竹节参总皂苷在干预肠道屏障功能障碍药物上的应用
【技术领域】
[0001]本发明提供一种竹节参在制药中的应用，具体是将竹节参应用于制备延缓衰老状态的肠道屏障功能障碍的药物。
【背景技术】
[0002]作为机体能量的首要来源组织-肠道在衰老中的作用逐渐引起研究者的重视，近期相关研究提示机体衰老始于肠道的衰老。大量研究表明，随着年龄的增长，肠道粘膜屏障功能逐渐发生障碍，使肠道通透性增加，细菌、内毒素等外源性物质即可通过紧密连接进入体循环，触发全身炎症反应综合征或多器官功能不全综合征。因此，深入探讨哺乳动物衰老过程中肠道粘膜屏障功能障碍的分子机制具有重要的科学意义。氧化应激学说是目前公认的衰老机制之一，氧化损伤及线粒体功能障碍可导致能量缺失和细胞毒性产物聚集，以致细胞的死亡。近期秀丽隐杆线虫的研究显示，氧化应激参与肠道的衰老，并可调节肠道屏障功能障碍。本课题组前期大量研究也发现，竹节参皂苷具有显著的抗氧化应激的作用，可增加多种体内外氧化应激疾病模型的Nrf2、Sirtl、PGC-l等表达水平。但竹节参总皂苷能否通过抗氧化应激恢复衰老大鼠肠道屏障功能尚不清楚。本研究拟从线粒体氧化应激角度研究竹节参总皂苷对自然衰老大鼠回肠粘膜屏障功能障碍的调节作用及机制。
【发明内容】
[0003]本发明提供一种竹节参总皂苷在制备延缓衰老状态的肠道屏障功能障碍的药物上的应用。该竹节参总皂苷是通过促进衰老过程中肠道抗氧化应激蛋白的表达来改善衰老肠道粘膜屏障的，即，竹节参总皂苷通过降低大鼠衰老过程中肠道抗氧化应激相关蛋白减少的程度，调节自然衰老大鼠氧化应激水平。
[0004]该竹节参总皂苷还可以通过促进31代1、？6(>1€[的表达，使31代1、？6(:-1€[的表达增多，抗氧化能力增强，即竹节参总皂苷使通过降低大鼠衰老过程中肠道线粒体Sirtl、PGC-1α蛋白减少的程度，来调节自然衰老大鼠氧化应激水平，从而改善衰老肠道粘膜屏障功能障碍。该竹节参总皂苷还可以通过调节衰老的ΑΜΡΚ的活性减少氧化应激损伤的程度来改善衰老肠道粘膜屏障功能障碍。
[0005]竹节参总皂苷，灌胃用时用5%羧甲基纤维素钠(CMC-Na)配置成所需浓度即可。
[0006]本发明所用的动物SPF级雄性SD大鼠60只，购于三峡大学实验动物中心，分为成年组(6月龄)、衰老组(24月龄)及药物干预组(高、中、低剂量竹节参总皂苷干预24月龄大鼠)五组，每组12只大鼠。竹节参总皂苷高、中、低剂量分别为10，30，60mg.kg—1。大鼠自18月龄开始灌胃给药，每天一次，每周给药6次，共给药6个月。给药6个月结束后，大鼠禁食24h后10%水合氯醛麻醉，沿腹正中线进入腹中分离回肠。取0.5cm长的小段放入4%多聚甲醛的缓冲液中固定约24h，经脱水、包埋制成蜡块，保存于4°C冰箱。
[0007]本发明所用的试剂0ccludin、PGC-la、H0_l、p_AMPK抗体，购自Santa Cruz公司。Sirtl抗体购自Millipore公司。Nrf2和NQ01抗体购自Abeam公司。HRP标记的二抗、5%BSA、DAB试剂盒、苏木素，购自武汉博士德生物工程有限公司。
[0008]免疫组织化学检测将保存的蜡块，切片，片厚约4μπι，制备成石蜡切片。切片常规脱蜡至水后，置于抗原修复液水浴煮沸3 0 m i η。自然冷却后加3 %双氧水封闭过氧化物酶lOmin，PBS冲洗3次每次5min，之后加BSA封闭30min，然后一抗4°C孵育，过夜。加入辣根过氧化物酶标记的二抗，室温孵育lh，DAB显色，苏木素复染5min，盐酸酒精分化，脱水封片。于显微镜下观察，利用Image-Pro Plus 7.0图像分析系统拍片。
【附图说明】
[0009]图1为不同月龄大鼠及竹节参总皂苷干预大鼠回肠Occludin免疫组织化学染色(X200)，其中，A为6月龄，B为24月龄，该图中，C为竹节参低剂量组10mg/Kg，D为竹节参中剂量组30mg/Kg，E为竹节参高剂量组60mg/Kg。
[0010]图2为不同月龄大鼠及竹节参总皂苷干预大鼠回肠Nrf2免疫组织化学染色(X200)，其中，A为6月龄，B为24月龄，该图中，C为竹节参低剂量组10mg/Kg，D为竹节参中剂量组30mg/Kg，E为竹节参高剂量组60mg/Kg。
[0011]图3为不同月龄大鼠及竹节参总皂苷干预大鼠回肠H0-1免疫组织化学染色(X200)，其中，A为6月龄，B为24月龄，该图中，C为竹节参低剂量组10mg/Kg，D为竹节参中剂量组30mg/Kg，E为竹节参高剂量组60mg/Kg。
[0012]图4不同月龄大鼠及竹节参总皂苷干预大鼠回肠NQ0-1免疫组织化学染色(X200)，其中，A为6月龄，B为24月龄，该图中，C为竹节参低剂量组10mg/Kg，D为竹节参中剂量组30mg/Kg，E为竹节参高剂量组60mg/Kg。
[0013]图5不同月龄大鼠及竹节参总皂苷干预大鼠回肠Sirtl免疫组织化学染色(X200)，其中，A为6月龄，B为24月龄，该图中，C为竹节参低剂量组10mg/Kg，D为竹节参中剂量组30mg/Kg，E为竹节参高剂量组60mg/Kg。
[0014]图6不同月龄大鼠及竹节参总皂苷干预大鼠回肠PGC-1免疫组织化学染色(X200)，其中，A为6月龄，B为24月龄，该图中，C为竹节参低剂量组10mg/Kg，D为竹节参中剂量组30mg/Kg，E为竹节参高剂量组60mg/Kg。
[0015]图7不同月龄大鼠及竹节参总皂苷干预大鼠回肠P-AMPK免疫组织化学染色(X200)，其中，A为6月龄，B为24月龄，该图中，C为竹节参低剂量组10mg/Kg，D为竹节参中剂量组30mg/Kg，E为竹节参高剂量组60mg/Kg。
【具体实施方式】
[0016]回肠上皮细胞间紧密连接蛋白occludin的变化
[0017]免疫组化结果(图1)显示，成年组大鼠回肠Occludin表达明显，位于绒毛上皮细胞的胞浆，衰老组大鼠相应部位的表达显著降低。竹节参总皂苷干预组大鼠回肠Occludin表达比衰老组大鼠回肠相应部位Occludin表达显著升高，但略低于成年组大鼠回肠Occludin表达。
[0018]抗氧化应激相关蛋白Nrf 2、H0-1、NQ0_1的表达变化
[0019]免疫组化的结果(图2)显示，成年组大鼠回肠Nrf2表达较多，主要位于绒毛上皮细胞的胞核和胞浆及隐窝部位，而衰老组大鼠相应部位的表达减少，主要位于绒毛上皮细胞的胞浆及隐窝部位，绒毛上皮细胞的胞核几乎不表达;竹节参总皂苷药物干预组大鼠回肠Nrf2表达与衰老组大鼠比较呈增多趋势，主要位于绒毛上皮细胞的胞核和胞浆及隐窝部位。
[0020]免疫组化的结果(图3)显示，成年组大鼠H0-1表达主要位于绒毛上皮细胞的胞核和胞浆及隐窝部位，其在衰老组大鼠回肠的表达显著减少，主要位于绒毛上皮细胞的胞核及隐窝的胞核部位;药物干预组大鼠表达较衰老组大鼠有所增多，其中竹节参总皂苷低剂量组主要表达于绒毛上皮细胞胞核及隐窝的胞核和胞浆部位，竹节参总皂苷中剂量组和竹节参总皂苷高剂量组主要表达于绒毛上皮细胞胞核、胞浆及隐窝部位。
[0021]免疫组化的结果(图4)显示，成年组大鼠回肠NQ0-1表达较多，主要位于绒毛上皮细胞的胞浆及隐窝部位，而衰老组大鼠相应部位的表达减少，主要位于绒毛上皮细胞的胞浆;竹节参总皂苷药物干预组大鼠表达与衰老组大鼠比较呈增多趋势，其中竹节参总皂苷低剂量组主要表达于隐窝的胞浆部位，但中剂量组和高剂量组表达部位主要位于绒毛上皮细胞的胞浆及隐窝的胞浆，但表达量不及成年组大鼠。
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