中的活菌数大于等于1.0×1010cfu/ml。根据本发明优选的，步骤(3)中所述厌氧发酵的温度为30-35℃，时间为24-26天。根据本发明优选的，步骤(3)中所述米糠益生菌酵素的酒精度小于0.5％，益生菌活菌数大于等于1.0×106cfu/ml。本发明所涉及的原料均为普通市售产品；本发明所涉及的菌株均为普通市售菌粉。本发明的有益效果：本发明以米糠粉为主要原料，配以雪莲果粉、赤砂糖、蜂蜜、菊粉，与水混匀后得到米糠发酵液，其中，雪莲果粉含有多种氨基酸、维生素和矿物质，尤其是含有的寡糖益生元，可以选择性的促进益生菌的生长，菊粉是一种天然的水溶性膳食纤维，也具有促进益生菌生长的作用；赤砂糖和蜂蜜作为基础碳源，为复合益生菌的发酵提供能量，另外蜂蜜中还含有多种生物活性物质。米糠发酵液经由超声处理，可使细胞短时局部破裂，改变细胞膜的通透性，使营养物质或代谢产物快速通过细胞膜，以此达到缩短发酵时间和提高代谢产物产量的目的；此外，添加的复合益生菌由嗜热链球菌、保加利亚乳杆菌、嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌和酿酒酵母菌组成，且菌种比例有利于多菌种共同发酵，接种前于30-37℃水中振荡培养，可使菌株恢复活性，获得活力旺盛的、接种数量足够的益生菌活化液，使得原料发酵更加彻底，进而保证米糠益生菌酵素中最大限度的保留原料中原有的营养物质，同时，提供更多的生物活性物质。本发明制得的米糠益生菌酵素不含任何防腐剂，健康安全，无毒副作用；富含多种营养物质、益生菌、生物活性物质，兼备营养价值和保健作用，适用于各类人群。本发明提供的一种米糠益生菌酵素的制备方法，改善了现有米糠利用率低、发酵效率低、生物活性物质含量低、保健效果差等技术问题，做到了对米糠进行深度发酵，最大限度的利用米糠中的多种营养成分。附图说明图1为灌胃不同米糠益生菌酵素的溃疡性结肠炎小鼠结肠组织染色图；其中，a为灌胃生理盐水的空白对照组小鼠，b为灌胃生理盐水的肠炎空白组小鼠，c、d、e、f为分别灌胃实施例1-4米糠益生菌酵素的肠炎小鼠，g、h、i为分别灌胃对比例1-3米糠益生菌酵素的肠炎小鼠。具体实施方式下面结合实施例来说明本发明的具体实施方式，但以下实施例只是用来详细说明本发明，并不以任何方式限制本发明的范围。以下实施例中原料进行加工之前经过紫外消毒、粉碎。米糠粉购自英德市南英精米厂；雪莲果粉购自昆明者露经贸有限公司；赤砂糖购自东莞市宝象食品有限公司；蜂蜜购自保定聚蜂园蜂业有限公司；菊粉购自丰苣(上海)贸易有限公司，菊粉原料中菊粉含量占干基的质量百分比大于等于90％。嗜热链球菌、保加利亚乳杆菌、嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌和酿酒酵母菌均为普通市售菌粉，均不涉及微生物保藏。以下实施例中涉及小鼠髓过氧化物酶(mpo)elisa试剂盒、小鼠tnf-aelisa试剂盒和小鼠白细胞介素17(il-17)elisa试剂盒购自南京森贝伽生物科技有限公司。实施例中涉及的份数均为重量份。实施例1：一种米糠益生菌酵素的制备方法，步骤如下：(1)将米糠粉495份和雪莲果粉5份混匀经膨化机膨化后磨粉至150目得米糠膨化粉，取上述米糠膨化粉500份、赤砂糖200份、蜂蜜100份、菊粉80份、水15000份混匀得混悬液，超声处理30min，得到米糠发酵液；(2)将嗜热链球菌5份、保加利亚乳杆菌1份、嗜酸乳杆菌1份、植物乳杆菌5份和酿酒酵母菌1份混匀得混合菌，将混合菌加入35℃水中，保持水温为35℃，120rpm振荡培养1h，使菌种恢复活性，得到益生菌活化液，益生菌活化液中的活菌数为8.1×1010cfu/ml；(3)将步骤(2)得到的益生菌活化液按照体积百分比2％的接种量接种到步骤(1)得到的米糠发酵液中，30℃厌氧发酵25天，过滤后得米糠益生菌酵素，所述米糠益生菌酵素的酒精度小于0.5％，益生菌活菌数大于等于1.0×106cfu/ml。实施例2：一种米糠益生菌酵素的制备方法，步骤如下：(1)将米糠粉590份和雪莲果粉10份混匀经膨化机膨化后磨粉至170目得米糠膨化粉，取上述米糠膨化粉600份、赤砂糖220份、蜂蜜120份、菊粉85份、水16000份混匀得混悬液，超声处理40min，得到米糠发酵液；(2)将嗜热链球菌5份、保加利亚乳杆菌1份、嗜酸乳杆菌1份、植物乳杆菌10份和酿酒酵母菌2份混匀得混合菌，将混合菌加入32℃水中，保持水温为32℃，160rpm振荡培养1.5h，使菌种恢复活性，得到益生菌活化液，益生菌活化液中的活菌数为9.3×1010cfu/ml；(3)将步骤(2)得到的益生菌活化液按照体积百分比3％的接种量接种到步骤(1)得到的米糠发酵液中，30℃厌氧发酵26天，过滤后得米糠益生菌酵素，所述米糠益生菌酵素的酒精度小于0.5％，益生菌活菌数大于等于1.0×106cfu/ml。实施例3：一种米糠益生菌酵素的制备方法，步骤如下：(1)将米糠粉592份和雪莲果粉8份混匀经膨化机膨化后磨粉至130目得米糠膨化粉，取上述米糠膨化粉600份、赤砂糖225份、蜂蜜130份、菊粉85份、水16000份混匀得混悬液，超声处理50min，得到米糠发酵液；(2)将嗜热链球菌10份、保加利亚乳杆菌1份、嗜酸乳杆菌1份、植物乳杆菌10份和酿酒酵母菌2份混匀得混合菌，将混合菌加入35℃水中，保持水温为35℃，180rpm振荡培养1h，使菌种恢复活性，得到益生菌活化液，益生菌活化液中的活菌数为1.3×1011cfu/ml；(3)将步骤(2)得到的益生菌活化液按照体积百分比4％的接种量接种到步骤(1)得到的米糠发酵液中，35℃厌氧发酵24天，过滤后得米糠益生菌酵素，所述米糠益生菌酵素的酒精度小于0.5％，益生菌活菌数大于等于1.0×106cfu/ml。实施例4：一种米糠益生菌酵素的制备方法，步骤如下：(1)将米糠粉580份和雪莲果粉20份混匀经膨化机膨化后磨粉至180目得米糠膨化粉，取上述米糠膨化粉600份、赤砂糖250份、蜂蜜150份、菊粉100份、水20000份混匀得混悬液，超声处理30min，得到米糠发酵液；(2)将嗜热链球菌10份、保加利亚乳杆菌5份、嗜酸乳杆菌5份、植物乳杆菌10份和酿酒酵母菌5份混匀得混合菌，将混合菌加入35℃水中，保持水温为35℃，150rpm振荡培养1h，使菌种恢复活性，得到益生菌活化液，益生菌活化液中的活菌数为2.2×1011cfu/ml；(3)将步骤(2)得到的益生菌活化液按照体积百分比2％的接种量接种到步骤(1)得到的米糠发酵液中，32℃厌氧发酵25天，过滤后得米糠益生菌酵素，所述米糠益生菌酵素的酒精度小于0.5％，益生菌活菌数大于等于1.0×106cfu/ml。对比例1：一种米糠益生菌酵素的制备方法，步骤如下：(1)将米糠粉495份和雪莲果粉5份混匀经膨化机膨化后磨粉至150目得米糠膨化粉，取上述米糠膨化粉500份、赤砂糖200份、蜂蜜100份、菊粉80份、水15000份混匀，得到米糠发酵液；(2)将嗜热链球菌5份、保加利亚乳杆菌1份、嗜酸乳杆菌1份、植物乳杆菌5份和酿酒酵母菌1份混匀得混合菌，将混合菌加入35℃水中，保持水温为35℃，120rpm振荡培养1h，使菌种恢复活性，得到益生菌活化液，益生菌活化液中的活菌数为8.1×1010cfu/ml；(3)将步骤(2)得到的益生菌活化液按照体积百分比2％的接种量接种到步骤(1)得到的米糠发酵液中，30℃厌氧发酵25天，过滤后得米糠益生菌酵素。对比例2一种米糠益生菌酵素的制备方法，步骤如下：(1)将米糠粉495份和雪莲果粉5份混匀经膨化机膨化后磨粉至150目得米糠膨化粉，取上述米糠膨化粉500份、赤砂糖200份、蜂蜜100份、菊粉80份、水15000份混匀得混悬液，超声处理30min，得到米糠发酵液；(2)将保加利亚乳杆菌1份、嗜酸乳杆菌1份、植物乳杆菌5份和酿酒酵母菌1份混匀得混合菌，将混合菌加入35℃水中，保持水温为35℃，120rpm振荡培养1.5h，使菌种恢复活性，得到益生菌活化液，益生菌活化液中的活菌数为8.1×1010cfu/ml；(3)将步骤(2)得到的益生菌活化液按照体积百分比2％的接种量接种到步骤(1)得到的米糠发酵液中，30℃厌氧发酵25天，过滤后得米糠益生菌酵素。对比例3一种米糠益生菌酵素的制备方法，步骤如下：(1)将米糠粉495份和雪莲果粉5份混匀经膨化机膨化后磨粉至150目得米糠膨化粉，取上述米糠膨化粉500份、赤砂糖200份、蜂蜜100份、菊粉80份、水15000份混匀得混悬液，超声处理30min，得到米糠发酵液；(2)将嗜热链球菌5份、保加利亚乳杆菌10份、嗜酸乳杆菌1份、植物乳杆菌5份和酿酒酵母菌10份混匀得混合菌，将混合菌加入35℃水中，保持水温为35℃，120rpm振荡培养1h，使菌种恢复活性，得到益生菌活化液，益生菌活化液中的活菌数为8.1×1010cfu/ml；(3)将步骤(2)得到的益生菌活化液按照体积百分比2％的接种量接种到步骤(1)得到的米糠发酵液中，30℃厌氧发酵25天，过滤后得米糠益生菌酵素。实验例使用实施例1-4及对比例1-3制成的米糠益生菌酵素对小鼠进行灌胃实验，探究米糠益生菌酵素对溃疡性结肠炎的作用，步骤如下：实验动物：选取90只雌性小鼠，体重20±2g，随机分为1个空白对照组、1个肠炎空白组和7个实验组，每组10只；造模处理：对1个肠炎空白组和7个实验组进行造模处理，配制3wt％葡聚糖硫酸钠(dss)溶液，让小鼠自由饮用7d，以诱发急性溃疡性结肠炎，构建模型小鼠；1个空白对照组小鼠自由饮用纯净水；处理方式：空白对照组和肠炎空白组使用生理盐水灌胃，实验组分别使用实施例1-4及对比例1-3中制得的米糠益生菌酵素灌胃，灌胃量和灌胃方式均一致。灌胃量为10ml/(kg·bw)，每日灌胃1次，持续灌胃28天，期间，小鼠自由进食、饮水。灌胃期间每天观察小鼠状态记录小鼠体重，小鼠28天的体重变化如表1所示。表1米糠益生菌酵素对小鼠体重的影响(n＝10)组别剂量ml/(kg·bw)小鼠体重变化(g)空白对照组(生理盐水)-1.382±0.050肠炎空白组(生理盐水)-0.827±0.064**实验组1(实施例1)101.019±0.044☆☆实验组2(实施例2)101.052±0.071☆☆实验组3(实施例3)101.051±0.048☆☆实验组4(实施例4)101.140±0.049☆☆实验组5(对比例1)100.870±0.041实验组6(对比例2)100.864±0.090实验组7(对比例3)100.863±0.060注：**表示p＜0.01，与空白对照组极显著差异；☆☆表示p＜0.01，与肠炎空白组极显著差异。灌胃结束后，各组随机选取小鼠解剖，取结肠，于福尔马林浸泡固定，进行苏木精-伊红染色以做病理检查，染色结果如图1所示。使用小鼠髓过氧化物酶(mpo)elisa试剂盒、小鼠tnf-aelisa试剂盒和小鼠白细胞介素17(il-17)elisa试剂盒测定结肠组织髓过氧化物酶(mpo)活性及tnf-α、il-17水平，称取结肠制成10％组织匀浆，14000r/min低温离心10min，取上清进行检测，检测结果如表2所示。髓过氧化物酶(mpo)活性及tnf-α、il-17的测定方法按照试剂盒中操作说明进行，结果分别以iu/g、pg/g组织表示。表2米糠益生菌酵素对溃疡性结肠炎小鼠结肠组织mpo、tnf-α、il-17水平的影响(n＝10)组别mpo/(iu/g)tnf-α(pg/g)il-17(pg/g)空白对照组(生理盐水)0.30±0.08108.12±44.7040.83±5.67肠炎空白组(生理盐水)1.92±0.07**565.24±61.65**296.68±19.13**实验组1(实施例1)1.00±0.20☆☆400.59±47.23☆☆198.00±18.21☆☆实验组2(实施例2)0.99±0.22☆☆411.98±34.65☆☆201.25±31.61☆☆实验组3(实施例3)0.72±0.17☆☆369.90±56.02☆☆162.25±29.87☆☆实验组4(实施例4)0.69±0.14☆☆328.95±42.75☆☆157.84±44.35☆☆实验组5(对比例1)1.82±0.18519.55±57.54267.93±43.98实验组6(对比例2)1.82±0.26536.56±65.20279.68±24.02实验组7(对比例3)1.90±0.33510.51±59.81272.99±34.38注：**表示p＜0.01，与空白对照组极显著差异；☆表示p＜0.05，与肠炎空白组极显著差异；☆☆表示p＜0.01，与肠炎空白组极显著差异。以上结果表明，与对比例1-3制备的米糠益生菌酵素相比，实施例1-4所制备的米糠益生菌酵素，按照10ml/(kg·bw)的剂量对溃疡性结肠炎小鼠进行灌胃，能够促进溃疡性结肠炎小鼠的体重增长，可以降低结肠组织mpo活性，同时降低结肠组织炎症细胞因子tnf-α和il-17水平，病理切片也显示实验组1-4中溃疡性结肠炎小鼠结肠黏膜炎症损伤有不同程度的缓解，结构排列较整齐，炎性细胞浸润较少，进而证实实施例1-4所制备的米糠益生菌酵素对结肠炎的治疗作用与降低肠道炎症反应、促进黏膜修复、改善黏膜屏障功能有关。此外，实施例1和对比例1制备的米糠益生菌酵素对溃疡性结肠炎小鼠灌胃实验相比较，表明经超声处理的米糠发酵液可显著改善米糠益生菌酵素的发酵状态，提升其益生作用；实施例1和对比例2、3制备的米糠益生菌酵素对溃疡性结肠炎小鼠灌胃实验相比较，表明实施例1中复合益生菌的菌株组成及比例均有利于多菌种共同发酵米糠发酵液，提升米糠益生菌酵素的有益效果。另外，各项数据表明，实施例4种制得的米糠益生菌酵素对结肠炎的治疗作用效果最好。当前第1页12