含对氧磷酶制剂的制作方法

专利名称：含对氧磷酶制剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及对氧磷酶(下面，有时也称为PON)。详细地来讲，涉及含PON的制剂、纯化方法、稳定方法及新型医药用途。
背景技术：
对氧磷酶(也称为人血清对氧磷酶或PON1)是Ca2+依赖性的分子量约45kDa的糖蛋白，在血液中作为构成高密度脂蛋白(HDL)的蛋白成分之一存在。已知PON作为水解oxon、有机磷、神经毒气沙林等芳香族羧酸的血清酶，且可以作为这些物质的解毒剂使用。近几年，PON的生理活性正在变得明显，例如，已报道了抗动脉硬化作用、抗氧化作用等(非专利文献1、非专利文献2、专利文献1)关于PON的纯化，已报道了将蓝琼脂糖和DEAE型阴离子交换体处理进行组合的方法(非专利文献3、非专利文献4)。依据该报告例，公开了在甘油和聚氧亚乙基烷基苯基醚型的非离子表面活性剂(具体来讲，Emulgen、Nonidet P-40、都是商品名)的共存下纯化PON的方法，但除此以外的物质，例如3-[(3-胆酰胺基丙基)二甲基铵]-1-丙磺酸盐(下面，有时也称为CHAPS)等未公开。另外，已报道了在含PON的血清试样中添加CHAPS，维持该酶活性(专利文献2)，但其没有涉及纯化PON。
也曾经有几项报道显示将PON应用于医药。例如，暗示生物体中的PON量和心绞痛、心肌梗塞、脑梗塞的关系的报道例(专利文献2)。另外，专利文献3尽管是涉及与APO-A1有关的缺血再灌注损伤的报道，但其中也暗示PON也和APO-A1一样对缺血再灌注损伤有效。但是，但没有具体地显示其效果。
如上所述，现实状况是，仅仅暗示了PON作为医药是有用的，另外对作为医药品稳定供给PON的手段几乎没有报道例。
专利文献1国际公开小册子WO00/30425号专利文献2特开2000-333674号公报专利文献3国际公开小册子WO03/97696号非专利文献1ジャ一ナル·ォブ·クリニカル·ィンベスティグ一ション(J.Clin.Invest.)、1988年、101卷、1581-1590页非专利文献2ネィチャ一(Nature)、1998年、394卷、284-287页非专利文献3ドラッグ·メタボリズム·ァンド·ディスポジション(DrugMethabolism and Disposition)、1991年、19卷1号、100-106页非专利文献4バィォケミストリ(Biochemistry)、1991年、30卷、10133-10140页非专利文献5プロシ一ディングズ·ォブ·ザ·ナショナル·ァカデミ·ォブ·サィェンシズ·ォブ·ザ·ュ一ェスェ一(Proc.Natl.Axad.Sci.USA)、1995年、92卷、7187-7191页非专利文献6ジャ一ナル·ォブ·リピド·リサ一チ(J.Lipid Reseach)、2001年、42卷、951-958页非专利文献7ストロ一ク(Stroke)、1989年、20卷、1037-1043页非专利文献8ジャ一ナル·ォブ·セレブラル·ブラツド·フロ一·ァンド·メタボリズム(Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism)、2000年、20卷、1311-1319页发明内容发明欲解决的课题已预想到在过去的纯化法中高效率地回收高纯度的PON是困难的。另外确认，在使用过去使用的表面活性剂例如聚氧亚乙基烷基苯基醚型的非离子表面活性剂时，PON的稳定效果不一定好。而且，这些表面活性剂中，由于高分子量的物质通过透析等不能除去，故为了将通过色谱处理纯化的PON给药于动物而进行等浓缩操作时，这些表面活性剂也一起被浓缩，担心对生物体产生不好的影响。
本发明的目的在于，提供用于可以将PON临床应用的纯化及制剂化技术。另外，本发明的其他目的还在于，提供PON的新型医药用途。
解决课题的手段本发明者考虑上述情况进行了研究，结果发现，在PON的纯化和/或保存时，通过添加CHAPS，可以改善纯度、活性表达、活性回收率及保存稳定性。
另外，本发明者证明，在缺血再灌注动物模型中，PON是有用的。
即，本发明如下所述(1)一种含PON制剂，其含有PON及CHAPS；(2)如上述(1)的制剂，其进一步含有多元醇；(3)如上述(2)的制剂，其中多元醇为甘油；(4)一种PON纯化方法，其特征在于，将含PON的溶液进行疏水性载体处理，然后在CHAPS的存在下进行阴离子交换体处理；(5)如上述(4)的纯化方法，其中在CHAPS及多元醇的存在下进行阴离子交换体处理；(6)如上述(5)的纯化方法，其中多元醇为甘油；(7)一种PON稳定方法，其特征在于，在PON中添加CHAPS；(8)如上述(7)的稳定方法，其中进一步添加多元醇；(9)如上述(8)的稳定方法，其中多元醇为甘油；(10)一种以PON为有效成分的缺血再灌注伴随的损伤和/或脑梗塞的预防和/或治疗剂；(11)如上述(10)的预防和/或治疗剂，其用于改善缺血再灌注伴随的损伤和/或脑梗塞的预后、神经症状或运动机能；
(12)一种用于缺血再灌注伴随的损伤和/或脑梗塞的预防和/或治疗的药剂，其含有PON及CHAPS；(13)如上述(12)的药剂，其用于改善缺血再灌注伴随的损伤和/或脑梗塞的预后、神经症状或运动机能；(14)如上述(12)或(13)的药剂，其进一步含有多元醇；(15)如上述(14)的药剂，其中多元醇为甘油；(16)一种改善缺血再灌注伴随的损伤和/或脑梗塞的预后、神经症状或运动机能的方法，其中给用有效量的PON。
(17)PON在制造用于改善缺血再灌注伴随的损伤和/或脑梗塞的预后、神经症状或运动机能的药剂中的应用。
根据本发明，可以供给纯化时、保存时的稳定性改善的含PON制剂。另外，可以提供对缺血再灌注伴随的损伤和/或脑梗塞有用的新型医药品。


本图为在缺血再灌注模型中，表示刚刚再灌注后进行PON的初次给药时神经症状改善度随时间的变化。横轴表示观察日，即再灌注后的天数，纵轴表示神经症状评分。图中的记号(□、△、○)表示各观察日的神经症状评分。各自的数据用平均值±SEM表示。在记号和折线的组合中，□和点线的组合表示Sham组(正常组)，△和点线的组合表示载体组(疾病组)，○和实线的组合表示PON给药组。*表示使用Wilcoxon法与载体组比较时，以风险率不足5％表示存在显著性差异。
本图为在缺血再灌注模型中，表示刚刚再灌注后进行PON的初次给药时运动机能改善度随时间的变化。横轴、数据表示、记号和折线组合的定义与图1的说明相同。纵轴表示Rotarod的步行时间(秒)。图中记号(□、△、○)表示各观察日的Rotarod步行时间。**表示在使用t-test法与载体组比较时，以风险率不足1％表示存在显著性差异。
本图为在缺血再灌注模型中，表示再灌注三小时后进行PON初次给药时神经症状改善度随时间的变化。横轴、纵轴、记号、数据表示、记号和折线的组合的定义与图1的说明相同。*表示用t-test法与载体组比较时，以风险率不足5％表示存在显著性差异。
本图为在缺血再灌注模型中，表示再灌注三小时后进行PON初次给药时运动机能改善度随时间的变化。横轴、数据表示、记号和折线的组合的定义与图1的说明相同。纵轴和记号的定义与图2的说明相同。*的定义与图3的说明相同。
具体实施例方式
起始原料在本发明中使用的起始原料只要是含PON溶液就没有特别限定。例如有血液、血浆、血清、从血浆除去血纤维蛋白后的物质、利用Cohn氏低温乙醇分离法从血浆得到的上清级分Eff.I等。另外，也可以是利用基因重组技术制造的物质。具体来讲，可以使用含有用重组技术在CHO细胞、昆虫细胞等中表达的重组PON的溶液(例如，培养液、培养上清液等) (参照非专利文献5、非专利文献6)纯化本发明的纯化方法，其特征在于，将含PON溶液进行疏水性载体处理，然后在多元醇及CHAPS的存在下进行阴离子交换体处理。或者说，本发明的纯化方法特征在于，将含PON的溶液进行疏水性载体处理，然后在CHAPS的存在下进行阴离子交换体处理。
疏水性载体处理疏水性载体是结合了疏水性基的不溶性载体。作为不溶性载体可以例示琼脂糖(商品名セファロ一ス等)、交联葡聚糖(商品名セファデックス等)、亲水性乙烯基聚合物(商品名トョパ一ル等)。另外，疏水性基可以例示烷基，优选碳数4～18的烷基(例如丁基、辛基、十八烷基等)、或苯基等。在不溶性载体上结合疏水基的方法可以按照公知的方法进行。另外，也可以得到市售品。
作为疏水性载体处理方法，具体来讲，使含PON溶液与疏水性载体接触使PON吸附在疏水性载体上后，通过使用特定的溶剂洗脱PON进行回收。作为吸附条件，例如可以列举pH约6～约8、盐浓度约0.01～约0.2M。另外，也可以添加约0.1～约2mM的钙盐。具体来讲，可以例示含有1mM氯化钙的生理盐水(0.15M氯化钠)。在吸附后进行洗涤时，可以通过与吸附同样的条件进行。
在洗脱时，使用约30～约70w/v％、优选约40～约60w/v％的碳数1～4的亚烷基二醇类(例如乙二醇等)。另外，也可以添加约0.1～约2mM的钙盐。具体地，可以例如含有50w/v％乙二醇、1mM氯化钙的水溶液等。
阴离子交换体处理阴离子交换体是在不溶性载体上结合了阴离子交换基而得到的物质。作为不溶性载体，可以例示琼脂糖(商品名セファロ一ス等)、交联葡聚糖(商品名セファデックス等)、亲水性乙烯基聚合物(商品名トョパ一ル等)。另外，作为阴离子交换基，可以例示二乙基氨基乙基(DEAE型)、季铵基(Q型)、季铵乙基(QAE型)等。优选使用季铵基、季铵乙基等强碱性基团。在不溶性载体上结合阴离子交换基的方法可以按照公知的方法进行。另外也可以购入市售品。
阴离子交换体处理是在多元醇(例如甘油等)及CHAPS(N，N-二甲基-N-(3-磺基丙基)-3-[[3α，5β，7α，12α]-3，7，12-三羟基-24-氧代胆烷-24-基]-氨基)-1-丙铵、或者3-[(3-胆酰胺基丙基)二甲基铵]-1-丙磺酸盐)共存下进行。作为多元醇的添加量，可以例示约10～约40w/v％，优选约20～约30w/v％。作为CHAPS的添加量，可以例示约0.01～约1w/v％。另外，本处理以后还进行纯化时，完全在多元醇及CHAPS共存下进行。
另外，阴离子交换体处理也可以在CHAPS的存在下进行。此时，本处理以后也进行纯化时，也可以完全在CHAPS的存在下进行。
作为阴离子交换体处理方法，具体来讲，使含PON溶液与阴离子交换体接触使PON吸附在阴离子交换体上后，通过使用高盐浓度的溶剂洗脱PON进行回收。作为吸附条件，例如可以列举pH约6～约9、盐浓度约0.001～约0.1M。另外，也可以添加约0.1～约2mM的钙盐。具体来讲，可以例示含有1mM氯化钙、25w/v％甘油、0.5w/v％CHAPS的25mM的Tris-盐酸缓冲液(pH7.5)等。在吸附后进行洗涤时，可以利用与吸附同样的条件进行。而且，作为洗脱条件，例如可以列举pH约6～约9、盐浓度约0.1～约2M。另外，也可以添加约0.1～约2mM的钙盐。具体来讲，可以例示含有0.1～1M的氯化钠、1mM氯化钙、25w/v％甘油、0.5w/v％CHAPS的25mM的Tris-盐酸缓冲液(pH7.5)等。另外，在洗脱时，通过逐步地提高盐浓度的方法、连续地提高盐浓度的方法(浓度梯度法)中的任一种方法进行都可以。
浓缩(超滤)在阴离子交换体处理后，可以使用截留分子量约10～约30kDa的超滤膜浓缩含PON溶液。
固定化伴刀豆球蛋白A(下面，有时也称为ConA)处理固定化ConA是在不溶性载体上结合了ConA而得到的物质。作为不溶性载体，可以例示琼脂糖(商品名セファロ一ス等)、交联葡聚糖(商品名セファデックス等)、亲水性乙烯基聚合物(商品名トョパ一ル等)。作为在不溶性载体上结合ConA的方法，可以按照公知的方法进行。另外，也可以购入市售品。
作为固定化ConA处理方法，具体来讲，使含PON溶液与固定化ConA接触使PON吸附在固定化ConA上后，通过使用高盐浓度或特定的溶剂洗脱PON进行回收。作为吸附条件，例如可以列举pH约6～约9、盐浓度约0.1～约0.5M。另外，也可以添加约1～约20mM的钙盐、约1～约10μM的EDTA盐(例如Na盐、钾盐等碱土类金属盐等)。具体地，可以例示含有10mM氯化钙、0.2M氯化钠、5μM EDTA三钠盐、25w/v％甘油、0.5w/v％CHAPS的25mM Tris-盐酸缓冲液(pH7.5)等。在吸附后进行洗涤时，可以利用与吸附同样的条件进行。
另外，作为洗脱条件，例如可以列举pH约6～约9、盐浓度约1～约5M。或者pH、盐浓度在吸附条件的同样条件下，使用约0.1～约0.5M的α-甲基甘露糖苷。另外，也可以添加约1～约20mM的钙盐、约1～约10μM的EDTA盐(例如钠盐、钾盐等的碱土类金属盐等)。具体地，可以例示含有10mM氯化钙、1～4M氯化钠、5μM EDTA三钠盐、25w/v％甘油、0.5w/v％CHAPS的25mM Tris-盐酸缓冲液(pH7.5)，或含有0.1～0.5Mα-甲基甘露糖苷、10mM氯化钙、0.2M氯化钠、5μMEDTA三钠盐、25w/v％甘油、0.5w/v％CHAPS的25mM Tris-盐酸缓冲液(pH7.5)等。另外，在洗脱时，通过逐步地提高盐浓度或α-甲基甘露糖苷的方法、连续地提高盐浓度或α-甲基甘露糖苷的方法(浓度梯度法)中的任一种方法进行都可以。固定化ConA处理可以根据需要进行，或根据情况也可以省略。
阴离子交换体处理(第2次)本处理可以按照最初的阴离子交换体处理反复进行。
而且，作为用于提高PON的纯化度的公知手段，也可以同时使用蓝琼脂糖处理。其处理条件可以根据公知的方法进行。其中，如上所述，在多元醇及CHAPS的共存下进行。或者也可以使本处理在CHAPS的存在下进行。
作为本发明的纯化法，具体地可以例示下面的方法。
疏水性载体处理→阴离子交换体处理→固定化ConA处理→阴离子交换体处理(第2次)疏水性载体处理→阴离子交换体处理→阴离子交换体处理(第2次)根据本纯化法，可以制造约100～约2000U/A280、优选约500～约1800U/A280高度纯化的PON。需要说明的是，PON活性的1U是指每1分钟由1nmol的对氧磷可以生成同摩尔量的4-氨基苯酚。详细情况如参考例1中所述。
制剂化使用纯化的PON进行制剂化。作为纯化的PON，可以使用通过上述的纯化法制造的PON。另外，也可以使用通过公知的纯化法制造的PON。例如，可以例示将蓝琼脂糖处理和阴离子交换体处理组合的方式(专利文献2、非专利文献3、非专利文献4)等。
作为本制剂中的PON的浓度，可以例示约1～约100mg/mL(约1800～约180000U/mL)。作为pH，可以例示约6～约9，作为盐浓度，可以例示约1～约100mM。作为添加剂，可以例示多元醇、CHAPS。作为多元醇，可以例示甘油等。作为其添加浓度，可以例示多元醇约1～约5w/v％、CHAPS约0.001～约0.1w/v％。而且，也可以使用氯化钙等钙盐、EDTA等螯合剂、Tris等的缓冲液。作为其添加浓度，可以分别例示钙盐约0.01～约1mM、螯合剂约0.1～约1μM、缓冲液约1～约10mM。
在含PON的溶液中，根据需要可以添加各种添加剂，使用过滤灭菌、细分割分配(小分け分注)、冻结干燥等方法将PON制剂化。
用法用量通过本发明得到的含PON制剂可以用于公知的医药用途。例如应用于解毒剂、动脉硬化等。另外，作为新型医药用途，可以应用于缺血再灌注伴随的损伤和/或脑梗塞的预防和/或治疗等。作为给药方法，可以是经口给药、非经口给药中的任一种。非经口给药的情况可以列举静脉内给药等的注射等方式。其给药量根据患者的症状、性别、年龄、体重等可以适量增减。具体地，可以例示约0.1～约1000mg/kg体重。
特别地，将PON应用于缺血再灌注伴随的损伤和/或脑梗塞的预防和/或治疗时，具体地可以应用于缺血再灌注伴随的损伤和/或脑梗塞的预后、神经症状或运动机能的改善等。另外，可以应用于缺血再灌注伴随的损伤和/或脑梗塞的意识障碍、该疾病伴随的神经症状、动作障碍、特别是日常动作障碍、机能障碍等的预防和/或治疗。
作为在缺血再灌注伴随的损伤和/或脑梗塞的预防和/或治疗中使用PON时的给药方法，具体地可以例示在缺血再灌注伴随的损伤和/或脑梗塞的发病后48小时以内，优选24小时以内，更优选12小时以内，特别优选3小时以内开始给药，且1日1次、单次给药或1～14日、优选1～7日左右的连日给药。
实施例为了更详细地说明本发明，下面列举实施例及实验例，但本发明不受它们的任何限制。
参考例1A.PON活性的测定1)基质的制备将7μL基质原液(对氧磷，也称为二甲基对硝基苯基磷酸酯，Sigma公司制)在52μL的DMSO中溶解后，以0.1M Tris盐酸、2mM氯化钙(pH8、25℃)稀释100倍。但是，根据需要，在本测定体系中使用向上述的缓冲液中添加了缬氨酸(0.5mg/mL)的缓冲液。
2)测定(在室温下进行)在96孔微型板中添加试样(含PON)20μL和1)中制备的基质溶液200μL并进行混合(对氧磷的终浓度为5mM)。在30分钟动力学模式下测定波长405nm的吸光度，且通过Softmax Version 2.35计算其结果。另外，对试样的稀释使用与基质制备使用的相同缓冲液。
3)计算活性的方法使用2)中得到的Vmax in mOD/分由下式算出。但是，该值采用Vmax相关系数为0.95以上的值。
式1PON活性(U/mL＝nmol/分/mL)＝Vmax in mOD/分/17000/0.6×0.22×1000×50B.PON抗原量通过夹心ELISA法测定。
实施例1使用由人汇集血浆制备的血清纯化PON。将人血清施加到用含有1mM氯化钙的生理盐水平衡的苯基琼脂糖柱(苯基-琼脂糖、ァマシャムファルマシァ)。用相同的溶剂洗涤后，用含有50w/v％乙二醇、1mM氯化钠的水溶液洗脱吸附的PON。使用超滤膜(30kDa)，用含有1mM氯化钙、25w/v％甘油、0.5w/v％CHAPS的25mM Tris-盐酸缓冲液(pH7.5)将该溶液脱盐浓缩，并施加到用相同溶剂平衡的季铵型-琼脂糖柱(Q-琼脂糖、ファルマシァ)。用相同溶剂洗涤后，按0.1M→0.15M→0.2M→0.25M→1M的顺序逐步地提高氯化钠浓度进行洗脱。回收0.2M～0.25M的氯化钠的洗脱组分，用超滤膜(10kDa)浓缩。
实施例2将在实施例1中制备的含PON溶液，施加到用含10mM氯化钙、0.2M氯化钠、5μMEDTA三钠、25w/v％甘油、0.5w/v％CHAPS的25mMTris-盐酸缓冲液(pH7.5)平衡的ConA琼脂糖柱(ConA琼脂糖、ァマシャムファルマシァ)。用相同溶剂洗涤后，用含有3M氯化钠的相同溶剂洗脱PON。使用超滤膜(10kDa)浓缩。按照实施例1的方法使用季铵型琼脂糖柱(前述)处理该溶液，且回收0.25M的氯化钠的洗脱组分。该季铵型琼脂糖处理(第2次)的活性回收率为95％。另外，用SDS-PAGE(还原条件下)分析纯化的PON，大体上作为1个谱带(分子量45kDa)检出。
实施例3按0.15M→0.2M→0.25M→1M的顺序逐步地提高季铵型琼脂糖(Q-琼脂糖)处理中洗脱时的氯化钠浓度，除此以外，完全按照实施例1进行。回收0.25M的氯化钠的洗脱组分，用超滤膜(10kDa)浓缩。
实施例4按照实施例1的方法，再次使用季铵型琼脂糖柱处理在实施例3中制备的含PON溶液，且回收0.2M的氯化钠的洗脱组分。用SDS-PAGE(还原条件下)分析纯化的PON，大体上作为1个谱带(分子量45kDa)检出。
在下面的表中，表示通过各实施例制备的PON的纯化行为。实施例1与表1和2相对应，实施例2与表3相对应，实施例3与表4相对应，实施例4与表5相对应。
表1

表2

表3

表4

表5

实施例5制备PON制剂，其由含有10mg/mL的纯化PON(实施例4制备)、2.5w/v％甘油、0.05w/v％CHAPS、0.1mM氯化钙、20mM氯化钠、0.5μMEDTA·3Na的2.5mM Tris盐酸的缓冲液(pH7.5)的组成构成。
实验例1对通过实施例1的疏水性载体(苯基-琼脂糖，下面的实验例及参考例2也完全相同)处理得到的洗脱液，研究了各表面活性剂[聚氧亚乙基烷基苯基醚(商品名トリトンX-100)、聚氧亚乙基山梨糖醇酐脂肪酸酯(商品名吐温80)、辛基硫葡萄糖苷、CHAPS]和活性残存率的关系。溶剂为含有1mM氯化钙、25w/v％甘油的25mM Tris盐酸缓冲液(pH7.5)。在室温下放置30分钟后测定PON活性。在表6中表示结果。
表6

与トリトンX-100、吐温80、辛基硫葡萄糖苷相比，CHAPS一方显示高的活性残存率，判定稳定效果优良。
参考例2将通过疏水性载体处理得到的洗脱液，施加到用含有1mM氯化钙、25w/v％乙二醇、各种表面活性剂[聚氧亚乙基烷基苯基醚(商品名トリトンX-100)、聚氧亚乙基脂肪酸酯(商品名吐温80)、辛基硫葡萄糖苷]的25mM Tris盐酸缓冲液(pH7.4)平衡的阴离子交换体(DEAE型琼脂糖)柱，且确认了用0.15M氯化钠洗脱时PON的洗脱行为。トリトンX-100和吐温80的添加浓度为0.1w/v％，辛基硫葡萄糖苷的添加浓度为0.5w/v％。在表7中表示结果。
表7

对于吐温80，尽管纯化度(比活性)与トリトンX-100同等，但是活性回收率减半。对于硫葡萄糖苷，纯化度、回收率都比トリトンX-100、吐温80稍微劣化。使用辛基硫葡萄糖苷时，纯化度、回收率都与辛基葡萄糖苷同等(未显示数据)。
实验例2将通过疏水性载体处理得到的洗脱液，施加到用含有1mM氯化钙、25w/v％甘油、0.5w/v％CHAPS的25mM Tris盐酸缓冲液(pH7.5)平衡的阴离子交换体(季铵型琼脂糖)柱，并确认了用0.2～0.25M氯化钠洗脱时的PON洗脱行为。在表8中表示结果。
表8

使用CHAPS时的纯化度及活性回收率结果与参考例2的トリトンX-100几乎同等。另外，该组合物在4℃下保存1个月也维持活性。
实验例3将通过疏水性载体处理得到的洗脱液，施加到用含有1mM氯化钙、5μM EDTA·3Na、0.5w/v％CHAPS、25w/v％甘油的25mM Tris盐酸缓冲液(pH7.5)平衡的阴离子交换体(季铵-琼脂糖)柱，且确认了用0.2～0.25M氯化钠洗脱时PON的洗脱行为。作为对照使用不添加甘油的物质，结果示于表9中。
表9

不添加甘油时，活性回收率显示更低的值。另外，对施加的试样、得到的组分的稳定性，在保存1周后观察到约50％的活性降低。
实验例4以梗塞灶的体积为指标评价了纯化的PON对大鼠脑梗塞(缺血再灌注)模型的作用。
实验方法1、被试验物质及制造方法按照实施例5，PON使用以10mg/mL浓度溶解在于溶剂而成的物质。溶剂仅使用在被试验物质中使用的溶剂。
2、动物使用CD(SD)雄性大鼠(体重300g左右、8周大)。
3、评价项目为梗塞灶的体积。
4、组构成及给药量对照组在缺血之后立即对大鼠进行尾静脉内给用溶剂(例数为6)。PON给药组在缺血之后立即以10mg/kg体重对大鼠进行尾静脉内给药(例数为5)。
5、方法缺血再灌注模型的制作脑缺血再灌注按照非专利文献7中公开的方法制作。即在氟烷麻醉下将动物在背位固定，将颈部除毛后，正中切开颈部皮肤。将总颈动脉由周围组织剥离，且用丝线结扎右外颈动脉及总颈动脉，对内颈动脉挂线后，由内颈动脉和外颈动脉的分支部，将在前端约2cm以直径0.45mm涂布硅氧烷的栓子(4-0尼龙线、协和时计工业)插入18mm，用丝线同时结扎内颈动脉，通过固定使右中大脑动脉(MCA)灌流区域缺血。缝合切开部，由麻醉中苏醒。缺血负荷2小时后再打开切开部，并拔出栓子约1cm，由此进行右MCA灌流区域的再灌注，再缝合切开部。
梗塞灶体积的测定再灌注24小时后，将动物头部切断，沿头盖骨的缝打开头部，摘出脑组织，使用普通切片器(RBM-4000C、Brain Matrix)将脑组织由bregma至前方(+)3mm、1mm及后方(-)1mm、3mm、5mm环切，制作冠状切片。接着，在含有2％的2，3，5-三苯基四唑氯化物(TTC；ナカラィ)的0.1M磷酸缓冲液中，将脑切片温育约10分钟。取出脑切片，轻轻地除去水分后，进行照相，区别TTC染色阳性区域和阴性区域。由此使用图像解析装置(Simple PCI、C-IMAGING systems)测定梗塞灶面积，算出梗塞灶体积。
6、结果表示在表10中。
表10

*表示风险率不满5％，存在显著性差异。
这次初步确认了通过PON给药，在动物实验中明显地抑制了缺血再灌注伴随的损伤和/或脑梗塞。
实验例51)神经症状中大脑动脉(MCA)缺血再灌注模型的制作利用七氟醚将动物进行呼气麻醉后，在保温垫(SMS-2000J，Meidcal System Inc.、37℃设定)上进行背位固定。切开颈部中央后，结扎右外颈动脉及右总颈动脉。由内颈动脉和外颈动脉的分支部，将前端约2cm进行了直径0.19～0.20mm硅氧烷涂敷的栓子(0.2号溪流用钓线、OWNERCO、LTD)，沿右内颈动脉插入约0.9cm，由此使MCA为缺血状态。缝合颈部切开部，由麻醉中苏醒，在缺血1小时后如上所述进行麻醉，且拔掉栓子，使MCA进行再灌注。模型制作的可否，通过再灌注之前的神经症状判定。即，手持动物的尾巴悬吊时，判定是否弯曲左前肢，将躯体向左弯曲。另外，只通过结扎右外颈动脉及右总颈动脉，制作不插入栓子的个体，作为sham-operation组。
神经症状评分(Modiedfied Neurologic severity score；NSS)根据非专利文献8中记载的方法，进行附加评分。即，观察下面表示的症状时，每一项作为1分进行加算，以累积分值作为评分。
在再灌注1、3、5、7、9、14、19及23日后实施观察。
1分的症状手持尾巴悬吊时，弯曲左前肢。
手持尾巴悬吊时，弯曲左后肢。
手持尾巴悬吊时，向左弯曲躯体。
放在床上时，不直线行走。
放在床上时，向左转。
放在床上时，向左倾斜。
不动。
颤抖。
引起发作。
药剂给药PON(通过实施例5制备)在再灌注之后及再灌注1、2、3、4、5、6日后每日给药1次。1次的给药量为10mg/10mL/kg体重。作为对照，以相同给用液量仅给用不含有PON的溶剂(载体组)。
例数为Sham组5、载体组3、PON给药组4。结果示于图1中。
2)运动机能使用市售的Rota-rod tredmill for mice(MK-600、室町机械株式会社)测定。即，再灌注1、3、5、7、9、14、19及23日后，使其在以一定速度(设定1)旋转的棍上向与旋转方向相反的方向走动，测定由开始行走的时间至从棍上落下的时间。步行时间设定为上限200秒。使小鼠预先进行试验前5天步行练习，在实验的前天对中大脑动脉(MCA)缺血再灌注模型的制作仅仅提供行走了200秒的个体。除此以外，与1)相同。在图2中表示结果。
由这些结果判定在MCA缺血再灌注模型中，通过在再灌注之后立即给药PON，神经症状及运动机能得到改善。即确认了PON在MCA缺血再灌注模型中的预后改善效果。
实验例6在再灌注3小时后初次给药PON，除此之外，完全按实验例5进行实验，观察神经症状。例数为Sham组5、载体组3、PON给药组4。在图3中表示结果。
另外，同样也观察了运动机能。例数为Sham组4、载体组5、PON给药组4。在图4中表示结果。
由这些结果判定在MCA缺血再灌注中，即使再灌注3小时后给用PON，神经症状及运动机能也得到改善。即，PON在MCA缺血再灌注模型中的预后改善效果，在PON的初期给药为再灌注3小时后的情况下也得到了确认。
工业上的利用可能性根据本发明，可以供给纯化时、保存时的稳定性改善的含PON制剂。另外，可以提供对缺血再灌注伴随损伤和/或脑梗塞有用的新型医药品。
使用特定的方式详细地说明了本发明，但在不脱离本发明的意图和范围的情况下，可以进行各种各样的变更及变形，这对本领域的普通技术人员来说是清楚的。
本申请以在日本申请的特愿2004-27727号(申请日2004年2月4日)为基础，其内容都包含在本说明书中。
权利要求
1.一种含PON制剂，其含有对氧磷酶(PON)及3-[(3-胆酰胺丙基)二甲基铵]-1-丙磺酸盐(CHAPS)。
2.如权利要求1所述的制剂，其进一步含有多元醇。
3.如权利要求2所述的制剂，其中多元醇为甘油。
4.一种PON纯化方法，其特征在于，将含PON的溶液进行疏水性载体处理，然后在CHAPS的存在下进行阴离子交换体处理。
5.如权利要求4所述的纯化方法，其中，在CHAPS及多元醇的存在下进行阴离子交换体处理。
6.如权利要求5所述的纯化方法，其中多元醇为甘油。
7.一种PON稳定方法，其特征在于，在PON中添加CHAPS。
8.如权利要求7所述的稳定方法，其中，进一步添加多元醇。
9.如权利要求8所述的稳定方法，其中多元醇为甘油。
10.一种以PON为有效成分的缺血再灌注伴随的损伤和/或脑梗塞的预防和/或治疗剂。
11.如权利要求10所述的预防和/或治疗剂，其用于改善缺血再灌注伴随的损伤和/或脑梗塞的预后、神经症状或运动机能。
12.一种用于缺血再灌注伴随的损伤和/或脑梗塞的预防和/或治疗的药剂，其含有PON及CHAPS。
13.如权利要求12所述的药剂，其用于改善缺血再灌注伴随的损伤和/或脑梗塞的预后、神经症状或运动机能。
14.如权利要求12或13所述的药剂，其进一步含有多元醇。
15.如权利要求14所述的药剂，其中多元醇为甘油。
16.一种改善缺血再灌注伴随的损伤和/或脑梗塞的预后、神经症状或运动机能的方法，其中，给用有效量的PON。
17.PON在制造用于改善缺血再灌注伴随的损伤和/或脑梗塞的预后、神经症状或运动机能的药剂中的应用。
全文摘要
本发明提供一种含有对氧磷酶的制剂、纯化方法、及以PON为有效成分的缺血再灌注伴随的损伤和/或脑梗塞的预防和/或治疗剂。
文档编号A61K47/20GK1925868SQ200580004108
公开日2007年3月7日 申请日期2005年2月4日 优先权日2004年2月4日
发明者浅原尚美, 桥本元范, 幸敏志 申请人:三菱制药株式会社