一种功能性天然产物复合缓释递送系统及其制备方法、应用与流程

本发明属于生物医药和功能食品绿色生产工艺技术领域，具体涉及一种功能性天然产物复合缓释递送系统及其制备方法、应用。

背景技术：

纳米技术为天然产物开发药物及营养素递送体系的发展提供科学依据。纳米载体能够通过生理屏障，将药物递送到特定的位置。同时纳米材料可以将疏水性物质包封于材料内，增大疏水性物质的溶解性，达到增容和保护效应。纳米材料可以将负载物递送到靶器官，控制药物的释放，降低药物毒副作用，通过内吞作用进入细胞，改变生物膜运转机制，增加药物对膜的透过性，有利于透皮吸收和细胞内药效发挥提高生物利用度及缓释作用。近年来，水溶性纳米粒子由于其具有良好生物相溶性好，临界胶束浓度低，稳定性好等特点，被广泛应用于生物医学，食品等各领域。自组装法是一种重要的水相纳米粒子制备方法，传统的自组装方法是利用两亲性嵌段或接枝聚合物在水介质中基于亲水-疏水平衡形成以疏水链段为核，亲水链段为壳的纳米粒子，但此法制备过程中要引入有机溶剂作为共同溶剂，己很难满足生物医药、食品科学等领域全亲水环境制备纳米粒子的需要。天然的、植物起源的表面活性剂一方面由于具有两亲性结构而表现出显著的表面活性，另一方面在大多数情况下他们也是人体重要的生物活性成分。因此，兼具表面活性和生物活性的独特性质。天然表面活性剂复合体系日益广泛在食品、化妆品、药品等领域得到应该。

薏苡（coixlacroyma-jobil.var.ma-yuenstapf）为禾本科一年生植物，也叫药玉米、米仁。其种子去外壳和种皮为薏苡仁(coixlachryma-jobikernel)，是传统的药食同源食品。薏苡仁含淀粉（40-45%），蛋白（40-45%）、活性多糖（0.5-1%）和脂类（2-6%）。薏苡仁含有人体所需多种必需的氨基酸，同时还含有降糖活性的植物多糖。薏苡仁中k、ca、na、mg、p五种元素含量较高，对帮助人体维持酸碱平衡、促进人体内某些酶的活性、与蛋白质协同维持机体渗透压中发挥重要的作用，是一种良好的营养平衡的谷物。薏苡仁在提取薏苡仁油和油脂类活性组分后，加工副产物中含有约25%的蛋白质和薏苡仁多糖，可用来进一步开发薏苡仁蛋白和薏苡仁多糖活性物。

蛋白质分子中含有的-nh2、-coon等活性基团使其可通过共价或非共价键与多糖、脂类以及小分子物质相互作用。由于蛋白质是一种两性电解质，溶液ph不同，蛋白质带电量以及电荷种类不同，使其可通过静电相互作用结合其他带相反电荷的物质。另一方面，蛋白质含有一定的疏水区域，可通过疏水相互作用包封小分子物质，并将其运输至目标位点。多糖由单糖组成的生物大分子，分子链上含有大量的氨基、羧基、羟基等活泼基团，增强了多糖的亲水性，可与生物组织(上皮细胞、黏膜等)形成氢键，粘附于组织表面，有利于药物、活性物质、基因等的递送。采用天然植物蛋白-多糖作为壁材，通过分子自组装开发功能性天然产物复合缓释递送系统对食品工业中天然、绿色功能性食品配料的开发和产品设计具有重要的指导意义。

技术实现要素：

针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于设计提供一种功能性天然产物复合缓释递送系统及其制备方法、应用的技术方案。本发明基于蛋白质/多糖可通过静电相互作用，氢键相互作用等非共价作用力自组装形成纳米复合物，采用乳化-多层自组装开发天然产物纳米载体，制备分散性好、稳定性好、负载率高的天然产物纳米粒子。采用无毒、无害、无残留危险，以超临界co2提取薏苡仁酯后副产物-脱脂薏苡粉为加工原料，经过绿色生产工艺制备得到薏苡仁蛋白和薏苡仁多糖为天然高分子材料开发纳米载体，可用于食品、保健品、医药、生物化工等领域运载体系，特别适合开发良好的亲和性的功能性食品。实现对不稳定营养素的包封作用，提高负载物的稳定性和生物利用度。

所述的一种功能性天然产物复合缓释递送系统的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

1）取脱脂干燥薏苡粉，过筛，加入蒸馏水溶解，调节ph，加入淀粉酶，再用超声波辅助萃取酶解；取萃取酶解得到的清蛋白，调节ph，加入碱性蛋白酶和复合风味蛋白酶，再用超声波辅助萃取酶解，灭酶，冷却，离心分离，得到沉淀和上清液，收集上清液得薏苡仁蛋白质；

2）将步骤1）得到的沉淀，加入蒸馏水溶解，调节ph，再用超声波辅助萃取，离心分离，得到提取液；取提取液加入乙醇，沉淀过滤，离心分离，得到薏苡仁多糖；

3）取负载物5-20份、蛋黄卵磷脂10-20份、酪蛋白酸钠1-10份，溶于薏苡仁蛋白质乙醇溶液，得到类脂溶液；用旋蒸发仪减压除去溶液中的有机溶剂，加入薏苡仁多糖溶液，超声水合后，高压均质，获得分散相平均粒径500-1000µm的纳米粒子；

4）将步骤3）所得纳米粒子中加入5-9倍量辅料，得到纳米粒子乳浊液，在-18摄氏度预冻24小时，再经真空冷冻干燥，得到功能性天然产物复合缓释递送系统。

所述的一种功能性天然产物复合缓释递送系统的制备方法，其特征在于所述步骤1）中取脱脂干燥薏苡仁粉，过40-100目筛，按料液比为1：5-20加入蒸馏水溶解，调节ph至3-7，加入淀粉酶，淀粉酶加入量为0.5-1%，温度40-50℃下，再用500-1000w超声波辅助酶解20-100分钟；取萃取酶解得到的清蛋白，调节ph至8-12，加入碱性蛋白酶和复合风味蛋白酶，碱性蛋白酶和复合风味蛋白酶加入量均为0.5-3%，温度50-70℃下,再用500-1000w超声波辅助酶解20-100分钟。

所述的一种功能性天然产物复合缓释递送系统的制备方法，其特征在于所述步骤2）中取沉淀，按料液比为1:10-20加入蒸馏水溶解，调节ph值至6-8，温度80-95℃下，500-1000w超声波辅助萃取20-100分钟；取提取液与乙醇的质量比为1:0.5。

所述的一种功能性天然产物复合缓释递送系统的制备方法，其特征在于所述步骤3）中薏苡仁蛋白质乙醇溶液中乙醇的含量为20-75%，薏苡仁多糖溶液浓度为10-30%。

所述的一种功能性天然产物复合缓释递送系统的制备方法，其特征在于所述步骤3）中高压均质条件为：均质压力0.1～80mpa，均质时间2～10min。

所述的一种功能性天然产物复合缓释递送系统的制备方法，其特征在于所述步骤4）中辅料为果胶或明胶。

所述的通过上述任一方法制备得到的功能性天然产物复合缓释递送系统。

所述的功能性天然产物复合缓释递送系统作为食品级天然产物纳米运载体的应用。

所述的功能性天然产物复合缓释递送系统作为食品功能配料的应用。

本发明与现有技术具有以下有益效果：

1、现有合成高分子材料作为运载体系在生物相容性及安全性方面仍存在安全隐患。本发明的目的是提供利用天然产物提取生物活性物后的粕中所含蛋白、多糖为原料开发天然产物复合缓释递送系统。极大提高天然产物附加值，能有效提高产品质量与利用率。

2、本发明制备的功能性天然产物复合缓释递送系统，利用天然产物其生物相容性好、可降解、易修饰等多种性质，通过乳化-自组装制备的天然产物纳米载体。具有制备简单、载药量高、控释性能好等优势，可用于药物及营养素，实现高效靶向递送。

3、本发明制备的功能性天然产物复合缓释递送系统，通过多糖与蛋白质之间的静电相互作用、氢键相互作用等非共价作用力，提高了纳米粒子的稳定性。当溶液ph位于蛋白质等电点处，纳米粒子粒径稳定。

附图说明

图1功能性天然产物递送系统在caco-2细胞模型的肠转运特征图。

具体实施方式

以下结合实施例来进一步说明本发明。

实施例1：

步骤一:取脱脂薏苡粉（超临界co2提取薏苡仁酯的废弃物）干燥粉碎，过50目筛，按照质量比1：10的料液比加入蒸馏水，调节ph至3，加入淀粉酶，酶的用量为0.5%，在温度45℃条件下，用500w超声波辅助萃取50分钟，提取清蛋白；调节ph值至10，加入碱性蛋白酶和复合风味蛋白酶，碱性蛋白酶和复合风味蛋白酶的用量为0.5%，在温度50℃条件下，用500w超声波辅助萃取50分钟，酶解后灭酶，迅速冷却至室温后进行离心分离，得到沉淀和上清液，收集上清液测定蛋白质含量为15%。

步骤二:取沉淀为原料，按照质量比1：10的料液比加入蒸馏水，调节ph至7，在温度95℃条件下，用500w超声波辅助萃取50分钟，行离心分离，得到提取液；提取液中按质量比1：0.5加入乙醇，经沉淀过滤、离心分离，获得的薏苡仁多糖活性组分为15%。

步骤三：各组分以重量份计，将负载物20份（负载物为天然产物或生物活性物）、蛋黄卵磷脂20份、酪蛋白酸钠10份，溶于由步骤一得到的薏苡仁蛋白质制备得到的薏苡仁蛋白质75%乙醇溶液中，室温下搅拌1h混合均匀，得到类脂溶液；在温度50℃下，用旋蒸发仪减压除去类脂溶液中的有机溶剂，形成薄膜后加入浓度为20%的薏苡仁多糖溶液，超声水合后，高压均质，均质压力50mpa，均质时间5min，获得分散相平均粒径500-1000µm稳定纳米粒子，包封率为50%。

步骤四：将纳米粒子中加入8倍量果胶，得到纳米粒子乳浊液，在-18摄氏度预冻24小时，再经真空冷冻干燥，得到功能性天然产物复合缓释递送系统。

实施例2：

步骤一:取脱脂薏苡粉（超临界co2提取薏苡仁酯的废弃物）干燥粉碎，过40目筛，按照质量比1：20的料液比加入蒸馏水，调节ph至5，加入淀粉酶，酶的用量为1%，在温度40℃条件下，用1000w超声波辅助萃取100分钟，提取清蛋白；调节ph值至9，加入碱性蛋白酶和复合风味蛋白酶，碱性蛋白酶和复合风味蛋白酶的用量为1%，在温度70℃条件下，用1000w超声波辅助萃取100分钟，酶解后灭酶，迅速冷却至室温后进行离心分离，得到沉淀和上清液，收集上清液测定蛋白质含量为17%。

步骤二:取沉淀为原料，按照质量比1：20的料液比加入蒸馏水，调节ph至8，在温度80℃条件下，用1000w超声波辅助萃取100分钟，行离心分离，得到提取液；提取液中按质量比1：0.5加入乙醇，经沉淀过滤、离心分离，获得的薏苡仁多糖活性组分为17%。

步骤三：各组分以重量份计，将负载物5份、蛋黄卵磷脂10份、酪蛋白酸钠5份，溶于由步骤一得到的薏苡仁蛋白质制备得到的薏苡仁蛋白质55%乙醇溶液中，室温下搅拌1h混合均匀，得到类脂溶液；在温度40℃下，用旋蒸发仪减压除去类脂溶液中的有机溶剂，形成薄膜后加入浓度为30%的薏苡仁多糖溶液，超声水合后，高压均质，均质压力20mpa,均质时间10min，获得分散相平均粒径500-1000µm稳定纳米粒子，包封率为70%。

步骤四：将纳米粒子中加入5倍量明胶，得到纳米粒子乳浊液，在-18摄氏度预冻24小时，再经真空冷冻干燥，得到功能性天然产物复合缓释递送系统。

实施例3：

步骤一:取脱脂薏苡粉（超临界co2提取薏苡仁酯的废弃物）干燥粉碎，过100目筛，按照质量比1：5的料液比加入蒸馏水，调节ph至3，加入淀粉酶，酶的用量为0.5%，在温度45℃条件下，用800w超声波辅助萃取60分钟，提取清蛋白；调节ph值至9，加入碱性蛋白酶和复合风味蛋白酶，碱性蛋白酶和复合风味蛋白酶的用量为2%，在温度70℃条件下，用800w超声波辅助萃取50分钟，酶解后灭酶，迅速冷却至室温后进行离心分离，得到沉淀和上清液，收集上清液测定蛋白质含量为19%。

步骤二:取沉淀为原料，按照质量比1：15的料液比加入蒸馏水，调节ph至6，在温度80℃条件下，用800w超声波辅助萃取60分钟，行离心分离，得到提取液；提取液中按质量比1：0.5加入乙醇，经沉淀过滤、离心分离，获得的薏苡仁多糖活性组分为18%。

步骤三：各组分以重量份计，将负载物5份（黄酮）、蛋黄卵磷脂10份、酪蛋白酸钠10份，溶于由步骤一得到的薏苡仁蛋白质制备得到的薏苡仁蛋白质60%乙醇溶液中，室温下搅拌1h混合均匀，得到类脂溶液；在温度50℃下，用旋蒸发仪减压除去类脂溶液中的有机溶剂，形成薄膜后加入浓度为15%的薏苡仁多糖溶液，超声水合后，高压均质，均质压力50mpa,均质时间8min，获得分散相平均粒径500-1000µm稳定纳米粒子，包封率为60%。

步骤四：将纳米粒子中加入8倍量果胶，得到纳米粒子乳浊液，在-18摄氏度预冻24小时，再经真空冷冻干燥，得到功能性天然产物复合缓释递送系统。

实施例4：

以实施例3制备得到的包封率为60%的稳定纳米粒子，即装载黄酮功能性天然产物传递系统为例。

caco-2细胞模型结构和功能类似于分化的小肠上皮细胞，具有微绒毛等结构，并含有与小肠刷状缘上皮相关的酶系。采用caco-2细胞模型验证装载黄酮的功能性天然产物递送系统在体内肠转运特征（图1）。在细胞培养条件下，生长在多孔的可渗透聚碳酸酯膜上的细胞可融合并分化为肠上皮细胞，形成连续的单层。在实验中，在120分钟处理结束时，装载黄酮的功能性天然产物递送系统(bel-load)在caco-2细胞模型的转运量提到了29.1％（图1b），而未装载转运量为21.8％。此外，装载黄酮的功能性天然产物递送系统的表观渗透率为5.6×10^-5，显着低于未装载的14.3×10^-5（图1c）。这些结果进一步证实了装载黄酮的功能性天然产物递送系统具有高papp值并且渗透性差的跨上皮细胞运输。该功能性天然产物递送系统有效提高黄酮类物质生物利用度。