燕窝在制备保护肠黏膜免疫屏障的药物中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及燕窝在制备保护肠黏膜免疫屏障的药物中的应用。本发明所述应用中药物可恢复肠道派氏结中淋巴细胞的正常比例，促进肠道中sIgA的分泌，保护肠黏膜免疫屏障，有效缓解化疗药物引起的肠道黏膜免疫屏障损伤。
【专利说明】燕窝在制备保护肠黏膜免疫屏障的药物中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及医用配制品，具体涉及燕窝在制药物中的新用途。
【背景技术】
[0002] 燕窝为雨燕科（APodidae)金丝燕属（Aerodramus或Collocalia)多种鸟类分泌 唾液与其绒羽混合凝结于悬崖峭壁上而筑成的巢窝。张璐的《本经逢原》载曰"燕窝，甘平 无毒，能金水相生，肾气上滋于肺，而胃气亦得而安……今人以之调补虚劳，咳吐红痰"。现 代研究已证明燕窝具有促进免疫，促有丝分裂，抗病毒等功效。燕窝中含有表皮生长因子和 促细胞分裂成分-细胞分裂激素，可促进人体细胞繁殖与再生，产生修复细胞和改善免疫 系统的效果。1986年，Ng观察了燕窝水提物对人外周单核细胞在ConA或PHA刺激下促进 有丝分裂的作用；1989年，江润祥观察了怀集燕窝水提物对人血淋巴细胞在ConA刺激下促 进有丝分裂的作用；侯雁等研究了不同品种燕窝对ConA刺激下大鼠淋巴细胞转化的促进 作用，结果表明燕窝对大鼠淋巴细胞无直接转化作用，但在低浓度ConA刺激下对大鼠淋巴 细胞转化有辅助作用，不同种类燕窝的辅助转化作用存在一定差异。有研究表明燕窝不但 对体外培养的淋巴细胞有促进增殖的作用，而且体内动物实验研究表明燕窝对提高动物整 体的免疫功能亦有影响。曹妍等人使用印尼白燕盏的匀浆灌胃小鼠，通过测定多个指标研 究其对免疫功能低下小鼠细胞免疫、体液免疫和非特异性免疫的影响，选取免疫器官指数、 血清溶血素水平、迟发型变态反应和腹腔巨噬细胞对鸡红细胞的吞噬能力等四个代表性指 标进行测定，结果表明，燕窝匀浆能显著提高小鼠血清溶血素含量，促进小鼠的体液免疫功 能；显著促进小鼠迟发型变态反应，提高小鼠的细胞免疫功能；显著促进小鼠腹腔巨噬细 胞对鸡红细胞的吞噬率和吞噬指数，促进小鼠的非特异性免疫功能。张玫等用珍珠燕窝提 取液灌胃小鼠，T淋巴细胞转化和血清IgM含量显著升高，说明该提取液可增强小鼠细胞免 疫和体液免疫。此外现代江润祥教授近年来对燕窝进行研究发现，在离体细胞的实验中，燕 窝含有促进细胞分裂的激素及表皮生长因子，可刺激细胞再生以及对细胞诱发的免疫功能 有促进作用。
[0003] 化疗是恶性肿瘤治疗的重要组成部分，随着诸多新化疗药物的应用，在提高治疗 肿瘤疗效的同时，人们更加重视对化疗不良反应的防治，以改善患者的生活质量。化疗药物 在杀伤肿瘤的同时对正常组织器官也有不同的影响，其中肠黏膜损伤正是某些抗癌药物的 毒性反应。因此，深入研究燕窝对保护肠黏膜免疫屏障的作用具有重要意义。
【发明内容】
[0004] 本发明要解决的技术问题是提供燕窝在制药中的新用途。
[0005] 上述新用途具体是，燕窝在制备保护肠黏膜免疫屏障的药物中的应用。
[0006] 本发明所述应用中，所述的药物是由燕窝的水溶性蛋白和医学上可接受的辅料组 成的口服制剂，如，口服液、片剂或胶囊剂。
[0007] 上述口服制剂中，所述燕窝的水溶性蛋白的提取方法由下述步骤组成：
[0008] (1)取燕窝，按Ig燕窝加10?IOOml水的料液比加入蒸馏水浸泡3?6h，然后充 分研磨、搅拌；
[0009] (2)将上述提取液超声10?40min，然后过100目筛，得过滤液；
[0010] (3)将滤液冷冻干燥至含水分5?8 %，得水溶性蛋白。
[0011] 本发明所述的药物对环磷酰胺诱导的免疫抑制小鼠具有很好的肠道黏膜免疫调 节作用，它可恢复肠道派氏结中淋巴细胞的正常比例，促进肠道中SlgA的分泌，保护肠黏 膜免疫屏障，有效缓解化疗药物引起的肠道黏膜免疫屏障损伤。
【具体实施方式】
[0012] 例 1( 口服液）
[0013] 1、制备水溶性蛋白
[0014] (1)取燕窝l〇〇g，加入蒸馏水10000ml浸泡3h，然后充分研磨、搅拌；
[0015] (2)将上述提取液超声lOmin，然后过100目筛，得过滤液；
[0016] (3)将滤液冷冻干燥至含水分7 %，得水溶性蛋白。
[0017] 2、制备口服液
[0018] 将上述IOOg燕窝粉末所制备的水溶性蛋白（冻干粉）与聚山梨酯805g、甜菊苷 0· 5g和苯甲酸钠2g混合，加入去离子水至600ml，分装成60支（每支IOml)，灭菌，即得。
[0019] 服用剂量为：每天3次，每次1支。
[0020] 例2 (片剂）
[0021] 1、制备水溶性蛋白
[0022] (1)取燕窝100g，加入蒸馏水IOOOml浸泡6h，然后充分研磨、搅拌；
[0023] (2)将上述提取液超声40min，然后过100目筛，得过滤液；
[0024] (3)将滤液冷冻干燥至含水分5 %，得水溶性蛋白。
[0025] 2、制备片剂
[0026] 将上述IOOg燕窝粉末所制备的水溶性蛋白（冻干粉）与IOg糊精和淀粉至24g 混匀制成颗粒，60°C以下干燥，压制成120片（0. 20g/片），包薄膜衣，即得。
[0027] 服用剂量为：每天3次，每次2片。
[0028] 例3 (胶囊剂）
[0029] 1、制备水溶性蛋白
[0030] (1)取燕窝l〇〇g，加入蒸馏水5000ml浸泡4h，然后充分研磨、搅拌；
[0031] (2)将上述提取液超声30min，然后过100目筛，得过滤液；
[0032] (3)将滤液冷冻干燥至含水分8 %，得水溶性蛋白。
[0033] 2、制备胶囊剂
[0034] 将上述IOOg燕窝粉末所制备的水溶性蛋白（冻干粉）与IOg糊精和加淀粉至30g 混勻，喷洒40%乙醇润湿，制成颗粒，60°C以下干燥，过筛，装入1号胶囊，制成硬胶囊120粒 (0· 25g/ 粒）。
[0035] 服用剂量为：每天3次，每次2粒。
[0036] 例4(药效实验）
[0037] 1实验材料
[0038] I. 1实验试剂
[0039] RPMI1640细胞培养液购于赛莫非世尔生物化学制品（北京）有限公司，批号： NWF0423 ；
[0040] 胎牛血清（Fetal calf serum,简称FCS)购于赛莫非世尔生物化学制品（北京） 有限公司，批号：NWG0445 ;
[0041] PBS购于赛莫非世尔生物化学制品（北京）有限公司，批号：NWJ0469 ;
[0042] PE Rat anti-Mouse CD19 购于美国 BDPharMingen 公司，批号：3248590 ;
[0043] PE Rat anti-Mouse CD3 购于美国 BDPharMingen 公司，批号：16835 ;
[0044] Mouse IgA ELISA 试剂盒购于 eBioscience 公司，批号：91437006。
[0045] 1. 2实验仪器
[0046] 流式细胞仪（FACSCalibur 型，美国 Becton Dickinson 公司）；
[0047] 电子天平（EL204,梅特勒-托利多仪器有限公司）；
[0048] 低温离心机（Megafuge I. OR 型，德国 Herculeus 公司）；
[0049] 光学显微镜（C0ICXSZ-D2型，重庆光学仪器厂）；
[0050] TDZ5-WS多管架自动平衡离心机（赛特湘仪离心机仪器有限公司）；
[0051] 酶标仪（Bio-Rad 美国）；
[0052] 电子天平（MA110型，上海天平仪器厂）；
[0053] 96孔细胞培养板（美国Corning公司）；
[0054] 微量加样器（美国raining公司）；
[0055] 普通冰箱（TCL公司）；
[0056] 超低温冰箱（西门子公司）；
[0057] 手术器械（眼科剪/眼科镊，苏州）；
[0058] 40 μ m细胞筛网（美国BD FalconTM公司）。
[0059] 1. 3实验动物
[0060] SPF级昆明种小鼠，体重18?22g，雄性，购自广州中医药大学实验动物中心，许可 证号：SCXK (粤）2013-0020。
[0061] 2试验方法
[0062] 2. 1实验药物
[0063] 实验药物为实施例1所制得的口服液。
[0064] 2. 2药物剂量设计
[0065] 按燕窝原料药计，成人用量5g/天，本实验取成人用量的10倍作为小鼠燕窝用量 的中剂量。小鼠服用燕窝低、中、高剂量分别为〇. 42g/kg、0. 83g/kg、l. 66g/kg。
[0066] 2· 3动物给药及造模方法
[0067] 取雄性KM小鼠共40只随机分为5组，正常对照组、模型组、燕窝高、中、低剂量组， 每组8只。燕窝高、中、低剂量组小鼠每日灌胃不同剂量的燕窝，正常组与模型组灌胃相应 体积的生理盐水，灌胃18天，于实验前一天给予模型组和燕窝组小鼠腹腔注射100mg/kg的 环磷酰胺，造成小鼠急性免疫抑制模型，第18天处死动物进行实验。
[0068] 2. 4观察指标
[0069] 2. 4. 1记录小鼠体重变化
[0070] 在实验过程中每天对小鼠进行称重，记录小鼠体重变化情况。
[0071] 2. 4. 2计数小鼠肠道派氏结数目
[0072] 将小鼠颈椎脱臼处死后，充分暴露腹腔，取出全肠段，肉眼计数派氏结的数目。
[0073] 2. 4. 3小肠液中SlgA含量检测
[0074] 用带有灌胃针头的5mL注射器向小鼠全肠段肠腔内注入4ml预冷的PBSaOmmol/ L，pH7. 4)，使PBS在肠腔中保留3min，并轻轻晃动肠腔使内容物充分溶解，再将保留在肠腔 中的PBS轻轻冲出收集于EP管中，4°C，3000r/min，离心5min，收集上清，并将每个样品定 容到5ml，储存到-80°C备用。严格按照说明书的要求，用酶联免疫吸附（ELISA)试剂盒对 SlgA进行含量测定。
[0075] 2. 4. 4Peyer' s结中淋巴细胞表型的测定
[0076] 用剪刀和镊子小心取下小肠派氏结并转移至含5 % FCS的RPMI1640完全培养基的 筛网中，用研磨棒加适当力度轻轻研磨，收集滤液，离心（250g，5min)，弃上清，加入含5% FCS的RPMI1640液约3ml，重悬细胞即得Peyer' s结细胞悬液。细胞计数后，从上述新鲜 制备的单细胞悬液中各取lOOul，分别加入调整好浓度的⑶3-PE/⑶19-PE抗体（1 μ g/106 细胞），混匀后室温下避光染色，30min后用Iml PBS洗涤，以洗去多余染料，离心后（250g， 5min)，倒掉上清重悬于300 μ I PBS中，立即用流式细胞仪进行检测分析。
[0077] 2. 5统计学处理
[0078] 各指标数据均采用SPSS 17. 0统计软件单因素方差分析法进行统计，统计结果以 X _ s表不。
[0079] 3.实验结果
[0080] 3. 1燕窝对环磷酰胺诱导的免疫抑制小鼠体重的影响
[0081] 表1燕窝对小鼠体重的影响d s，n=8)
[0082]
[0083]
【权利要求】
1. 燕窝在制备保护肠黏膜免疫屏障的药物中的应用。
2. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的药物为药物由燕窝的水溶性蛋白 和医学上可接受的辅料组成的口服制剂。
3. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的口服制剂为口服液、片剂或胶囊 剂。
4. 根据权利要求2或3所述的应用，其特征在于，所述的水溶性蛋白的制备方法为： (1) 取燕窝，按lg燕窝加10?l〇〇ml水的料液比加入蒸馏水浸泡3?6h，然后充分研 磨、搅拌； (2) 将上述提取液超声10?40min，然后过100目筛，得过滤液； (3) 将滤液冷冻干燥至含水分5?8 %，得水溶性蛋白。
【文档编号】A61P1/00GK104288182SQ201410568116
【公开日】2015年1月21日 申请日期:2014年10月21日 优先权日:2014年10月21日
【发明者】李耿, 赖小平 申请人:广州中医药大学