专利名称：碱性磷酸酶对存在于粘膜屏障的脂多糖解毒的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及医学领域并且特别涉及对脂多糖有解毒和中和作用的酶的用途。本发明也涉及药学领域，并且特别涉及碱性磷酸酶在制药中的用途。
背景技术：
脂多糖(LPS；也称为内毒素)存在于革兰氏阴性菌的细胞壁。当脂多糖存在于脊椎动物体内时，它会在多种细胞类型中激活先天的和细胞的免疫反应。细胞因子和趋化因子(chemokines)(比如TNF’s、各种白细胞介素、干扰素及其他因子)的产生将吸引并活化免疫系统细胞，这可能在一定条件下使脂多糖诱发的全身炎性反应综合征(SIRS)最终达到顶点。
脂多糖或内毒素对于大部分的哺乳动物来说是有毒的，并且与细菌的来源无关，所有的内毒素在动物宿主中产生同样范围的生物学作用。给实验动物注射活或死的革兰氏阴性细胞或纯化的脂多糖会导致广谱的非特异性病理生理反应，例如发烧、心动过速、呼吸急促(tachypneu)、体温过高或过低，白血球数变化、弥漫性血管内凝血、血压过低、器官功能异常，并且甚至可以导致休克和死亡。
注入小剂量的内毒素会使大部分哺乳动物产生预炎症反应，但是剂量反应的范围和其陡度随着物种变化显著和甚至是物种内可根据如脂多糖的耐受性显著不同。预炎性事件的顺序遵循一个规律模式(炎症级联反应)(1)潜伏期；(2)生理痛苦(腹泻、虚脱、休克)；如果有严重的败血性休克和多发性器官衰竭就可能导致(3)死亡。多久死亡会发生根据内毒素剂量、给药途径以及动物的种类而变化。
内毒素的生理效应主要通过脂多糖的脂质A部分来介导。由于脂质A是包埋在细菌细胞的外层膜中的，只有当它以可溶解的形式从增殖细胞中释放出来时，或者当细菌由于自溶作用，补体和膜攻击复合物(MAC)、被吞噬细胞摄食和杀死，或者用某种抗生素杀死而被溶解时，脂质A才能产生毒性作用。释放到血液中的脂多糖可以被许多血液成分包括血浆脂质和包括脂多糖结合蛋白的蛋白质中和到一定程度。脂多糖结合蛋白复合物与CD14、单核细胞和巨噬细胞上的Toll状受体以及内皮细胞上的其他受体相互作用。在单核细胞和巨噬细胞内，当它们与脂多糖发生相互作用时，触发了三类事件第一、产生细胞因子，包括IL-1、IL-6、IL-8、肿瘤坏死因子(TNF)、血小板活化因子。它们依次促进前列腺素和白细胞三烯的产生。这些都是炎症和与内毒素毒血症同时发生的败血性休克的强大介质。脂多糖活化巨噬细胞以提高噬菌作用和细胞毒性。巨噬细胞被激活产生并释放溶酶体酶、IL-1(“内源性热原”)，以及肿瘤坏死因子(TNFα)，也产生其他的细胞因子和介质。
第二、补体级联反应的激活，C3a和C5a促使组胺释放(导致血管舒张)并且影响中性粒细胞趋化现象和蓄积作用。最终导致炎症。
最后，凝血级联反应的激活。哈格曼因子(血液凝结因子XII)的初始激活能够活化一些体液系统导致凝血凝血级联反应导致凝固坏死、血栓形成、急性弥漫性血管内凝血，其消耗血小板和各种凝结因子，导致内部出血以及补体旁路途径的激活(如上所述，其导致炎症)。血纤维蛋白溶酶的激活导致了纤维蛋白溶解、出血并且激肽活化释放出导致低血压的缓激肽以及其他血管活性肽。净结果是诱导炎症、血管内凝血、出血以及休克。
脂多糖也充当B细胞的促细胞分裂剂来促进B细胞的多系分化和增殖以及免疫球蛋白的分泌、尤其是免疫球蛋白G和免疫球蛋白M。
脂多糖的生理活性主要通过脂多糖中的脂质A成分进行调节。脂质A是一种极有效的生物反应调节剂，能刺激哺乳动物的免疫系统。在革兰氏阴性菌导致传染病期间，从增殖细胞释放出来的内毒素，或部分内毒素对动物具有相似的影响，并且是造成突发疾病症状和病理的主要因素。脂质A的一级结构已经被说明并且脂质A也已经被化学合成。其生物活性显示与一种特殊构象有关，所述的特殊构象由氨基葡萄糖二糖，PO4基团，酰基链，以及脂多糖分子的含有KDO的内核决定。
先前已公开碱性磷酸酶(AP)是LPS(内毒素)脱磷酸作用中的一种关键酶，其不论在体内还是体外的生理条件下均是对LPS进行解毒或中和的天然反应(美国专利6,290,952，Poelstra等.，Am J Pathol.1997 Oct；151(4)1163-9)。
对AP酶活性的报道包括它对普通外源性底物作用时的最适pH值非常高以及将其定位为胞外酶。内毒素是包含一些磷酸基团的分子，主要存在于胞外空间。AP能在生理pH水平通过从脂多糖(LPS)有毒的脂质A部分中脱掉磷酸基团而使细菌产物去磷酸。由于脂质A这部分中的磷酸残基决定该分子的毒性，使用患有败血症的小鼠模型体内AP抑制物左旋咪唑的作用证实了AP对含有磷酸基团的脂多糖(LPS)的特异性(Poelstra et al.，1997)。这个结果证实通过通过左旋咪唑抑制内源性AP显著降低了经腹腔注射大肠杆菌细菌的小鼠的存活率；然而该药没有影响接受亚致死量的革兰氏阳性细菌金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)的小鼠的存活率，证明了该酶在宿主的防御系统中的决定性作用。左旋咪唑在革兰氏阴性菌感染期间的作用和AP在许多器官中作为胞外酶的位置以及当发生炎症反应或胆管梗阻时酶活性的诱导作用都与这样的保护作用相一致。
在人体内，最主要的LPS的来源是生活在人体消化道和肠胃道(GI)中的革兰氏阴性微生物。消化系统中的细菌数远远大于人体皮肤表面和其他部位的细菌数，这使得肠胃道和肠胃粘膜成为LPS进入人体循环的最主要路径。平均一个成年人肠道中携带约100万亿个细菌，它们大多数集中在结肠处，约占人体重的1-1.5kg。在消化系统中已找到超过400种的细菌。它们既包括有益(共生)菌群，又包括一些潜在有害(致病)种属，它们之间不断竞争以维持肠菌群的平衡状态。
粘膜的表层，特别是(但并不是局限于)肠道粘膜，都曝露在如此多种类的共生的或潜在致病的细菌中，这其中还包括了许多产内毒素/LPS革兰氏阴性菌，革兰氏阴性菌如大肠杆菌属(E.coli，)、沙门氏菌属(Salmonella)、志贺氏菌属(Shigella)、假单胞菌属(Pseudomonas)、奈瑟氏菌属(Neisseria)、嗜血杆菌属(Haemophilus)、螺杆菌属(Helicobater)、衣原体属(Chlamydia)和其他的致病原。肠道上皮具有非常重要的作用，因为它形成了一个动态屏障，既可以调控营养成分和水分的吸收，同时又可以限制从肠腔摄入微生物和其他有害物质比如LPS。
现在已经证实，LPS的主要组分从肠腔穿过粘膜内层进入脊椎动物体内循环是通过乳糜微粒介导的(Harris et al.，1998，2000，2002)。有报道指出，与脂质的摄入以及能携带LPS的乳糜微粒进入循环相一致的是，源于肠胃道的淋巴中的AP也有明显地增加(Nauli etal.，2002)。穿过肠胃屏障的LPS的流入量通常会随富含饱和脂肪的饮食一起增加。LPS将它的脂质A的酰基链插入到脂蛋白磷脂中。因此LPS通过与乳糜微粒共同迁移而通过肠道屏障，它们主要在小肠和回肠中被吸收(Harris et al.，2002)。在摄食了富含脂肪的食物后，可以检测到淋巴中糖基-磷脂酰基-肌醇(GPI)锚定的复合到脂蛋白的AP也有明显增高(Nauli etal.，2003)。
血清中AP水平的生理作用及其机理仍不清楚，但是现有的研究表明它对LPS有解毒作用。AP和LPS都在乳糜微粒富集成分中的共存暗示了AP对来自于肠道的LPS以紧密相邻处进行脱磷酸化作用。解毒作用可以发生在肠腔内或在进入肝脏的途中或到达肝脏，特别是可以从循环中清除乳糜微粒的Kuppfer细胞和肝细胞。
血清中AP水平升高常与肝损伤联系在一起。一旦有内毒素损伤，循环的AP会重新定向至肝细胞，因此通过受体介导的吸收(asialo-糖蛋白受体)开始减少循环中的AP水平(Bentalaet al.，2002)。肝细胞也能快速从具有(5-10分钟)的半衰期的循环中移除负载LPS的乳糜微粒(Harris et al.，2002)。接下来，LPS通过胆汁分泌被排出，因此防止Kupffer细胞成为循环LPS的主要靶细胞被激活(Harris，2002)。Bentala等在2002年也提出了在LPS损伤的动物模型试验中Kupffer细胞积聚了AP。这也许意味着在正常条件下Kupffer细胞不会被激活，因为LPS(脂质A部分)或它的衍生物MPLS(MPLA，脂质A的衍生物)通过脂蛋白受体最初出现在肝细胞，然后通过胆汁分泌而被排出。然而，在过量LPS的条件下，Kupffer细胞通过TLR-4(LPS)受体被激活。
大多数的动物具有AP和一些其他的物质(entities)以抵抗(细菌)损伤，可以是局部的或是全身性的，可诱导的或是可获得的具有预防/监视功能。在其他个体中被激活的中性白细胞或巨噬细胞表达大量的炎性介质来抵消损伤。这类成分包括但不局限于此LPS结合蛋白(LBP)、CD14、Apo-E、VLDL、HDL、白蛋白、免疫球蛋白和AP都已经报道有这种功能。然而，当这样的损伤没有克服时，例如在严重的革兰氏阴性的或阳性的损伤的情况下，会导致炎性介质引发全身性炎症反应综合征(SIRS)。
有一种假说认为，AP对LPS进行催化作用时的结果是被消耗掉(Poelstra et al.，1997)。这就暗示了其后正常水平是需通过一种控制机理被恢复的。在患败血症的病人体内，会观察到血清中AP先升高，再降低(Manintveld and Poelstre，欧洲专利申请989626940)，并且在和LPS的相互作用时，循环中的AP从循环中被清除(Bentala et al.，2002)。因此，其后的AP水平的升高可能是应答AP减少时的一种反馈机制。至今LPS/AP反应的机理仍没有被阐明。
当炎症进展时，可检测到血清中AP酶(暂时性的)升高。在本发明中，AP的这种增加被认为是先天免疫系统对LPS损伤的天然反应以应付这些损伤并恢复正常平衡。血浆AP水平升高是为了应答LPS损伤AP从肝细胞大量流出的结果。现已观察到LPS可以诱导磷酸酶-D活性(Locati et al.，2001)，而磷酸酶-D已经被报道可以作用于GPI锚定的蛋白，其中就包括AP(Deng et al.，1996)和如CD14，因此可以有效地使蛋白进入循环(Zhang F et al.，2001，LocatiM.et al.，2001)。
循环中的血浆AP-主要是不能锚定的肝型AP(Ahn et.al.，2001)可能是已经在血浆膜表面发挥了它的LPS解毒活性后，从肝细胞膜释放到循环中，然后通过如asialo-糖蛋白路径从循环中被清除。
AP主要在膜附近，即所谓的“脂筏”，发挥它对LPS的催化活性，已有报道“脂筏”(drm或抗去垢剂膜成分)是AP停留的位置。某些出版物支持AP在膜表面具有催化活性，既可以以组织水平存在又可以是被释放至循化中，比如与肝血浆膜成分(LPMF)一起循环(e.g.deng et al.，1996)。在患慢性炎症患者中发现的高水平的AP有可能是对来自肠道的LPS的流入未达到最佳解毒作用而引起的，LPS经常在肝AP移动之前在病理条件下大大地升高。
在发达国家，炎症类疾病的治疗在总医疗费用中占有的相当的比重，这些炎症类疾病发生率不断上升取决于一些关键因素，例如人口的年龄的老化和免疫系统被抑制的病人数量的大量增加，该免疫系统被抑制是药物和治疗大多数的疾病例如心脏病、自体免疫紊乱和过敏、器官移植、癌症的化疗和放疗、以及AIDS等传染病的结果。在一定程度上，这些疾病都和细菌LPS的流入相关。根据受治者的医疗条件，LPS的流入往往会升高，由于功能失调或先天免疫系统失衡导致了炎症的发展而先天免疫系统构成抵御比如微生物损伤的第一道防线，尤其是来自于LPS/内毒素产生的细菌。
本发明的目的在于提供新的方法和组合物，用于在脂多糖穿过粘膜层并且进入循环之前在体腔粘膜组织上对脂多糖进行原位解毒、中和或络合，其中所述的粘膜层和循环是脂多糖引起中毒效应和/或炎症反应的地方。
发明内容
定义内毒素是革兰氏阴性菌细胞壁外层膜的一部分。无论生物体是否是病原体，内毒素总是与革兰氏阴性菌结合在一起的。尽管术语“内毒素”偶尔被用来指代一些胞联细菌毒素，其更常用于指代脂多糖或与革兰氏阴性菌的外膜结合的脂多糖复合体，所述的革兰氏阴性菌如埃希氏杆菌属(E.coli)，沙门氏菌属(Salmonella)，志贺氏菌属(Shigella)，假单胞菌属(Ps.aeruginosa)，奈瑟氏菌属(N.meningitidis)，嗜血杆菌属(H.influenzae)，衣原体属(Chl.pneumoniae)，螺杆菌属(H.pylori)以及其他的主要病原体。
脂多糖是复杂的两性分子，其单体的分子量约为10kDa，其化学成分在细菌种属之间变化很大。脂多糖由三个组分或三个区域组成，脂质A，R多聚糖和O多聚糖。脂质A包含疏水的LPS膜锚定区域。脂质A含有磷酸化的N-乙酰葡糖胺(NAG)二聚体，其中含有6或7个脂肪酸(FA)。其核心(R)抗原或R多聚糖连接在一个NAG的6位上。R抗原包括一种短链糖。在核心多糖中通常存在二种独特的糖，庚糖和2-酮-3-deoxyoctonoicacid(KDO)。KDO总是独特地存在于脂多糖中，因此已经被作为一种检测脂多糖(内毒素)的指示剂。
虽然具有微小的变化，核心多糖和脂质A对于细菌属的所有膜都是共有的(例如沙门氏菌(Salmonella)，但是它与其他属的革兰氏阴性菌的结构有区别。沙门氏菌、志贺氏菌属和埃希氏杆菌属有类似的而不相同的核心结构。
内毒素的生物活性与脂多糖相关联(LPS)。其毒性与脂质成分(脂质A)相联系而免疫原性与多聚糖成分相联系。革兰氏阴性菌的细胞壁抗原(O抗原)就是脂多糖的成分。脂多糖可以在动物体内引发各种各样的炎症反应。因为它通过可选择的(裂解素(properdin)途径活化补体，它常常是革兰氏阴性菌传染疾病的病理学的一部分。
鲎属分析(LAL)是现有技术中常用的测量脂多糖浓度和毒性的生物分析方法。该分析方法建立在一种具有敏锐的、敏感的、原始防御体系的古代物种鲎、鲎属(Limuluspolyphemus)的基础上。基于此系统的分析可以通过发光体或荧光底物裂解后的颜色变化来测量。只需要最小的设备，LAL就可以快速测量低于微微克量的这些微生物产物，并可以检测活体、死体和不可培养的有机体。鲎属的血细胞或鲎的阿米巴状细胞，组成一道原始的先天的免疫防御，它们是与微生物细胞外层细胞壁结构结合起来而引起血液凝固反应。可溶性的脂多糖，和其他微生物的细胞壁成分，例如酵母和真菌里的β-葡聚糖已经发现可以使鲎血凝结。这个凝结反应现已探知是酶级联反应，其成分存在于阿米巴状细胞内部的颗粒中。通过一种无菌条件下无内毒素(endotoxin-free)方法收集血细胞产生的阿米巴状细胞的溶解产物并可作为一种商业产物获得(LAL，Charles River Endosafe，CharlestonS.C.)，现已作为一种通过AP酶和包含AP源的组合物来检验脂多糖和解毒脂多糖的分析方法。
碱性磷酸酶(AP)按照IUBMB酶命名法为EC 3.1.3.1，常用名为碱性磷酸酶(AP)，它是催化磷酸单酯+H2O＝酒精+磷酸的反应的酶。AP其他的名称有碱性磷酸单酯酶；磷酸单酯酶；甘油磷酸酶；碱性磷酸水解酶；碱性苯基磷酸酶；正磷酸盐单酯磷酸水解酶(碱性最佳)。AP的系统名称是磷酸盐单酯磷酸水解酶(碱性最佳的)。
AP是一种作用范围比较宽的专一性酶，它也能催化转磷酸作用。在人及其他哺乳动物中，至少已知四种不同但和碱性磷酸酶有关的酶。它们是肠的、胎盘的、类胎盘的、和肝/骨/肾(或非特异性组织的)碱性磷酸酶。前三个都位于2号染色体上，而非特异性组织形式位于1号染色体上。AP类酶准确的生理机能还不知道，但是AP仿佛与很多生理学过程有关，其中就有对LPS的解毒作用，此作用通过对LPS中决定毒性的脂质A部分进行脱磷酸而实现。对本发明来说，术语碱性磷酸酶可能包含任何已通过鲎属分析或另一中生物分析方法确定的对LPS显示解毒作用的酶。测定AP酶或包含AP的组合物或制备物的活性可通过体外商业上可获得的LPS(例如购自Sigma的脂多糖(LPS)，产品目录号码No.L-8274)的解毒作用，随后在进行AP治疗前后进行标准鲎属分析(LAL)而测定。可选择的，通过AP活性脂多糖毒性的减少可以通过Beumer et al.在2003年所描述的生物分析方法进行定量。
粘膜是分泌粘液的膜内层(lining)，它是体内所有体腔或通道与外界的联系。粘膜是一种湿润的组织，它的作用是划界许多器官(比如肠)和体腔(例如鼻、口、肺、阴道、胆管、食管)和分泌粘液(一种浓稠液体)。粘膜或粘膜层，是一种保护体腔抵抗环境条件、病原体和有毒物质的组织，它通常是充满分泌物(比如肠、肺、鼻、口和阴道的分泌物)的湿润组织。
发明详述本发明目的在于提供新方法和组合物用于在体腔粘膜组织对脂多糖进行原位解毒。在体内粘膜表面对LPS进行原位解毒的第一个目标就是防止或减少再这些表面的局部炎症反应。此外，经这样解毒的脂多糖不能再穿过粘膜层，并因此不能进入它发挥其毒性作用和/或引起进一步的局部和/或系统的炎症反应的循环系统。解毒作用包括AP对LPS的中和或络合作用，其通过紧密结合形成无毒成分。这些方法包含使用碱性磷酸酶源，这是所知的解除LPS毒性的有效手段。AP的来源可以是任何AP酶，或者是任何包含AP酶的组合物和任何在本发明上下文中提到的能够产生功能性AP酶的方法，比如用DNA或RNA核酸编码AP酶。核酸编码AP可以是嵌入适当的载体比如质粒、中间噬菌体、噬菌体、(逆)病毒、转座子，基因治疗载体及其他能够诱导或能产生AP的载体。同时天然的或重组的微生物，比如细菌、真菌、原生动物和酵母可以在本发明的中用作AP的来源。
在第一个实施例中，本发明提供一种预防或降低哺乳动物体腔粘膜衬层的LPS毒性的方法，该方法包括将AP源在粘膜层给药的步骤。对于治疗方法是不能被授予专利权的某些法律，本发明同样涉及如上定义的AP的用途，或者是如上定义的包含一种AP源的组合物的用途。AP源可用于制造一种药剂，这种药剂可以在粘膜层释出AP以预防或减少有毒的脂多糖流入并穿过哺乳动物体腔粘膜衬层。在另外的实施例中，本发明提供一种预防或降低有毒的脂多糖流入哺乳动物体腔的粘膜衬层的方法，该方法包括将AP源在粘膜层给药的步骤。
特别是，上述将AP源在体腔粘膜层给药的方法适合于治疗或预防(profylaxis)脂多糖介导或加剧的疾病，虽然此方法还可以方便地用于健康的对象作为预防治疗，目的在于预防那些脂多糖诱导的毒性和/或脂多糖诱导或加剧的疾病。根据本发明，在体腔和粘膜层采用AP给药来降低有毒的LPS水平的有益效果将会产生普遍性的健康促进效果而不论接受治疗的对象的医学状况如何。此健康促进效果可以通过其后的脂多糖流入并穿过粘膜层的量的减少而进一步扩大。脂多糖介导或诱发的疾病可以是任何起因于脂多糖毒性的疾病、症状或一组症状。脂多糖加剧的疾病可以是任何疾病或症状，它并不是直接地由脂多糖或脂多糖毒性导致的，也可是症状和临床特征可能是由脂多糖加重的疾病，以及患这种疾病的患者的临床状态被脂多糖和脂多糖毒性所恶化。
优选，此方法的目的在于治疗脂多糖介导的或加剧的疾病，这些疾病主要包括下列的组肠炎、败血病/败血病休克、全身性炎症反应综合征(SIRS)、脑膜炎球菌血症、外伤/失血性休克、烧伤、外科心血管手术/心肺分流术(cardiopulmonary bypass)、肝手术/移植、肝病、胰腺炎、(坏死性)小肠结肠炎、牙周疾病、肺炎、囊纤维化、哮喘、冠心病、充血性心力衰竭、肾病、溶血性尿毒症综合征、肾透析、自身免疫疾病、癌症、阿耳茨海默氏病、风湿性关节炎、狼疮、全身性红斑狼疮。
在患有炎症性肠疾病的病人特别是诊断带有克罗恩氏病和溃疡性结肠炎的病人中已经发现循环的内毒素。它的存在是肠粘膜损伤和脂多糖流入增加或肠易位的结果，并引起或加剧肠部炎症反应。肠的细菌性易位和脂多糖肠易位在肝硬化、酗酒、阻塞性黄疸及其他肝病的情况引起的急性胰炎和肝疾病中也观察到。内毒素也和演变中的牙周病有关系，在此它穿透齿龈的上皮/粘膜，继而引起局部性炎症反应。在优选的实施例中，该方法包括将一种AP源口服给药以降低脂多糖的毒性或在脂多糖穿过粘膜通道时的毒性。
优选的给药方式包括使用含AP源的药用组合物，按照每天一定剂量持续定时服用，以降低肠胃道内有毒的脂多糖水平。优选的药用组合物包含一层肠溶衣以保护AP免遭胃液(pH1.0-2.5)的不利影响和保证AP在肠道粘膜的有效释放。更有选的药用组合物是在肠衣内部包含的AP源。
肠溶衣可以阻止活性化合物从口服摄取的药剂形式中，释放出来。取决于组成和/或厚度，肠溶衣可以在开始分解前所需的一段时间抵抗胃酸，并且允许AP(药物)在胃的下半部分或小肠的上半部分进行缓释。一些肠溶衣的例子在美国专利U.S.Pat.No.5,225,202已被公开(通过参考和并本发明)。肠溶衣的例子包含蜂蜡和单硬脂酸甘油酯；蜂蜡、虫胶和纤维素，选择性地带有中性的聚甲基丙烯酸酯共聚物；甲基丙烯酸和甲基丙烯酸甲酯的共聚物或中性的包含金属硬脂酸盐的聚甲基丙烯酸酯的共聚物(若参考肠溶衣请看U.S.Pat.Nos.4,728,512，4,794,001，3,835,221，2,809,918，5,225,202,5,026,560，4,524,060，5,536,507)。大多数的肠溶衣聚合物在pH值5.5及以上开始变成可溶的，在pH值高于6.5时有最大溶解率。肠溶衣还可包含包底衣和外敷层，例如对于有些药用组合物就是为了在胃肠道下部特定释放，例如在结肠(pH值6.4到7.0、回肠pH值6.6)，而与肠的上部pH值相反的是，小肠的十二指肠的pH值范围是7.7-8(在加入了胰液和胆汁之后)。利用肠中的pH值差异可以开发出靶向肠的特定区域的肠包衣的AP组合物。同时也允许选择特定的AP酶，它可以在肠内特定的pH值下最具有活性。比如CLAP(小牛肠的AP)和人胎盘(HPLAP)AP在小肠十二指肠、小肠中段和回肠的碱性pH值8.2下最具有活性，然而牛奶中的AP和骨骼/肝/肾或组织非特异性的AP(TSN AP)在中性pH值下最具有活性从而比较适合结肠的治疗(pH值7.4)。
根据本发明，最优选的粘膜组织是体腔肠道的粘膜组织衬层。口服给药的AP在胃肠道的粘膜组织释出，肠胃道包含食管、胃、小肠或肠、(十二指肠、小肠中段、回肠)和大肠或结肠(盲肠、升结肠、横结肠、降结肠、乙状结肠、直肠和肛门)。在本发明范围内，口腔，胆汁和胰腺的注入口、注入管的粘膜组织衬层也属于肠道的一部分，也可以按照本发明的方法进行治疗。
根据本发明的包含AP源的组合物特别适合于口服给药以预防治疗、降低、治疗或减轻胃肠道炎性疾病。胃肠道炎性疾病可能由流入的LPS诱导及/或显著加剧。通过AP源的给药解除LPS的脂质A的毒性，可以降低肠腔中有毒的LPS的数量，导致患者循环系统中有毒的脂多糖的全身性流入有相应下降。在最佳实施例中，口服给药的AP源特别适于预防或治疗下列胃肠道炎性疾病克罗恩氏病、结肠炎、(坏死性)小肠结肠炎、溃疡性结肠炎、肝胆管病、乙型肝炎、丙型肝炎、肝硬化、肝纤维化、胆管发炎、胆汁阻塞、胰腺炎、急性胰炎、腹膜炎和牙周病。
在本发明的另一个实施例中，AP源可以给患有胃肠道粘膜通透性增加的患者口服给药。胃肠道粘膜通透性的增加通常是肠灌注液减少或局部缺血的结果。局部缺血，血流供氧缺乏，可能是起因于心力衰竭、创伤、外伤或外科手术。肠局部缺血导致粘膜出现故障和有毒的脂多糖从肠的流入或易位增加，最终导致局部的和全身性的毒性和炎症反应。这些毒性和炎症性的反应又可以进一步提高粘膜的通透性，导致恶性循环。胃肠道粘膜通透性的增加可能是炎症性的肠疾病或其他的胃肠道病理情况的结果。根据本发明，AP源的口服给药通过在肠腔对脂多糖进行解毒将会显著地降低或消除有毒的脂多糖的流入的增加。AP的外源给药可以中断脂多糖穿过粘膜的流入、发炎和脂多糖流入提高而导致粘膜的通透性提高这种恶性循环。肠部灌注液减少或局部缺血和伴随的脂多糖流入增加可以由下列几组疾病或情况观察到烧伤、外伤及/或事故引起的创口、枪击或刀伤、外科手术、和特别是带有心肺分流术的外科手术。同时心脏功能故障，比如先天性心脏病、充血性心力衰竭、冠心病和缺血性心脏病可导致肠缺血和脂多糖流入增加。本发明的一个优选实施例是治疗遭受这些疾病和情况的患者，用包含AP源的组合物是定时定量口服给药，以预防或降低脂多糖穿过对脂多糖通透性增加的肠粘膜的流入。
另一个实施例中，本发明的目的是在呼吸道粘膜内层提供AP源。呼吸道是另一个具有粘膜内层的体腔，该粘膜内层暴露于脂多糖的毒性作用。游离的或与吸入细菌结合的LPS，通过正常呼吸，吸入比如灰尘粒子，可以进入呼吸道支气管的和肺的粘膜，或呼吸道和粘膜组织感染了革兰氏阴性细菌。此外，烟草众所周知是脂多糖丰富的来源，不论是被动的或主动的抽烟，都可以进一步地显著地增加支气管的和肺的粘膜中脂多糖的负担。在正常情况下脂多糖在呼吸道被局部的粘膜免疫防御系统解毒。所以，在另一个优选实施例中，本发明涉及通过吸入将AP源在支气管的和肺的粘膜给药，以防止或降低脂多糖穿过呼吸道粘膜而流入，因为在那里对脂多糖的正常的防御反应出现故障。本发明也提供适合在支气管和肺的粘膜释放出AP的组合物。这些组合物优选给药以预防或治疗呼吸道的炎症性疾病。在一个最优实施例中，将本发明的AP源的肺部给药被用于治疗或预防选自包括下列组的疾病肺炎、肺感染、哮喘、CARA、囊肿性纤维化、支气管炎和肺气肿。本发明也提供喷雾装置，装载了含AP源的组合物和任选的各种赋形剂，例如发射剂，载体，喷雾剂(nebuliser)及/或扩散剂等，适合在肺和支气管粘膜对AP进行给药。喷雾装置、吸入器和喷雾器已经是药物制剂技术中众所周知的和并对于本领域技术人员是显而易见的，可参考Remmington′s Pharmaceutical Sciences，Mace Publishing Company，Philadelphia PA，17th ed.1985.
仍然在另一个实施例中，本发明目的在于在体腔粘膜层内层的AP源的局部给药。在一个优选实施例中，体腔是鼻腔、口腔、阴道或直肠。在体腔粘膜层内层的AP源的局部给药优选用于治疗局部的或全身性炎症性的疾病，并且特别适用于治疗或预防鼻的、阴道的、口的或直肠的腔道感染、性传播疾病和传染病、尿路感染、膀胱传染和牙周病。
本发明还提供了包含AP源的组合物，其中包括含有AP源的药物和营养性组合物。这种组合物可任选包含药学上可接受的赋形剂、稳定剂、活化剂、载体、渗透剂、推进剂、消毒剂、稀释剂和防腐剂。合适的赋形剂是药物制剂领域内众所周知的，可以容易地由本领域技术人员发现并使用，可参考Remmington′s Pharmaceutical Sciences，Mace PublishingCompany，Philadelphia PA，17th ed.1985。在优选的实施例中包含AP源的组合物适合于口服给药和包含一层肠溶衣以保护AP免遭胃液和低的pH值的副作用。肠溶衣和控释剂型本领域内众所周知的(参考如上所述)。现有技术中的肠溶衣组合物可以包括混合有活性成分比如AP和其他赋形剂的水溶性的肠溶衣聚合物的溶液，其可以在水溶液中分散，并随后可以干燥和/或制丸。所形成的肠溶衣可以抵抗储存期间空气水分和氧气以及摄取后胃液和低的pH值对AP的侵蚀，但在处于肠道下部的在碱性情况下会很容易地分解。
本发明的在粘膜组织释出AP对LPS进行解毒的包含AP的组合物优选包含真核生物的AP、更优选的是哺乳动物的AP，可以是组织非特异性的AP的类型、比如肝、骨骼或肾类，或者是组织特异的比如胎盘的AP和肠的AP。最优选的哺乳动物AP是人或牛的AP。
在本发明的优选实施例中，AP源优选是从奶中提取出或分离出的AP，特别是牛奶。奶可以是从已经经过育种或基因改良以生产出比野生型动物奶中含AP水平大大提高的动物中获得的。从奶中富集AP组分的制备技术是本领域所知的。例如乳脂球膜富集的或得到的组分是优选的AP富集的牛乳组分，并可以通过传统的全脂牛乳脱脂常规地获得。从奶中分离出的AP可被用在药用组合物和食品组合物或营养性制剂中。
在本发明的优选实施例中，用于在胃肠道粘膜对AP口服给药的包含AP的组合物可以是富集AP的食品或营养性制剂。在一实施例中，这种食品可以植物，水果或蔬菜，任选的经基因改良以包含高水平的AP。在另一个实施例中，包含AP的食品或营养性制剂是一种乳制品。根据本发明，特别是包含非巴氏杀菌奶或它的组分的制剂和组合物，优选是牛奶，它们包含高水平的AP并且特别适合于作为AP源口服给药。
本发明也涉及一种制备AP富集乳制品的方法，特别是牛奶、牛奶组分或奶制品。此方法包括对原料奶进行分馏，优选用牛奶，对不包含AP或不富含AP的组分的进行巴氏灭菌，和用非巴氏灭菌的富含AP成分重新调和(reformulating)所述的经巴氏灭菌的不包含AP或不富含AP的组分，以获得不易腐败的AP富集乳制品。所述的非巴氏杀菌的AP富集的组分可以通过其它方式消毒，例如，但不是限于，紫外线照射、X或Y射线照射、过滤、加压、渗透压、化学物质或抗生素，确保A P酶基本保留活性并且牛奶组分是基本无菌的。这种乳制品可以用于组合物或直接给遭受或将要遭受脂多糖介导或加剧的疾病及/或发炎的患者用药。然而，AP富集的乳制品也可以作为药物或营养性制剂产品提供给健康对象，以减少胃肠道中有毒的脂多糖和降低脂多糖穿过胃肠粘膜的流入量。
实施例实施例1本发明，特别是碱性磷酸酶的效果，制备以及组成，和碱性磷酸酶(AP)的不同给药方式可以针对本领域已知的肠部炎性疾病，在各种动物模型中进行验证。动物模型模拟的人肠炎性疾病(IBD)包括抗原诱发的结肠炎和由微生物诱发的结肠炎；结肠炎的其他可诱导的形式，化学物质(例如Montfrans等提出的三硝基苯磺酸(TNBS)，2002年)、免疫学的、物理的和遗传学的结肠炎模型(转基因的和敲除模型，参见如SCID-小鼠，Davis等，2003年，IL-10，KO-小鼠，Rennick等，2000年，SAMP1/Yit小鼠，Kosiewicz等，2001年以及Strober等，2001年)；继承转移模型和自发性的结肠炎模型(Kosiewicz，M.M.等，2001年)。
以化学方法诱发的葡聚糖硫酸钠(DSS)结肠炎模型最初是被Okayasu等描述的；《肠胃病学》，1990年98，694-702，并且其是一种人类溃疡性结肠炎的模型。该模型包括小鼠的急性的和慢性的溃疡性结肠炎，是通过在小鼠的饮用水中加入3-10％的DSS引起的。形态学变化以及肠内微生物群落方面的变化与溃疡性结肠炎的临床案例中见到的相似。由于DSS在上皮细胞上的毒性作用以及固有层细胞的噬菌作用使得结肠损害加重，导致TNF-α和IFN-γ的产生。
急性DSS结肠炎的试验设计将DSS(MW40.000，购自ICN chemicals)溶解在酸化饮用水中，浓度为5％(w/v)，并不限量喂给雌性balb/c小鼠(Harlan)。溶液每天更新。处理7天后，宰杀已处理的和对照小鼠并且进行肠分析。将结肠切下来(从盲肠到直肠)并且记录它的长度。将大约一半的结肠冻结在液氮中并且冰冻部分用于形态学研究(HE着色)。同时将一小部分的脾脏和肝脏用液氮快速冻结用于免疫组织化学方面的研究。一小部分结肠用于制备细胞因子测定中的组织匀浆。将小段的结肠在不存在或存在脂多糖的情况下在RPMI/10％FCS中培养24小时。上清液中的细胞因子分泌物(TNFα；IL-1β；IFNγ)用特异性酶联免疫吸附(ELISA)试验测定。切割并压榨脾脏和肠系膜淋巴结制备单细胞悬浮液。切割结肠附近的4个肠派伊尔结细胞，并且用胶原酶制备单细胞悬浮液。细胞用流动细胞计数法表征。脾细胞在不存在或存在脂多糖(LPS)或Con A的情况下在RPMI/10％FCS中培养24小时。上清液中的细胞因子分泌物(TNFα；IL-1β；IFNγ)用特异性酶联免疫吸附(ELISA)试验测定。收集排泄物(feaces)并在McConkey琼脂平板上进行培养用于肠杆菌量的测定。将排泄物培养在血琼脂平板中用于总需氧菌量的测定。
结果如上所述的试验被用来测定含有碱性磷酸酶(AP)的组合物的体内效果。观察到了细胞因子分泌的减少；一旦将牛乳的碱性磷酸酶富集的乳脂球膜组分口服给药后，在发炎肠中测定到了T NF-α，Il-1β and IFNγ水平的降低。
实施例2在TNBS或者DSS处理以后，经碱性磷酸酶处理的小鼠发展成严重结肠炎较少原料与方法试验设计进行三个独立的试验。用标号42、八周大的野生型C57BL/6小鼠进行第一个DSS试验，并且用标号20、八周大的野生型BALB/C小鼠进行TNBS试验，它们分别来自Charles River和Harlan Nederland(Horst，荷兰)。用来自Charles River Nederland标号72、八周大的C57BL/6小鼠进行第2个DSS试验。在试验期间，小鼠在标准条件下饲养于室内，并且它们可以自由摄取水和食物。
在用C57BL/6小鼠进行的第一个试验中，通过给小鼠的饮用水中加入1.5％(n＝18)或者2.5％(n＝20)葡聚糖硫酸钠(DSS)持续一周，诱发了结肠炎。
在BALB/C小鼠体内，通过在第0天和第7天用位于肛门三厘米的乙烯基导管直肠给入溶于PBS的40％乙醇的1mg2，4，6三硝基苯磺酸(TNBS)(Sigma化学品公司，圣路易斯，密苏里州，美国)诱发了结肠炎。在灌注之前，小鼠利用异氟烷(1-氯-2，2，2-三氟乙烯基-异氟烷二氟甲烯醚)(Abbott实验室有限公司，Queen区，Kent，英国)麻醉并且在灌注之后，使小鼠保持垂直30秒。第2次灌注TNBS后48小时宰杀小鼠。
在诱导结肠炎期间，十只BALB/CC小鼠和二十只C57BL/6小鼠每天口服一次溶解在100μl、100mM的三羟甲基氨基甲烷(Tris)(pH值7,8)中的100个单位的碱性磷酸酶；其余小鼠仅服用100μl、100mM的三羟甲基氨基甲烷(Tris)(pH值7,8)。四只C57BL/6小鼠被当作参考对照它们没有结肠炎也没有经过处理。
对于第2个DSS试验，C57BL/6小鼠(n＝48)的结肠炎是通过持续5天在饮用水中加入2％DSS而诱发的。这些小鼠中的24只从第5天到第14天，每天一次摄入溶在250μl、100mM的三羟甲基氨基甲烷(Tris)(pH值7，8)中的100个单位的碱性磷酸酶，而其他的24只小鼠只摄入溶剂。把仅摄入常规饮用水和溶剂的那24只小鼠作为参考对照。用这样的安排来探究一旦患上结肠炎时，碱性磷酸酶作为治疗药物的用途。
在所有的试验中都应当每天纪录小鼠的体重和体温。宰杀小鼠之后，从小鼠体内获得尾部的淋巴结(CLN)和结肠。经过中线切割，结肠被切下并被纵向切开。在除去了粪便物质以后，测量结肠的重量，并把其当作是与肠增厚有关的疾病的指标。结肠被分为两部分，其中之一用于组织学分析而另一个用于细胞因子的检测。
组织学分析纵向分割的结肠按照常规组织学手段被固定在包埋于石蜡中的4％甲醛中。采自每个结肠样品的三个横向的切片(5um)，用苏木精-曙红染色并用光学显微技术检查。以一种盲目的方式，通过估算1)所涉及面积的百分比，2)小囊数量，3)浮肿，4)纤维化，5)腐蚀/溃疡，6)陷凹损失以及7)粒性白细胞浸润和8)有最大分数为26的单核细胞来评价结肠的炎症。
给所涉及面积的百分比和陷凹损失按照等级范围从0至4打分，具体如下0，正常；1，少于10％；2，10％；3，10-50％；4，大于50％。小囊总额的计算和计分如下0分，0-1个小囊；1分，2-3个小囊；2分，4-5个小囊；3分，多于6个小囊。腐蚀被规定为0，如果上皮细胞完整；1为溃疡涉及到了固有层；2为溃疡涉及到了粘膜下层；和3，当溃疡是透壁的。严重程度的其他参数按照等级0-3来打分，具体如下0，缺乏的；1，弱的；2，中度的；3，严重的。
细胞培养TNBS小鼠尾部的淋巴结细胞是使淋巴结穿过40um滤槽过滤器(Becton/Dickson实验室设备公司、新泽西州、美国)而分离出来的。分离出的淋巴细胞被悬浮在4mlRPMI 1640介质中，该介质包括L-谷氨酰胺、10％的牛胎盘血清(FCS)和抗生素(青霉素G钠10000U/ml，硫酸链霉素25ug/ml，两性霉素B25ug/ml；Gibco/BRL，Paisley，苏格兰)。对细胞进行计数并且以每孔总体积为200ul的相同培养基中有2×105个细胞将其加入到平底的96-孔板中。细胞在固定的α-CD3(1∶30浓度；145.2C11纯系)和可溶α-CD28(1∶1000浓度；PharMingen)存在的情况下于37℃下培养48小时。收集上清液并用于细胞因子微球分析(cytokine bead assay)(CBA)。
均质化以及酶的测定从肛门取6厘米具有瑞士作用(Swiss roles)的结肠样品被冻结在氮中。匀浆是用组织匀浆器在9体积的greenberger裂解缓冲液(300mmol/L NaCl，15mmol/L Tris，2mmol/LMgCl2、，2mmol/L Triton X-100(Sigma，圣路易斯，密苏里州)，抑胃肽A，亮肽素，抑肽酶(Aprotinine)(Roche，曼海姆，德国)，均为20ng/ml；pH值7.4)中制得。组织在冰上裂解一小时并以3000rpm的速度离心7分钟再以14000rpm的速度离心10分钟。收集上清液并冷冻贮藏直至酶的测定和BD细胞因子微球分析的那一天。
在结肠炎期间收集老鼠的粪便。记录粪便的重量并将其悬浮在含有0.5mMMgCl2的0.6ml50mM的甘氨酸缓冲液(25℃时pH值9.6)中。离心(10’，13000rpm)之后，冷冻贮藏上清液至测定碱性磷酸酶活力的那天。
结肠和粪便中的碱性磷酸酶活力用光谱光度法测量，用p-硝基磷酸盐在含有0.5mMMgCl2的50mM甘氨酸缓冲液(25℃时pH值9.6)中作为底物。结肠匀浆中的酶活力用mU/ml表示，粪便中的酶活力用mU/mg表示。
细胞因子微球试验(CBA)根据Becton Dickinson(BD)厂家推荐的和如别处的描述(37、参见图2.2)进行细胞因子微球试验能同时测定在结肠匀浆和CLN细胞培养上清液中TNF-a，IFN-γ，IL-2，IL-4和IL-5的产量。简要来说，微粒(聚苯乙烯微球)被染成5级荧光强度。专属(proprietary)染剂具有的发射波长是-650nm(FL-3)。每个微粒与抗五个细胞因子之一的抗体通过基于硫羟-顺丁烯二酰亚胺的相互作用共价结合，并表现出不连续的、其FL-3强度异常的集团(population)。抗体-微粒(Ab-particles)用作在免疫试验板(panel)中所指定的细胞因子的捕获物，并且能够同时在混合物中被检出。所捕获的细胞因子采用五种与藻红蛋白(PE)结合在一起的不同抗体通过直接免疫测定法测定，藻红蛋白其在585nm(FL-2)发射光谱。范围从0到2000pg/ml的标准品是所有五种细胞因子的混合物，以便获得五条标准曲线。对每个样品和细胞因子标准品混合物、将10ul的捕获抗体-微球(Ab-bead)样品或标准品和检测剂抗体-藻红蛋白试剂孵育三小时并在利用流式细胞计数仪获取数据之前将进行洗涤以除去非结合检验剂抗体-藻红蛋白(Ab-PE)试剂。双色流式细胞计数分析是利用FACScan流式细胞计数仪(Becton Dickinson免疫细胞计数系统(BDIS)，San Jose，加拿大)完成的。利用Becton Dickinson Cytometric Bead Array(CBA)软件获取数据并进行分析。
统计分析将所有数据表示为平均值±标准偏差。其中所指出的统计学分析(Student-t)被用于计算不同组之间特殊的测定方法中差异的统计显著性。p＜0.05的值就认为在统计学上是显著的(*p＜0.05)。
结果为了研究口服碱性磷酸酶是否在IBD中具有治疗的可能，TNBS和DSS诱发小鼠结肠炎被用来作为模型。和预料的一样，TNBS的直肠滴注和DSS的口服给药导致了腹泻和消耗性疾病。在第二天，两组处理的每一组中的十只小鼠中的两只死亡(参见图2和3)，这表明碱性磷酸酶(AP)不能阻止由早期的炎症反应造成的死亡，在最初的直肠注入TNBS的两、三天后，一个4型的滞后过敏响应性反应被激活并且引起大多数炎症，这导致了额外的死亡。尽管碱性磷酸酶(AP)处理不能在这个第一反应期间阻止小鼠的死亡，但是由于第二次的炎性反应，它阻止了额外的死亡。
在摄取含有2％DSS的饮用水5天并随后管饲碱性磷酸酶(AP)至14天的组中，碱性磷酸酶(AP)处理组中33％的小鼠在第8天和第10天之间死亡。其后这组中没有小鼠死亡。然而，在安慰剂(placebo)处理组中，与TNBS模型一样，总共有60％的小鼠从第8天开始死亡直至第14天，碱性磷酸酶(AP)能在DSS-结肠炎后期减少死亡率，但不能在诱导期减少死亡。
在TNBS的第一次给药之后，与对照小鼠一样，两组碱性磷酸酶(AP)处理小鼠的重量在第1天已经降低(参见图4)。然而，对照组小鼠的重量在第四天降到它们原来体重的92％，而碱性磷酸酶(AP)处理小鼠的重量升高到其原来体重的98％以上并保持稳定。在第六天，对照组小鼠的重量也达到它们原来体重。因此体重方面的影响与所述的存活率的益处是同步的。
在DSS的研究中，只有摄取2％DSS并且持续直至14天的第二组在第10、11和12天显示出了统计学上的显著差异(图5)。其他的两组只持续到第7天，与前面组一样，到那天为止碱性磷酸酶(AP)处理组和未处理组之间没有表现出差异(数据未给出)。
实施例3细胞因子产量和碱性磷酸酶活力在经碱性磷酸酶处理的小鼠的结肠中被降低了通过细胞因子微球分析法研究Th1响应的程度分析TNBS和DSS小鼠的结肠匀浆物中细胞因子的产量。与碱性磷酸酶处理的小鼠的CLN中增加的细胞因子产量相反，在这些小鼠结肠匀浆物中的TNF-α，IFN-γ，IL-2，IL-4and IL-5的产量与对照小鼠相比减少了，然而不明显(参见表1)。用2.5％DSS诱发结肠炎的小鼠证明了类似的结果、尽管这些结果也没有到达统计学上的显著性.(数据未给出)。
表1.用CBA测定的结肠匀浆物中的细胞因子浓度IL-2、-4和-5在1.5％DSS小鼠中的产量是几乎不能检出的(数据未给出)，TNF-α在碱性磷酸酶处理小鼠中的产量与DSS对照小鼠相比减少了，然而不显著(参见图7)。INF-γ产量的情况是，差异是有显著的(p＜0.05)INF-γ产量从在DSS对照小鼠中的100.5±82.3pg/ml减少到碱性磷酸酶处理小鼠中的31.6±21.3pg/ml。
实施例4小鼠仅口服剂量BIAP的药物动力学试验材料与方法在仅采用大剂量口服BIAP(牛肠碱性磷酸酶)之后，研究的主题是局部和全身的生物利用度。试验材料是以溶液方式供给的，并将其储藏在4℃条件下直到使用。高压蒸汽处理过的饮用水中的定量稀释是在处理的当天刚刚准备的。高压蒸汽处理的饮用水被用作对照液。
黑/6小鼠是DSS诱发结肠炎的合适啮齿动物品种，并且符合当局的安全试验规范。口服的给药途径与人类中的目的治疗用途相对应。
试验室和笼子都是干净并且消毒过的。在研究期间，实验室和笼子每隔一定时间就进行净化。实验室温度调节到22±3℃，相对湿度保持在30％和70％之间。每天对这些参数进行监控，在上午6:00开灯用人造光提供一个12小时光照和12个小时黑暗的周期。在动物的房间中空气每小时大约更换8次，并且要经过充分地过滤。用SDS D3丸剂不限量地喂给动物，由供应者对营养剂和污染物进行分析。经高压蒸汽杀菌的饮用水通过饮水瓶不限量的连续进行供给。消耗量基于每天的基准被目视控制。表2.根据下表分配实验组和DSS预处理组
表3根据下表分配实验组和BIAP处理组
从表3可以看出，除了安慰剂组之外，在两个对照和DSS处理组中的所有小鼠每次口管饲法仅接受口服计量75,000U/公斤BIAP(在250ul高压杀菌的饮用水中)。安慰剂组(n＝5)仅接受250ul高压杀菌的饮用水。所有的动物只处理一次。在用BIAP处理之前、一些动物根据表2用DSS处理。
在血液收集以后、制备动物的肠和收集粪便，分别从每条小肠的1/3部分和结肠收集。每份样品在1毫升甘氨酸缓冲液(25mM；pH＝9.6)中用强烈的涡流溶解。用测定碱性磷酸酶活力的试验分析这些样品中的碱性磷酸酶含量。无色的对硝苯基磷酸盐在pH值9.6和25℃下被碱性磷酸酶水解，形成游离态的颜色为黄色的对硝基酚。该反应用分光光度法跟踪。在单位时间内405nm处的吸光度的变化是测定碱性磷酸酶活力的标准。在pH值9.6和25℃条件下，使一微摩尔的对硝苯基磷酸盐每分钟水解所需的酶量被称为一个单位。样品中的单位量是能够被计算或者用已知的碱性磷酸酶浓度对照碱性磷酸酶样品曲线能够标定的。结果在用DSS进行预处理期间，每天称量小鼠的重量作为结肠炎程度的指征。与对照小鼠相比减重大约10％通常用于识别DSS诱发结肠炎。在第6天，那些用DSS处理了5天的小鼠损失了大约10％的体重(图8)，并将它们用于药物动力学实验以确定在结肠炎期间所服用的BIAP的局部和全身的生物利用度。一天之后，同样处理对照小鼠。
为了分析DSS的摄取量，每天在再装满瓶子的前后称量饮料瓶子的重量。前三天、DSS处理的动物几乎与对照动物消耗同样的水量。其后、DSS小鼠喝水较少、大概是由于良好状态降低的结果。然而，DSS的每日摄取量为约40毫克/只小鼠，这在其他的试验中显示是足以诱导结肠炎的(参见图9)。
这项研究的目的是分析肠道中的局部生物利用度。因此，将小鼠在不同的时间点宰杀并分离出从十二指肠到结肠的那段肠道。小肠(包含十二指肠)被分为二、三段相等的部分。从各部分和结肠提取粪便并测量碱性磷酸酶活力。在图10中，显示了不同时间点时肠道不同部分的碱性磷酸酶活力。在十二指肠和空肠的邻近部分任何时间点都没有检测到碱性磷酸酶。这大概是由于穿过这个部分的通道是在10分钟之内进行的，第一个取样点。在10分钟时，DSS处理和对照动物在空肠的末梢部分以及回肠的邻近部分都出现了碱性磷酸酶水平的峰值。半小时至一小时之间，碱性磷酸酶的峰值出现在回肠的末梢部分。在结肠中，管饲法一个半小时后碱性磷酸酶增加了，而六个小时之后，大部分的碱性磷酸酶被排泄或分解了。
由于每只小鼠总共的用药量是1350U，回肠末梢部分和结肠中局部生物利用度估计分别在200/1350＝15％和80/1350＝6％，然而这些值可能被低估了因为他们是根据3个小鼠各自的峰值平均数计算的(参见讨论部分)。
此研究的目的在于估算在高口服剂量给药之后的BIAP的局部生物利用度。在回肠末梢中的局部生物利用度大约为15％，而在结肠中大约为6％。这些值可能被大大的低估了，因为这些值在某一时间点来自于个别小鼠而并不代表随后的时间内一只小鼠的整个通道的碱性磷酸酶活性。因此，在某一时间点峰值可能在肠的给定部分在个别小鼠中被错过了。然而，结果如图10所描绘的，清楚地表明了在口服时碱性磷酸酶的局部生物利用度。这些结果强调了本发明中通过给患者服用碱性磷酸酶源来预防或者减少(有毒的)脂多糖流过哺乳动物体腔的粘膜内层的方法的可行性。
图1、解释本发明模型的三阶段，1，健康情况下的粘膜，具有正常的碱性磷酸酶组织化学性和脂多糖解毒作用；2，患病情况下，碱性磷酸酶(AP)染色缺失，由碱性磷酸酶(AP)进行的脂多糖解毒作用不够充分，有毒的脂多糖的从肠道流入/移位进入循环，导致炎性的反应；3，通过提供外源的的碱性磷酸酶(AP)粘膜的碱性磷酸酶水平得以恢复并对脂多糖进行解毒。
图2、患有TNBS诱发结肠炎的小鼠的病死率情况图3、患有DSS诱发结肠炎的小鼠的病死率情况图4、用碱性磷酸酶(AP)处理和未处理的患有TNBS诱发结肠炎的小鼠的减重情况。
图5、用碱性磷酸酶(AP)处理和未处理的患有DSS诱发结肠炎的动物的减重情况图6、患有TNBS结肠炎的小鼠结肠中的细胞因子的产量。
a，结肠中TH1的响应值b，结肠中TH2的响应值图7、结肠匀浆物中a.TNF-α和b.IFN-γ的浓度。对照小鼠是无病并且未经处理小鼠的正常值。
图8、DDS处理减少体重。小鼠用同普通饮用水或包含2％DSS的饮用水处理5天。在第6天，被DSS处理的动物与对照的动物相比失去了约10％的体重并且被确定为“结肠炎(colitic)”。显示的是每组29只动物的标准偏差的平均数。
图9、DSS处理小鼠的消耗量每天在40-80毫克DSS之间。用饮用水或包含2％的DDS的饮用水来处理小鼠。在再充水的前后称量饮料瓶子的重量，数值以g/只小鼠/天表示平均水摄入量。图10、管饲后不同时间点肠道不同部分的碱性磷酸酶水平。在管饲后的不同时点，老鼠被宰杀并切去肠。收集肠道不同部分的粪便并测定碱性磷酸酶的含量。显示的是三只老鼠在每个时点的平均值。
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1.碱性磷酸酶源在制备预防或减少哺乳动物体腔粘膜内层的脂多糖毒性的药物中的用途。
2.根据权利要求1中所述的用途，其中所述的预防或减少脂多糖毒性用于预防或治疗脂多糖介导或加剧的疾病。
3.根据权利要求1或2中所述的用途，其中所述的脂多糖介导或加剧的疾病选自包括下列的组肠炎，败血症/败血性休克，全身炎性反应综合征(SIRS)，脑膜炎球菌血症，外伤/出血性休克，烧伤，心血管手术/心肺分流术，肝手术/移植，肝病，胰腺炎，坏死性小肠结肠炎，牙周疾病，肺炎，囊纤维化，哮喘，冠心病，充血性心力衰竭，肾病，溶血性尿毒症综合征，肾透析，自身免疫性疾病，癌症，阿耳茨海默氏病，类风湿性关节炎，狼疮，全身性红斑狼疮。
4.根据前述任一项权利要求所述的用途，其中所述的碱性磷酸酶源口服给药。
5.根据前述任一项权利要求所述的用途，其中所述的体腔是胃肠道。
6.根据前述任一项权利要求所述的用途，其中所述的碱性磷酸酶源给药用于预防或治疗胃肠道炎症疾病。
7.根据前述任一项权利要求所述的用途，其中所述的胃肠道炎症疾病选自包括下列的组肠炎，克罗恩氏病，结肠炎，溃疡性结肠炎，肝胆管疾病，乙型肝炎，丙型肝炎，肝硬化，肝纤维化，胆管炎，胆管梗阻，胰腺炎，急性胰腺炎，腹膜炎，牙周疾病，小肠结肠炎，坏死性小肠结肠炎。
8.根据前述任一项权利要求所述的用途，其中胃肠道粘膜对于脂多糖渗透性的升高是由肠灌注的减少或肠局部缺血引起的。
9.根据权利要求8中所述的用途，其中所述的肠灌注的减少或肠局部缺血是由心肺分流术，外科手术，外伤/创伤，烧伤，心脏手术，先天性心脏病，充血性心力衰竭，冠心病，局部缺血性心脏病引起的。
10.根据权利要求1中所述的用途，其中所述的碱性磷酸酶源是通过吸入给药的。
11.根据权利要求10中所述的用途，其中所述的体腔是呼吸道的支气管和/或肺粘膜。
12.根据权利要求10或11所述的用途，其中施用组合物用于预防或者治疗呼吸系统的炎症疾病。
13.根据权利要求10-12中任一项中所述的用途，其中所述的疾病选自包括下列的组肺炎、肺感染、哮喘、囊纤维化、支气管炎、肺气肿。
14.根据权利要求1所述的用途，其中所述的碱性磷酸酶源是在粘膜层局部给药。
15.根据权利要求14所述的用途，其中所述的体腔选自包括下列的组鼻腔、口腔、阴道和直肠。
16.根据权利要求14或15所述的用途，其中施用组合物用于局部的或者全身的炎性疾病。
17.根据权利要求14或权利要求16中的任一项所述的用途，其中所述的疾病选自包括下列组鼻、阴道、口、直肠腔的感染病、阴道炎、性传播疾病和感染病、尿路感染、牙周疾病。
18.一种包含碱性磷酸酶源的组合物，可任选包含药学上可接受的稳定剂、活化剂、载体、渗透剂、推进剂、消毒剂、保护剂、稀释剂、营养剂及其他赋形剂，用于在体腔粘膜上释出碱性磷酸酶。
19.根据权利要求18所述的组合物，其中所述的碱性磷酸酶源被肠溶衣包覆用于口服给药并在肠粘膜释出。
20.权利要求18或19所述的组合物，其中所述的碱性磷酸酶是哺乳动物肠碱性磷酸酶，组织非特异性碱性磷酸酶、胎盘碱性磷酸酶和肝碱性磷酸酶。
21.根据权利要求18-20中任一项所述的组合物，其中所述的碱性磷酸酶是人或牛的。
22.根据权利要求18-21中任一项所述的组合物，其中所述的组合物是富集碱性磷酸酶的食品产品或者营养性制剂，适合口服并在胃肠道的粘膜内层释出碱性磷酸酶。
23.根据权利要求18-22中任一项所述的组合物，其中所述的食品产品是一种包含碱性磷酸酶源的选择性基因改良植物，蔬菜或水果。
24.根据权利要求18-23中任一项所述的组合物，其中所述的食品产品是包含碱性磷酸酶源的乳制品。
25.根据权利要求18-24中任一项所述的组合物，其中所述的乳制品是非巴氏杀菌的或部分巴氏杀菌的乳或乳组分。
26.根据权利要求18-25中任一项所述的组和物，其中所述的乳组分是乳脂肪球膜组分。
27.装入了权利要求18-26中任一项中所定义的组合物和推进剂和/或喷雾剂的吸入或喷雾装置。
全文摘要
本发明提供一种碱性磷酸酶在制造预防或减少有毒的脂多糖穿过哺乳动物体腔粘膜内层的药物中的用途。碱性磷酸酶源是用于预防或治疗脂多糖介导或加剧的疾病。本发明也提供包括碱性磷酸酶源的组合物，该组合物用于预防或减少(有毒的)脂多糖流入或穿过粘膜层。
文档编号A61P9/00GK1917899SQ200580004103
公开日2007年2月21日 申请日期2005年2月4日 优先权日2004年2月4日
发明者布兰德斯·儒弟, 剖斯塔·克拉斯 申请人:塞浦西斯阿瓦药物集团