一种南极磷虾蛋白Pickering乳液及其制备方法与流程

本发明涉及食品乳液制备的技术领域，尤其涉及一种南极磷虾蛋白pickering乳液及其制备方法。

背景技术：

南极磷虾(euphausiasuperba)产量丰富生物量约为400-1550万吨，可利用的生物量与人类目前收获的其他水生物种的总生物量相当，是世界上最大的动物蛋白来源。南极磷虾含有77.9-83.1％的水分，11.9-15.4％的蛋白质，0.4-3.6％的脂质和约2％的几丁质。特别是，磷虾油现在作为替代补充剂在市场上出现，其总脂肪酸由约50％的多不饱和脂肪酸(pufa)组成。其中二十碳五烯酸(epa)、二十二碳六烯酸脂肪酸(dha)和酯化成磷脂(pl)的含量约为30％(zheng，beamer，matak，和jaczynski，2019)。

通常，磷虾油是用有机溶剂从磷虾中提取的，留下大量的蛋白质副产物。南极磷虾中的蛋白质含有所有八种必需氨基酸，具有很高的营养价值，其生物学价值高于其他肉蛋白和乳蛋白。另一个受欢迎且受到广泛研究的研究领域是从磷虾蛋白中分离生物活性肽，已被证明具有高抗氧化性(wang，wang，tian，&yan，2014)，抗菌(ling，yin，qi，&rong，2013)和抗骨质疏松活动(wang，wang，wang，xue，chang，&xue，2015)。尽管南极磷虾的生物量很大和具有高质量的蛋白质，但绝大多数的磷虾产品都是在船上冻结的磷虾，多用于的水产养殖和钓鱼的饵料，其附加值较低(yoshitomi，aoki，oshima，&hata，2006)。因此，南极磷虾蛋白需要开发高附加值的食品，丰富其利用价值，同时为人类饮食带来另一种营养丰富的南极磷虾蛋白质产品。

皮克林乳液(pickeringemulsion)又名pickering乳液，与传统乳液相比，pickering乳液具有很多优点，如pickering乳液可以用天然生物来源的物质来替代无机高分子类型的表面活性剂；pickering乳液具有良好的抵抗ph，盐浓度和温度波动的能力，以保持乳液体系的长期稳定性；pickering乳液还具有稳定的环境相容性以及具有低热量摄入的独特优势。所以，pickering乳液在食品、化妆品、药学等领域有重要的应用价值和广阔的市场前景。其中，植物蛋白颗粒引起了人们的极大兴趣，因为它们目前已经有pickering乳液在食品工业中的应用，包括大豆蛋白，豌豆蛋白，玉米醇溶蛋白等。然而，这些植物蛋白通常被认为是疏水的蛋白质，其几乎完全不溶于水和食用油(allred，velev，&velikov，2018)，导致pickering乳液体系不稳定。此外，植物蛋白必需氨基酸的含量通常低于海洋蛋白，例如，大豆蛋白缺乏蛋氨酸，玉米醇溶蛋白和麦醇溶蛋白缺乏赖氨酸等(wang，&chen，2012)。南极磷虾蛋白含有全部必需氨基酸(eaa)，总量为43.46％，包括赖氨酸(lys，9.68％)、色氨酸(trp，0.55％)、苯丙氨酸(phe，5.09％)、蛋氨酸(met，2.89％)、苏氨酸(thr，4.26％)、异亮氨酸(ile，5.02％)、亮氨酸(leu，8.11％)、缬氨酸(val，5.16％)和组氨酸(his，2.70％)，其中组氨酸对婴儿的生长发育具有重要意义。与植物蛋白相比，南极磷虾蛋白eaas在营养价值方面表现出独特的优势，综合考虑所有这些因素，具有高营养价值和极高丰度的南极磷虾蛋白在制作pickering乳液方面具有巨大的发展的潜力。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服现有植物蛋白pickering乳液营养单一、稳定性差的缺点，提供一种南极磷虾蛋白pickering乳液及其制备方法，富含必需氨基酸，具有高营养价值，对人体无危害，制备的乳液非常稳定。

本发明是通过以下技术方案来实现的：

一种南极磷虾蛋白pickering乳液的制备方法，包括如下步骤：

(1)将南极磷虾蛋白质和水混合，搅拌，形成蛋白质水溶液；

(2)将步骤(1)所得的蛋白质水溶液与植物油混合均匀，得到油水混合物；

(3)将步骤(2)所得的油水混合物剪切均质，得到粗乳液；

(4)将步骤(3)所得的粗乳液超声处理，得到所述南极磷虾蛋白pickering乳液。

步骤(1)所述南极磷虾蛋白质和水的固液比为(2-4)g：100ml，搅拌时间为10-12小时。

步骤(2)所述蛋白质水溶液与植物油体积比为2:8-5:5，优选为3:7-5:5。

步骤(2)所述植物油为葵花籽油、大豆油、橄榄油和菜籽油中的任意一种。

步骤(3)所述均质的转速为15000r/min-20000r/min，均质时间1-3min。

步骤(4)中所述超声处理的条件为：超声时间4-8分钟，脉冲持续时间为4-6秒，关闭时间为4-6秒，使用功率输出为200-400w。

所述南极磷虾蛋白质采用下述方法制备得到：将南极磷虾与去离子水混合，均质后得到磷虾肉匀浆，使用naoh或koh水溶液将磷虾肉匀浆的ph值调节至12-12.5，搅拌0.5-1.5小时，离心，取上清用盐酸调节ph为4.5-5，离心，采用3级逆流法洗涤沉淀的蛋白质，然后将蛋白冷冻干燥，得到南极磷虾蛋白质。

所述3级逆流法是对蛋白清洗的一种方法，具体根据qi,x.m.,liao,e.,wang,l.,lin,h.,&xue,c.h.(2016).extractingproteinfromantarctickrill(euphausiasuperba).journalofaquaticfoodproducttechnology,25(4),597-606.)中的方法进行。

所述离心条件为在3-5℃以6000-10000g的转速(g是重力加速度)离心8-12min。

所述naoh或koh水溶液浓度为2-5mol/l，盐酸浓度为2-5mol/l。

所述南极磷虾与去离子水的固液比为1g：(8-12)ml。

本发明还提供一种南极磷虾蛋白pickering乳液，为水包油(o/w)型乳液，采用上述任一项方法制备得到。

本发明具有以下优点和有益效果：

(1)本发明所述南极磷虾蛋白pickering乳液的制备方法中所采用的原材料都是天然的，且其必需氨基酸的含量为43.46％，高于传统植物蛋白pickering乳液，其中组氨酸对婴儿的生长发育具有重要意义。与植物蛋白相比，南极磷虾蛋白eaas在营养价值方面表现出独特的优势，制作pickering乳液方面具有巨大的优势。

(2)本发明所述制备南极磷虾蛋白pickering乳液的制备方法中其制备操作简单，为海洋蛋白功能性食品提供了崭新的思路。

(3)本发明所述南极磷虾蛋白pickering乳液的制备大大提高了南极磷虾的利用价值，开发了南极磷虾新的利用价值。

(4)本发明所述南极磷虾蛋白pickering乳液的制备方法中所制备的乳液能稳定30d以上，且在不同ph、高离子浓度和储藏温度中具有较好的稳定性。

(5)本发明所述南极磷虾蛋白稳定pickering乳液的制备方法结合了超声技术，制作的pickering乳液具有更小的粒径和更佳的稳定性。

附图说明

图1为本发明南极磷虾蛋白的二级结构分析图。

图2为本发明在不同水油比(2:8、3:7、4:6、5:5)制备的南极磷虾蛋白pickering乳液在储存30d前后的视觉形态(a)和微观结构(b)。

图3本发明磷虾蛋白质稳定的pickering乳液在不同ph的视觉形态(a)和粒径(b)图。

图4本发明磷虾蛋白质稳定的pickering乳液在不同nacl浓度下的视觉形态(a)和粒径(b)图。

图5本发明磷虾蛋白质稳定的pickering乳液在不同温度下的视觉形态(a)和粒径(b)图。

图6本发明南极磷虾蛋白pickering乳液在不同ph(a)、nacl浓度(b)和温度(c)下的流变性质图。

图7本发明南极磷虾蛋白pickering乳液在不同nacl浓度(a)和温度(b)下的zeta电位图。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明做进一步说明。

在制作乳液前我们首先对南极磷虾蛋白做了氨基酸组成和二级结构分析，结果如图1所示，二级结构分析表明，南极磷虾蛋白中β-折叠结构占37.3％，其次是无规卷曲(26.8％)，α-螺旋(21.7％)和β-转弯(14.2％)(图1)。大量的β-折叠结构表明蛋白质之间存在氢键，从而形成强烈的分子间相互作用，这在一定程度上促进了蛋白质聚集体构象的形成，蛋白质等电点为4.5。

实施例中所述3级逆流法是对蛋白清洗的一种方法，具体根据qi,x.m.,liao,e.,wang,l.,lin,h.,&xue,c.h.(2016).extractingproteinfromantarctickrill(euphausiasuperba).journalofaquaticfoodproducttechnology,25(4),597-606.)中的方法进行。

实施例1

一种南极磷虾蛋白稳定pickering乳液及其制备方法，包括以下步骤：

(1)将3g南极磷虾蛋白质加入到100ml的超纯水中，在磁力搅拌器中搅拌12h使其充分水化，得到蛋白质水溶液；

(2)取步骤(1)得到的蛋白质水溶液与葵花籽油分别以体积比为2:8、3:7、4:6、5:5充分混合均匀，得到油水混合物；

(3)将步骤(2)所得的油水混合物在16000r/min条件下剪切均质2min，制备得到粗乳液。

(4)将步骤(3)所得的粗乳液置于超声波粉碎机中超声6分钟，脉冲持续时间为5秒，关闭时间为5秒，使用功率输出为300w，得到所述南极磷虾蛋白pickering乳液；

(5)将步骤(4)所得到的pickering乳液在室温中放置30d。

所述南极磷虾蛋白质采用下述方法制备得到：将南极磷虾与去离子水以1g：10ml的固液比混合，以1000r/min均质3分钟后得到磷虾肉匀浆，使用5mol/lnaoh水溶液将磷虾肉匀浆的ph值调节至12.5，搅拌1小时，用5mol/l盐酸调ph至4.5，在4℃以8000g的转速(g是重力加速度)离心10min，用3级逆流法洗涤沉淀的蛋白质后冷冻干燥，得到南极磷虾蛋白质。

本实施例对步骤(4)中南极磷虾蛋白pickering乳液进行了梯度试验，质量溶度为3％(w/v)的蛋白质溶液，不同水油比的pickering乳液视觉形态(a)和微观结构(b)，结果如图2，其中图2a的从左到右蛋白质水溶液与葵花籽油分别以体积比分比为2:8、3:7、4:6、5:5。水油比的不同直接影响pickering乳液颗粒粒径在油水界面的形成，影响乳液的形成及乳液的稳定性。乳液的粒径直接影响乳液的稳定性，一般来说，粒径越小，稳定性越好，本研究表明蛋白质水溶液与葵花籽油分别以体积比分比为2:8、3:7、4:6、5:5时乳液的平均粒径分别为25.7、14.6、13.7和13.9μm，且贮存30天后粒径大小无变化，尤其制作乳液的油水比为3:7、4:6、5:5时，具有更小的粒径和更好的稳定性。

本实施例制备得到的乳液类型是水包油(o/w)型乳液，稳定剂是南极磷虾蛋白胶体颗粒，所以本发明的乳液属于pickering乳液。同时实例制备的pickering乳液室温常规放置30d仍未分层，乳液稳定性较强。制备乳液所用的原材料是南极磷虾蛋白和葵花籽油，为可食且必需氨基酸含量丰富。

实施例2

(1)制备南极磷虾蛋白质量浓度为3％(w/v)的蛋白质水溶液，将3g南极磷虾蛋白质加入到100ml的超纯水中，在磁力搅拌器中搅拌12h使其充分水化，得到蛋白质水溶液；

(2)将步骤(1)得到的蛋白质水溶液调ph分别为3、5、7和9；

(3)取步骤(2)得到的蛋白质水溶液与大豆油以3:7的体积比充分混合均匀，得到油水混合物；

(4)将步骤(3)所得的油水混合物在16000r/min条件下剪切均质2min，制备得到粗乳液；

(5)将步骤(4)所得的粗乳液置于超声波粉碎机中超声6分钟，脉冲持续时间为5秒，关闭时间为5秒，使用功率输出为300w，得到所述南极磷虾蛋白pickering乳液；

(6)将步骤(5)得到的乳液在室温中放置30d。

所述南极磷虾蛋白质采用下述方法制备得到：将南极磷虾与去离子水以1g：10ml的固液比混合，以1000r/min均质3分钟后得到磷虾肉匀浆，使用5mol/lnaoh水溶液将磷虾肉匀浆的ph值调节至12.5，搅拌1小时，用5mol/l盐酸调ph至4.5，在4℃以8000g的转速(g是重力加速度)离心10min，用3级逆流法洗涤沉淀的蛋白质后冷冻干燥，得到南极磷虾蛋白质。

本实例为了验证南极磷虾蛋白pickering乳液在不同ph的稳定性，图3a磷虾蛋白质稳定的pickering乳液在不同ph的视觉形态图，其中从左到右ph值分别为3、5、7和9；图3b是利用英国马尔文公司malvern3000粒度仪测定不同ph浓度稳定乳液的粒度的粒径分布曲线，3％颗粒浓度制备的pickering乳液粒径主要分布在25μm左右，能稳定存放30d以上。磷虾蛋白质稳定的乳液在不同ph值下的流变学特性结果如图6a所示。对于所有样品，g'值高于g”值，表明弱凝胶行为或固体粘弹性行为。ph值为到3、7和9时，g'和g”的值大大增加。增加的g'和g”高度表明凝胶状强度得到了增强。储存30d后，ph值为3,7和9的磷虾蛋白pickering乳液与0天相比凝胶状强度进一步增加。形成凝胶状主要起源于蛋白质分子的相互作用，包括疏水相互作用，静电力，氢键等。当ph远离等电点(pi＝4.5)时，增加的分子间排斥通过疏水相互作用极大地阻止了蛋白质的聚集，赋予它们相对较小的分子大小和柔韧性。南极磷虾蛋白pickering乳液具有良好的抵抗ph波动的能力，以保持乳液体系的长期稳定性。

实施例3

(1)制备南极磷虾蛋白质量浓度为3％(w/v)的蛋白质水溶液，将3g南极磷虾蛋白质加入到100ml的超纯水中，在磁力搅拌器中搅拌12h使其充分水化，得到蛋白质水溶液；

(2)将步骤(1)得到的蛋白质水溶液中分别加入nacl，使蛋白质水溶液中nacl终浓度分别为50mm、100mm、200mm、400mm；

(3)取步骤(2)得到的蛋白质水溶液与橄榄油以3:7的体积比充分混合均匀，得到油水混合物；

(4)将步骤(3)所得的油水混合物在16000r/min条件下剪切均质2min，制备得到粗乳液；

(5)将步骤(4)所得的粗乳液置于超声波粉碎机中超声6分钟，脉冲持续时间为5秒，关闭时间为5秒，使用功率输出为300w，得到所述南极磷虾蛋白pickering乳液；

(6)将步骤(5)得到的乳液在室温中放置30d。

所述南极磷虾蛋白质采用下述方法制备得到：将南极磷虾与去离子水以1g：10ml的固液比混合，以1000r/min均质3分钟后得到磷虾肉匀浆，使用5mol/lnaoh水溶液将磷虾肉匀浆的ph值调节至12.5，搅拌1小时，用5mol/l盐酸调ph至4.5，在4℃以8000g的转速(g是重力加速度)离心10min，用3级逆流法洗涤沉淀的蛋白质后冷冻干燥，得到南极磷虾蛋白质。

本实施例为了验证南极磷虾蛋白pickering乳液在不同浓度的nacl(50-400mm))的稳定性，图4a磷虾蛋白质稳定的pickering乳液在不同ph的视觉形态图，从左到右蛋白质水溶液中nacl终浓度分别为50mm、100mm、200mm、400mm，乳液显示出良好的视觉形态，没有观察到絮凝或聚结；图4b是利用英国马尔文公司malvern3000粒度仪测定不同nacl浓度稳定乳液的粒度的粒径分布曲线，随着nacl含量从50-400mmnacl增加，乳液在15.1nm至30.0nm的颗粒尺寸上显示出很大的变化。储存30d后获得的乳液视觉形态没有显著变化，乳液的流变学分析(图6b)结果显示在所有的样品中都发现乳液的储存模量(g')大于损失模量(g”)，且随着频率的增加而缓慢增加，表明乳液凝胶结构是由非共价物理交联。乳液凝胶的g'随着nacl浓度的增加而增加而减弱，表明nacl的增加降低了体系中的非共价交联从而减弱了乳液凝胶的强度，zeta的结果(图7a)也显示南极磷虾蛋白pickering乳液可以在一定程度上抵抗盐离子浓度。

实施例4

(1)制备南极磷虾蛋白质量浓度为3％(w/v)的蛋白质水溶液，将3g南极磷虾蛋白质加入到100ml的超纯水中，在磁力搅拌器中搅拌12h使其充分水化，得到蛋白质水溶液；

(2)取步骤(1)得到的蛋白质水溶液与葵花籽油以3:7的体积比充分混合均匀，得到油水混合物；

(3)将步骤(2)所得的油水混合物在16000r/min条件下剪切均质2min，制备得到粗乳液；

(4)将步骤(3)所得的粗乳液置于超声波粉碎机中超声6分钟，脉冲持续时间为5秒，关闭时间为5秒，使用功率输出为300w，得到所述南极磷虾蛋白pickering乳液；

(5)将步骤(4)得到的乳液分别在不同贮藏温度下(4-60℃)放置10天。

具体的，步骤(5)所述贮藏温度分别为4℃、27℃、40℃、50℃、60℃。

所述南极磷虾蛋白质采用下述方法制备得到：将南极磷虾与去离子水以1g：10ml的固液比混合，以1000r/min均质3分钟后得到磷虾肉匀浆，使用5mol/lnaoh水溶液将磷虾肉匀浆的ph值调节至12.5，搅拌1小时，用5mol/l盐酸调ph至4.5，在4℃以8000g的转速(g是重力加速度)离心10min，用3级逆流法洗涤沉淀的蛋白质后冷冻干燥，得到南极磷虾蛋白质。

本实例为了验证南极磷虾蛋白pickering乳液在不同贮藏温度下(4-60℃)的稳定性，图5a磷虾蛋白质稳定的pickering乳液在不同温度的视觉形态图，乳液显示出良好的视觉形态，没有观察到絮凝或聚结；图5b是利用英国马尔文公司malvern3000粒度仪测定不同贮藏温度下乳液的粒度的粒径分布曲线。

随着贮存温度从4℃增加到60℃，乳液颗粒尺寸从14.4nm增加20.4nm，总的来说，乳液颗粒尺寸的增加幅度不大。加热处理诱导蛋白质变性，导致带电基团的暴露和表面净电荷的增加(图7b)，这最终增强了液滴之间的静电排斥。同时，加热处理也导致疏水基团的暴露，导致静电引力的增加和降低二硫键的形成，使乳液间存在静电排斥和疏水相互作用之间存在平衡，最终维持南极磷虾蛋白pickering乳液的形成和稳定，流变的结果也显示(图6c)，与4℃，27℃和40℃处理相比，乳液在50℃和60℃处理后的凝胶状网络结构更好。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何不经过创造性劳动想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书所限定的保护范围为准。