一种猪肠道组织中粘蛋白12荧光定量pcr检测方法
【专利摘要】本发明涉及一种猪肠道组织中粘蛋白（MUC）12转录本荧光定量PCR检测方法。该方法包括设计特异性荧光定量PCR引物，建立荧光定量PCR反应体系和反应程序，制备含有目的片段MUC12的质粒作为标准质粒绘制标准曲线，最后待测样品的目的基因和内参基因GAPDH同时扩增，根据相对定量△△CT方法检测基因的表达量。本发明由于利用了荧光定量PCR具有灵敏度高，特异性强，无污染且实时、准确、快速的特点，从而填补了该基因在猪肠道组织中检测方法的空白，为精确检测猪肠道部位的MUC12表达水平，从而辅助评价动物肠道粘膜屏障及其免疫状态提供了一个实用方法。
【专利说明】—种猪肠道组织中粘蛋白12荧光定量PCR检测方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种猪肠道组织中粘蛋白12荧光定量PCR检测方法，属于生物【技术领域】。
【背景技术】
[0002]粘蛋白(MUC)主要是由柱状上皮间的杯状细胞分泌的高分子量糖蛋白。MUC是粘膜表面粘液层的主要组分，是机体抵抗外界刺激第一道防线的重要组成部分，对上皮细胞起重要的保护和润滑作用。按照结构特点，MUC可分为三类:膜结合型、凝胶形成型和分泌性。其中膜结合型粘蛋白依靠跨膜区与细胞膜结合，形成立体位阻为易受损的上皮细胞提供保护，抵御外界因子的攻击，并参与形成保护性的细胞外粘蛋白凝胶。MUC12即属于这一类型。人类MUC12分子的相关研究表明，该分子可参与保护上皮细胞、调节粘膜表面粘附性能并介导信号传导通路，其表达水平与溃疡性结肠炎等疾病直接相关。猪的消化道是营养学与病理学研究的重要组织部位，对猪肠道部位MUC12进行精确定量可有助于我们对被检猪只免疫状态及其疾病过程分析提供有力的理论数据支持。
[0003]目前，检测细胞因子的常用方法主要分为从蛋白水平和基因水平检测两种。蛋白水平的检测主要包括流式细胞术，ffestern-blot方法与ELISA,均是通过标记后的抗体来鉴定目的蛋白的表达，但由于目前尚缺乏与之对应的抗猪MUC12抗体，因此以上方法尚缺乏可行性。
[0004]基因水平的检测包括普通聚合酶链式反应(PCR)技术与实时荧光定量PCR技术。常规PCR由于灵敏度较低也仅常用于定性检测，而荧光定量PCR具有灵敏度高，且实时、定量、快速等特点。常用荧光定量PCR技术又分为荧光探针法(TaqMan探针技术)与荧光染料法(SYBR Green法) 。与TaqMan技术相比,SYBR Green法实验设计简单,无需设计多个探针即可快速检测多个基因，初始成本更低，通用性好。然而，目前关于用染料法检测猪肠道的MUC12的荧光定量的检测方法却尚未建立。
【发明内容】
[0005]为了解决上述问题，本发明提供一种猪肠道组织中粘蛋白12转录本荧光定量PCR检测方法。
[0006]首先，本发明提供一种粘蛋白12转录本荧光定量PCR引物，其正向引物具有SEQID N0.1所示的序列，反向引物具有SEQ ID N0.2所示的序列。
[0007]进一步地，本发明还提供一种猪肠道组织中粘蛋白12转录本荧光定量PCR检测方法，其为以猪肠道组织cDNA为模板，用所述的引物进行荧光定量PCR，根据相对定量ΛΛ Ct方法确定样品粘蛋白12的表达变化。
[0008]在本发明一个具体的实施方案中，所述猪肠道组织中MUC12转录本荧光定量PCR检测方法包括如下步骤:首先设计特异性荧光定量引物，然后建立实时定量PCR反应体系和反应程序，制备含有目的片段的质粒作为标准质粒绘制标准曲线，最后将待测样品目的基因MUC12与内参基因GAPDH同时扩增，根据相对定量Λ Λ CT方法确定目的基因的表达变化。
[0009]本发明检测方法中，每20 μ I的荧光定量PCR反应体系如下:10 μ I荧光定量PCR预混液，5ymol/L正向引物、反向引物各0.5μ 1，2μ I cDNA，水补足至20 μ I。
[0010]本发明检测方法中，PCR反应程序如下:50°C 2min，95°C 10min,95°C 15sec，60°C lmin，扩增 40 个循环，最后 95°C 15sec，60°C lmin,95°C 30sec 作熔解曲线。
[0011]更进一步地，本发明还提供含有所述引物的粘蛋白12转录本荧光定量PCR检测试剂盒。优选地，本发明提供的试剂盒还可以含有本领域常规的荧光定量PCR所需的其他试剂。该试剂盒可实现对猪肠道部位MUC12进行精确定量，并有助于我们对被检猪肠道粘膜屏障及其免疫状态分析。
[0012]鉴于荧光定量PCR技术对检测过程中特异性要求较高，本发明是通过以下方法来提闻检测特异性的:
[0013]利用Perlprimer软件设计多对引物，并进行荧光定量PCR扩增，根据溶解曲线、标准曲线的结果，选取特异性好、扩增效率高的引物。
[0014]本发明利用荧光定量PCR技术提供了一种能够实时、快速、准确地检测猪肠道组织中MUC12mRNA的检测方法，从而填补了该细胞因子在猪肠道中检测方法方面的空白。
【专利附图】
【附图说明】
[0015]图1为用第I对引物进行荧光定量PCR标准品扩增的熔解曲线。图中横坐标代表解链温度，纵坐标代表相对荧光强度。图中不同颜色的曲线A、B、C、D、E、F、G、H代表标准品拷贝数107、106、105、104、103、102拷贝数/ μ I及以DEPC处理水作为模版的空白对照的熔
解曲线。
[0016]图2为用第I对引物进行荧光定量PCR标准品扩增的荧光信号图。图中横坐标代表循环数，纵坐标代表相对荧光强度。图中的不同颜色的曲线Α、B、C、D、Ε、F、G、H代表标准品拷贝数IO7、IO6、IO5、IO4、IO3、IO2拷贝数/ μ I及以DEPC处理水作为模版的空白对照的
突光信号。
[0017]图3为用第I对引物进行荧光定量PCR扩增的标准曲线y= —
3.3271og(conc)+25.224。图中横坐标代表标准质粒的拷贝数(拷贝数/ μ 1)，纵坐标代表循环数。
[0018]图4为用第2对引物进行荧光定量PCR标准品扩增的熔解曲线。图中横坐标代表解链温度，纵坐标代表相对荧光强度。图中不同颜色的曲线Α、B、C、D、Ε、F、G、H代表标准品拷贝数107、106、105、104、103、102拷贝数/ μ I及以DEPC处理水作为模版的空白对照的熔
解曲线。
[0019]图5为用第2对引物进行荧光定量PCR标准品扩增的荧光信号图。图中横坐标代表循环数，纵坐标代表相对荧光强度。图中的不同颜色的曲线Α、B、C、D、Ε、F、G、H代表标准品拷贝数IO7、IO6、IO5、IO4、IO3、IO2拷贝数/ μ I及以DEPC处理水作为模版的空白对照的 突光信号。
[0020]图6为用第2对引物进行荧光定量PCR扩增的标准曲线y= —2.4521og(conc)+20.155。图中横坐标代表标准质粒的拷贝数(拷贝数/ μ 1)，纵坐标代表循环数。图7为用第3对引物进行荧光定量PCR标准品扩增的熔解曲线。图中横坐标代表解链温度，纵坐标代表相对荧光强度。图中不同颜色的曲线A、B、C、D、E、F、G、H代表标准品拷贝数107、106、105、104、103、102拷贝数/ μ I及以DEPC处理水作为模版的空白对照的熔解曲线。
[0021]图8为用第3对引物进行荧光定量PCR标准品扩增的荧光信号图。图中横坐标代表循环数，纵坐标代表相对荧光强度。图中的不同颜色的曲线Α、B、C、D、Ε、F、G、H代表标准品拷贝数IO7、IO6、IO5、IO4、IO3、IO2拷贝数/ μ I及以DEPC处理水作为模版的空白对照的
突光信号。
[0022]图9为用第3对引物进行荧光定量PCR扩增的标准曲线y= —
2.6961og(conc)+20.858。图中横坐标代表标准质粒的拷贝数(copies/ μ 1)，纵坐标代表循环数。
【具体实施方式】
[0023]以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
[0024]动物组织总RNA提取试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司)，反转录试剂盒(Thermo 公司)、Power SYBR? Green PCR Master Mix(ABI 公司)，PCR Mixture、pMD18_T、感受态细胞DH5a (TakaRa公司)
[0025]实施例1制备含MUC12目的基因的标准曲线
[0026]一、引物设计与合成
[0027]先从http://www.ncb1.nlm.nig.gov/GenBank 中查找猪 MUC12 序列(FJ715471.1)，然后根据猪MUC12mRNA保守序列(CDS区域)，利用Perlprimer软件设计3对引物送上海英骏生物工程有限公司合成。引物、模板序列如下:
[0028](I)第I对引物
[0029]正向引物:5’-GTTACCAGTGCAAATCCCTC-3’ (SEQ ID N0.1)；
[0030]反向引物:5，-TTGTTAGTCACTTTCACCCTC-3，(SEQID N0.2)。
[0031](2)第2对引物
[0032]正向引物:5’-GTTGTGGTGGAACATGAAGTC-3’ (SEQ ID N0.3)；
[0033]反向引物:5’-GCTTGAGGTTTATGATCTTGGT-3’ (SEQ ID N0.4)；
[0034](3)第3对引物
[0035]正向引物:5’-AACCTCACCAAGATCATAAACC-3’ (SEQ ID N0.5)；
[0036]反向引物:5，-CTTGTCAAAGCACAGATCCA-3’(SEQ ID N0.6)；
[0037]二、不同处理的仔猪肠道样品的采集
[0038]为检测干酪乳杆菌Lactobacillus casei Zhang在日粮中添加后对仔猪肠道MUC12表达水平的影响，本试验采用单因素随机试验设计，选取64头14日龄左右的杜X长X大仔猪，每组4个重复，每个重复8头猪。试验分为2个处理组:1)对照组，饲喂基础日粮(不添加抗生素和益生菌);2)益生菌组(Lc Zhang)，饲喂基础日粮并添加益生菌(干酪乳杆菌Lactobacillus casei Zhang, IO7CFU/头/天)；试验全过程共28d。试验结束时每个重复随机选取一头仔猪采取肠道组织。
[0039]三、提取猪肠道组织总RNA[0040]将采集的猪肠道组织样品取约10mg，加入RNA样本保存液，然后按照RNA提取试剂盒说明提取总RNA。
[0041]四、反转录猪肠道RNA
[0042]利用反转录试剂盒将上述猪肠道总RNA反转录成cDNA。反转录方法为:0.5μ gtotal RNA> I μ I random hexamer primer、其余用 RNase Free H2O 补足至 12 μ I,在 65 °C 反应 5min ;将上述反应体系加入 4 μ 15 X Reaction Buffer、I μ I RiboLockRNase Inhibitor (20U/μ I)、2μ IlOmM dNTP Μ?χ>I μ I RevertAid M-MulLV ReverseTranscriptase (200U/ μ I)、其余用 RNase Free H2O 补足至 12 μ I,于 PCR 仪上 25°C 5min、42°C 60min、70°C 5min。
[0043]五、构建标准质粒
[0044]在20μ I反应体系中以前述的2μ I cDNA为模版，加入10 μ I荧光定量PCR预混液、5 μ mol/L前述正向引物、反向引物各0.5 μ 1、ddH20补足至20 μ I。PCR反应程序如下:500C 2min，95°C IOmin, 95°C 15sec，60°C lmin，扩增 30 个循环，72°C延伸 lOmin。PCR 反应结束后取5μ I产物用2%琼脂糖凝胶进行电泳，最后EB染料染色，凝胶图像分析仪上观察。
[0045]T-A克隆:PCR产物经纯化后，同pMD18-T载体按一定的比例混合，于16°C连接30min，然后该连接产物转化感受态细胞DH5ci菌。根据蓝白斑筛选挑取阳性克隆。然后用碱裂解法抽提质粒，通过PCR和酶切鉴定，如鉴定阳性，则送公司测序。
[0046]稀释标准质粒:测定上述测序正确的阳性质粒的核酸浓度，并计算出拷贝数/μ 1，然后将阳性质粒先稀释成IX IOltlc0Pies/μ 1，然后按10倍依次倍比稀释成1Χ109、I X 108、I X 107、I X 106、I X 105、I X 104、I X 103、I X IO2Copies/ μ I。
[0047]六、制定标准曲线
[0048]以上述稀释的标准质粒作为模版，利用SYBR Green I能嵌合到双链DNA，结合荧光定量PCR仪能够实时检测荧光强度的特点来制定标准曲线。荧光定量PCR反应体系如下:在20 μ I反应体系中加入稀释的标准质粒各2 μ 1、10 μ I Power SYBR? Green PCRMaster Mix, 5 μ mol/L正向引物、反向引物各0.5μ I, 2 μ I标准质粒或样本cDNA,补充DEPC处理水至20 μ I。在ΑΒΙ7500荧光定量PCR仪上进行扩增，扩增条件为50°C 2min,95°C 10min,95°C 15sec, 60°C lmin,扩增40个循环。最后进行熔解曲线分析以确定PCR反应的特异性。
[0049]第I对引物的标准品的熔解曲线图参见图1，标准品的荧光信号图参见图2，标准品的标准曲线图参见图3。
[0050]第2对引物的标准品的熔解曲线图参见图4，标准品的荧光信号图参见图5，标准品的标准曲线图参见图6。
[0051]第3对引物的标准品的熔解曲线图参见图7，标准品的荧光信号图参见图8，标准品的标准曲线图参见图9。
[0052]荧光定量PCR引物的常用标准为:R2值在0.99以上，扩增效率(Eff%)的适宜范围为95%-105%，且溶解曲线为单峰(B吲物特异性高)。上述引物中的第I对引物可以很好地满足以上标准，因此我们选取该对引物用以实际检测实验。
[0053]实施例2样本猪肠道组织中MUC12基因表达的检测
[0054]根据实施例1选取最佳引物，即第I对引物，进行猪肠道组织中MUC12基因表达的检测。猪肠道样品按前述的方法制备成cDNA，然后与内参基因GAPDH同时进行PCR反应，最后根据相对定量ΛΛ CT方法方法确定样本中MUC12基因相对表达量。
[0055]4头空白组和4头益生菌组仔猪回肠、结肠组织中MUC12转录本相对表达量(以GAPDH作为内参基因)的检测结果如下表:
【权利要求】
1.一种粘蛋白12转录本荧光定量PCR引物，其特征在于，正向引物具有SEQ ID N0.1所示的序列，反向引物具有SEQ ID N0.2所示的序列。
2.一种猪肠道组织中粘蛋白12转录本荧光定量PCR检测方法，其特征在于，以猪肠道组织cDNA为模板，用权利要求1所述的引物进行荧光定量PCR，根据相对定量ΛΛ Ct方法确定样品粘蛋白12的表达变化。
3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，每20μ I的荧光定量PCR反应体系如下:10μ I荧光定量PCR预混液，5ymol/L正向引物、反向引物各0.5μ 1，2μ I cDNA，水补足至20μ I。
4.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，PCR反应程序如下:50°C2min,95°C 10min,95°C 15sec,60°C lmin，扩增 40 个循环，最后 95°C 15sec,60°C lmin,95°C 30sec作熔解曲线。
5.含有权利要求1所述的引物的粘蛋白12转录本荧光定量PCR检测试剂盒。
【文档编号】C12Q1/68GK103740810SQ201310571586
【公开日】2014年4月23日 申请日期:2013年11月13日 优先权日:2013年11月13日
【发明者】苏华荔, 董晓丽, 王安如, 闫轶洁 申请人:北京大北农科技集团股份有限公司, 湖南大北农农业科技有限公司, 吉林大北农农牧科技有限责任公司