本发明属于发酵饲料加工技术领域，具体涉及一种提高锦鲤肠道屏障功能的发酵饲料添加剂及制备方法。
背景技术：
微量元素在动物体内主要以酶的组分或激活剂的形式参与一系列生理生化反应，进而影响鱼类动物机体内的物质代谢及生长发育等活动，虽然动物机体对微量元素的需要量相对较少，但重要的生理作用使其成为动物体内必不可少的营养物质。铁是鱼类生长发育及维持自身代谢所需的重要元素，参与机体血红蛋白、肌红蛋白和细胞色素的构成，在氧气的运输、交换及组织呼吸过程起着重要的作用，并对机体的免疫机能起到一定的促进作用；铜主要存在于肌肉和肝脏中，最重要的生理作用之一是作为体内各种氧化酶的辅助因子，参与氧化磷酸化、自由基解毒等代谢过程，对提高动物的生产性能和抗氧化能力具有重要作用。铜缺乏会影响动物对铁的吸收，进而影响造血功能，而鱼类饲料中添加适宜浓度的铜可以提高肠道脂肪酶的活性，进而提高饲料的表观消化率；锌被称之为“生命元素”，是动物维持生命活动所必须的微量元素之一，作为多种酶的组成成分参与脂肪、碳水化合物和维生素等营养物质的代谢过程，锌是在铜之后发现的又一高效微量元素促生长添加剂，高锌具有良好的调节肠道健康的功效，研究表明，起到促生长，增强机体抗氧化能力，从而清除自由基，增强机体免疫力；
在鱼类生长过程中，会出现微量元素摄入不足的现象，尤其对于幼龄鱼，微量元素的摄入不足导致了鱼类出现生产性能下降，肠道微生物失衡，肠道发育受阻，消化酶活性降低，出现肠炎，抵抗力降低等问题，因此，通过在饲料中额外添加铁、铜、锌是满足鱼类微量了需要的重要措施，但是研究发现，无机微量元素（如硫酸亚铁、氯化亚铁、氯化铜、硫酸铜等）的生物有效性较低，其吸收利用率低于10%，其余部分通过粪便排入环境，造成污染。
肠道屏障是指肠道能够防止肠腔内的有害物质（如细菌和各种毒素）穿过肠黏膜进入体内的结构和功能的总和。肠道屏障由物理屏障、化学屏障、微生物屏障和免疫屏障组成。肠道健康水平对动物整体健康水平十分重要。作为机体抵御致病抗原入侵的防线，肠黏膜屏障的完整性极易受到损害。但是目前由于植物性饲料原料过量使用，摄食高脂饲料以及饲料的投喂方式不合理，都会导致的鱼类肠道屏障功能损伤，出现肠道或肠道上皮细胞紧密连接表达的降低、肠道黏液分泌减少或杯状细胞数量减少，或者肠道通透性的增加或肠道上皮细胞teer的异常降低等象限。常见的提高肠道健康的方法有添加益生菌、益生元、酶、抗菌肽、酸化剂等，但是单独添加无论是成分还是发挥的效应均较为单一。
技术实现要素：
为解决上述问题，本发明提供一种提高锦鲤肠道屏障功能的发酵饲料添加剂及制备方法，且该饲料添加剂安全、高效、无毒副作用，无污染，无耐药性。
本发明通过以下技术方案来实现：
一种提高锦鲤肠道屏障功能的发酵饲料添加剂，包括以下重量份数的组分：发酵铁0.08-0.12份，发酵铜0.032-0.05份，发酵硒0.4-1.0份，发酵锌0.24-0.63份，葡聚糖酶0.04-0.06份。
进一步的，一种提高锦鲤肠道屏障功能的发酵饲料添加剂，包括以下重量份数的组分：发酵铁0.1-0.12份，发酵铜0.04-0.05份，发酵硒0.6-0.8份，发酵锌0.3-0.4份，葡聚糖酶0.05-0.06份。
进一步的，一种提高锦鲤肠道屏障功能的发酵饲料添加剂的制备方法，包括以下步骤：
步骤一、制备含有发酵铁、发酵铜、发酵硒和发酵锌的发酵微量元素混合物；
步骤二、将步骤一制备的发酵微量元素混合物和葡聚糖酶按比例混合，即得到提高锦鲤肠道屏障功能的发酵饲料添加剂。
进一步的，所述发酵微量元素混合物的制备方法具体包括以下步骤：
s1、培养基的制备：按照1l酒精工业黄水添加尿素6ｇ、粉渣2g、麸皮2g、葡萄糖2g、氯化钠2g的组成配制发酵营养基质，然后于121℃灭菌20min，冷却后备用；
s2、将复苏的菌株按照1%的比例接种于步骤s1制得的营养基质中，于发酵罐中培养至24-32h；
s3、将含有铁、铜、硒、锌的无机态微量元素分别加入至步骤s2的发酵罐中，搅拌均匀后，继续发酵至48h，发酵结束后，得到发酵混合物；
s4、将发酵混合物与α-淀粉混合得到混合物料，其中所述发酵混合物占α-淀粉添加量的9%~11%，将混合物料于60℃恒温干燥箱内烘干，从而制成发酵微量元素混合物。
进一步的，所述步骤s2中菌株为啤酒酵母、德式乳酸杆菌、纳豆芽孢杆菌、双歧杆菌其中的一种。
进一步的，一种提高锦鲤肠道屏障功能的发酵饲料添加剂应用时将制备的发酵饲料添加剂加入到基础饲料中。
进一步的，所述基础饲料包括鱼粉、发酵棉粕、豆粕、菜粕、大米蛋白、α-淀粉、麸皮、次粉。
进一步的，所述发酵饲料添加剂与基础饲料的重量比为1：499-1：99。
本发明的有益效果在于：
（1）本发明发酵饲料添加剂具有较多的有益成分之外，同时还有大量的益生菌，益生菌通过与入侵病原体竞争肠上皮细胞和黏膜层黏附位点，从而抑制病原菌定植和移位，提高肠道屏障功能，还能保证添加剂中各种营养物质具有较高的吸收率；
（2）本发明饲料添加剂中添加有葡聚糖酶，可以分解麦类和谷类植物胚乳细胞壁中的β-葡聚糖，在饲料中可用于降低非淀粉多糖及其抗营养因子的含量，改善鱼类对营养物质的吸收，提高生长速度和饲料转化效率，还能有效消除植物性饲料细胞壁物质对鱼的肠道黏膜结构完整性的破坏作用，保证鱼的肠道屏障功能正常，维护肠道健康，减少病菌由肠道进入鱼体，保障鱼体健康，降低发病率，较少用药量；
（3）添加适量的微量元素可提高鱼类肠道和脾脏的抗氧化能力，促进免疫器官生长发育，提高血清特异性抗体igm、补体c3和c4含量，提高溶菌酶活性，以增强鱼体特异性和非特异性免疫能力，抵抗病原菌感染，降低发病率和用药量，铜锌是超氧化物歧化酶（cuzn-sod）的结构成分，可通过影响该酶的活性清除超氧自由基，从而减少膜不饱和脂肪酸的脂质过氧化，保护细胞免受损伤，在机体的氧化和抗氧化平衡中发挥着重要作用，锌是生物膜脂蛋白组成成分之一，在维持细胞膜的完整性和稳定性以及防止脂质的过氧化方面起至关重要的作用；
本发明与化学合成的有机态微量元素相比，本发明制备的发酵态饲料添加剂生物有效性更稳定，吸收率更高，采用上皮细胞吸收模型研究发现，其吸收率在28.6%以上，而目前无机微量元素的吸收率在10%以下，且硒作为微生物发酵态微量元素的典型代表，酵母硒在动物生产中的应用却具有不错的效果，不但硒的生物有效性得到了提高，同时，也显著降低了无机硒的毒性，酵母硒能够有效的改善鱼类肠道环境，清除自由基，促进鱼类生长和改善动物健康的功效；
（4）与化学合成的微量元素饲料添加剂相比，本发明在制备发酵铁、发酵铜、发酵硒和发酵锌时采用酒精工业黄水、粉渣、麸皮等副产物作为培养原料和基质，从而扩大了资源利用，降低了饲料添加剂的生产成本，且制备的发酵态饲料添加剂生物有效性更稳定；
（5）本发明在制备发酵铁、发酵铜、发酵硒和发酵锌时通过对酵母菌进行筛选和驯化培养、发酵参数筛选等，更具针对性，提高了发酵的效率，并保证了添加剂中各种营养物质具有较高的吸收率，节约饲料成本；
综上所述，本发明所述范围的饲料添加剂可促进锦鲤肠道的发育，上调肠道紧密连接蛋白表达量，增强肠道消化酶活性，提高生长性能，另外还能提高特异性和非特异性免疫力，保障鱼体健康，降低发病率，减少用药量，且提供了一种基于酒精工业黄水、麸皮等工、农业副产物为基质制作发酵态饲料添加剂的一系列方法步骤，制作简单，便于大规模推广。
具体实施方式
下面根据具体实施例中的技术方案对本发明进行清楚、完整地描述。
实施例1：
一种提高锦鲤肠道屏障功能的发酵饲料添加剂，包括以下重量份数的组分：发酵铁0.1份，发酵铜0.05份，发酵硒0.6份，发酵锌0.4份，葡聚糖酶0.05份。
其中先制备含有发酵铁、发酵铜、发酵硒和发酵锌的发酵微量元素混合物，其制备方法为：
s1、培养基的制备：按照1l酒精工业黄水添加尿素6ｇ、粉渣2g、麸皮2g、葡萄糖2g、氯化钠2g的组成配制发酵营养基质，然后于121℃灭菌20min，冷却后备用；
s2、选用啤酒酵母、德式乳酸杆菌、纳豆芽孢杆菌、双歧杆菌其中的一种，将复苏的菌株按照1%的比例接种于步骤s1制得的营养基质中，于发酵罐中培养至24-32h；
s3、将含有铁、铜、硒、锌的无机态微量元素分别加入至步骤s2的发酵罐中，搅拌均匀后，继续发酵至48h，发酵结束后，得到发酵混合物；
s4、将发酵混合物与α-淀粉混合得到混合物料，其中所述发酵混合物占α-淀粉添加量的9%~11%，将混合物料于60℃恒温干燥箱内烘干，从而制成发酵微量元素混合物。
将制备的发酵微量元素混合物和葡聚糖酶按比例混合，即得到提高锦鲤肠道屏障功能的饲料添加剂。
将制得的饲料添加剂按0.2%添加到锦鲤基础饲料中，制粒，放4℃保存。
实验选用初重为15.2±0.5g的红白锦鲤为试验对象，驯化7d后，随机分到8个水族箱中，实验设2个组，每组4个重复，一组为对照组投喂基础饲料，另一个组为试验组，投喂实验饲料，投饵量为鱼体重的2％～4％，养殖为60d，养殖结束后，饥饿24h，对实验鱼进行生长性测定，并随机采集6尾鱼的血液和肠道，测定血清免疫指标和肠道紧密连接蛋白表达。
表1发酵饲料添加剂对室内养殖锦鲤生产性能的影响
由表1可得，该发酵饲料添加剂显著提高了锦鲤的增重率，降低了饵料系数，肠体指数、肠长指数和成活率试验组也显著高于对照组，因此使用该锦鲤饲料添加剂能够节约养殖成本，提高了养殖效益。
表2发酵饲料添加剂对室内养殖锦鲤血液免疫指标的影响
由表2可得，实施例1组的溶菌酶、ach50、acp、akp活性和igm含量均显著高于对照组，使用该发酵饲料添加剂能显著提高锦鲤的免疫力，有助于改善机体健康，降低死亡率。
表3发酵饲料添加剂对室内养殖锦鲤肠道指标的影响
由表3可得，实施例1组的蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶活性显著高于对照组，肠道中紧密连接蛋白claudin-3和zo-1的表达量也显著高于对照组，肠粘膜上皮细胞之间的紧密连接是肠道物理屏障的主要结构，紧密连接的通透性决定着整个肠上皮细胞的屏障功能，因此该发酵饲料添加剂显著提高了锦鲤肠道的屏障功能。
实施例2：
一种提高锦鲤肠道屏障功能的发酵饲料添加剂，包括以下重量份数的组分：发酵铁0.12份，发酵铜0.04份，发酵硒0.7份，发酵锌0.3份，葡聚糖酶0.04份。
其中先制备含有发酵铁、发酵铜、发酵硒和发酵锌的发酵微量元素混合物，其制备方法为：
s1、培养基的制备：按照1l酒精工业黄水添加尿素6ｇ、粉渣2g、麸皮2g、葡萄糖2g、氯化钠2g的组成配制发酵营养基质，然后于121℃灭菌20min，冷却后备用；
s2、选用啤酒酵母、德式乳酸杆菌、纳豆芽孢杆菌、双歧杆菌其中的一种，将复苏的菌株按照1%的比例接种于步骤s1制得的营养基质中，于发酵罐中培养至24-32h；
s3、将含有铁、铜、硒、锌的无机态微量元素分别加入至步骤s2的发酵罐中，搅拌均匀后，继续发酵至48h，发酵结束后，得到发酵混合物；
s4、将发酵混合物与α-淀粉混合得到混合物料，其中所述发酵混合物占α-淀粉添加量的9%~11%，将混合物料于60℃恒温干燥箱内烘干，从而制成发酵微量元素混合物。
将制备的发酵微量元素混合物和葡聚糖酶按比例混合，即得到提高锦鲤肠道屏障功能的饲料添加剂。
将制得的饲料添加剂按0.3%添加到锦鲤基础饲料中，制粒，放4℃保存。
实施例3：
一种提高锦鲤肠道屏障功能的发酵饲料添加剂，包括以下重量份数的组分：发酵铁0.11份，发酵铜0.05份，发酵硒0.65份，发酵锌0.3份，葡聚糖酶0.06份。
其中先制备含有发酵铁、发酵铜、发酵硒和发酵锌的发酵微量元素混合物，其制备方法为：
s1、培养基的制备：按照1l酒精工业黄水添加尿素6ｇ、粉渣2g、麸皮2g、葡萄糖2g、氯化钠2g的组成配制发酵营养基质，然后于121℃灭菌20min，冷却后备用；
s2、选用啤酒酵母、德式乳酸杆菌、纳豆芽孢杆菌、双歧杆菌其中的一种，将复苏的菌株按照1%的比例接种于步骤s1制得的营养基质中，于发酵罐中培养至24-32h；
s3、将含有铁、铜、硒、锌的无机态微量元素分别加入至步骤s2的发酵罐中，搅拌均匀后，继续发酵至48h，发酵结束后，得到发酵混合物；
s4、将发酵混合物与α-淀粉混合得到混合物料，其中所述发酵混合物占α-淀粉添加量的9%~11%，将混合物料于60℃恒温干燥箱内烘干，从而制成发酵微量元素混合物。
将制备的发酵微量元素混合物和葡聚糖酶按比例混合，即得到提高锦鲤肠道屏障功能的饲料添加剂。
将制得的饲料添加剂按0.5%添加到锦鲤基础饲料中，制粒，放4℃保存。
上述实施例2及实施例3以与实施例1相同的方式设置实验组及对照组进行试验，每组4重复，共12个网箱，实施例2及实施例3采用大小为86±2g的红白锦鲤，用网箱养殖8周，每天投喂2次，投喂量为体重的4%-6%，8周饲养实验结束后，饥饿24h，测定生长性能和肠道指标。
表4提发酵饲料添加剂对室外网箱养殖锦鲤生长指标的影响
由表4可得，该发酵饲料添加剂显著提高了锦鲤的增重率，降低了饵料系数，肠体指数、肠长指数和成活率试验组也显著高于对照组。
表5发酵饲料添加剂对室外网箱养殖锦鲤肠道指标的影响
由表5可得，实施例2组和3组的蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶活性显著高于对照组，肠道中紧密连接蛋白claudin-3和zo-1的表达量也显著高于对照组。
由上述试验可知，本发明实施例的提高锦鲤肠道屏障功能的发酵饲料添加剂中应用，可促进肠道发育，改善肠道结构，增强肠道消化酶活性，提高锦鲤生长性能，增强锦鲤肠道的免疫力和抗病力，降低疾病发生率，减少用药，节约养殖成本。
综上所述，本发明实施例的提高锦鲤肠道屏障功能的发酵饲料添加剂，效果好且稳定；本发明实施例的提高锦鲤肠道屏障功能的发酵饲料添加剂的制备方法简单，制备条件可控性好，效果显著。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和优点，本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内，本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。