一种油脂组合物及其应用的制作方法

1.本发明涉及食品化学与食品营养领域，具体涉及有效改善代谢的油脂组合物及其应用。


背景技术：

2.母乳是公认的婴幼儿生命初期最理想的食物，含有婴幼儿生长发育所需的全面营养成分。母乳中含3％～5％的脂肪，其中甘油三酯占98％以上，这些脂肪能提供婴幼儿生长发育45％～60％的能量和必需脂肪酸。研究表明，棕榈酸(c16:0)是母乳脂肪中最重要的饱和脂肪酸,其含量约占母乳总脂肪酸含量的17％～25％，并且棕榈酸在母乳脂肪中具有高度特异性的酯化位置分布，约70％的棕榈酸酯化在甘油三酯的sn-2位,而一些不饱和脂肪酸如油酸、亚油酸等则主要分布在甘油三酯的sn-1和sn-3位。当母乳进入人体后,其中的脂肪会被脂肪酶消化水解，而脂肪酶特异性地水解sn-1、sn-3位脂肪酸，生成游离的不饱和脂肪酸和sn-2单棕榈酸甘油酯。sn-2单棕榈酸甘油酯很容易被肠道吸收，并通过淋巴系统进入血液循环，进而转化成婴儿所需要的能量与营养。与之相比，存在于植物油、牛乳和非乳脂肪中的棕榈酸主要酯化在甘油三酯的sn-1和sn-3位上,它们在小肠内被脂肪酶水解后大多形成游离的棕榈酸，因棕榈酸熔点(63℃)高于人的体温,在小肠的酸性环境下容易和钙、镁等矿物质发生皂化反应,形成不溶的皂化盐，进而被排出体外，大大降低了人体对脂肪的吸收利用效率。甘油三酯中sn-2棕榈酸含量的增加，可提高婴幼儿体内脂肪酸以及矿物质(主要是二价钙离子)类营养物质在肠道内的吸收，增加骨生长速度、骨骼矿物质含量及密度，促进骨骼健康；提高乳酸杆菌和双歧杆菌的丰度，抑制脱硫弧菌的生长，促进肠道健康；减少婴儿啼哭时间和频率；促进婴儿大脑发育。但目前对于sn-2棕榈酸酯中sn-2棕榈酸含量对机体胆汁酸代谢和肠道菌群(特别是肥胖、脂质代谢及胆汁酸代谢相关肠道菌群)的影响研究很少。


技术实现要素：

3.针对上述现有技术中存在的缺陷，本发明的目的在于，提供一种有效改善代谢的油脂组合物及其应用，进一步地，提供一种有效改善机体胆汁酸代谢和肠道菌群的油脂组合物，特别是肥胖、脂质代谢及胆汁酸代谢相关肠道菌群。
4.本发明第一方面提供一种油脂组合物，油脂组合物的脂肪酸组成中，sn-2c16:0的含量为25～50wt％，优选为30～38wt％；sn-2 c16:0占比为55～65wt％，优选为55～62wt％。
5.在一个或多个实施方案中，油脂组合物中，sfa的含量为30～40wt％，mufa的含量为35～45wt％，pufa的含量为18～25wt％；
6.在一个或多个实施方案中，油脂组合物中，sfa的含量为33～38wt％，mufa的含量为37～42wt％，pufa的含量为20～24wt％。
7.在一个或多个实施方案中，以脂肪酸总重计，c18:2n-6的含量为15～25wt％，c18:
3n-3的含量为1～5wt％；优选地，以脂肪酸总重计，c18:2n-6的含量为18～23wt％，c18:3n-3的含量为1.5～3.5wt％；
8.在一个或多个实施方案中，油脂组合物的脂肪酸组成还具有以下特征中的一种或多种：18～30wt％、优选22～36wt％的c16:0，35～45wt％、优选38～43wt％的c18:1，2.5～4.0wt％的c14:0，3～6wt％的c18:0，和1.5～3.5wt％的c12:0。
9.在一个或多个实施方案中，油脂组合物含有植物油、乳脂和结构脂以及任选的藻油和任选的鱼油；
10.优选地，植物油为奶粉配方中植物油；优选地，植物油选自菜籽油、葵花籽油、高油酸葵花籽油、大豆油、玉米油、椰子油、棕榈仁油、亚麻籽油、棕榈油、核桃油、沙棘油和元宝枫油中的一种或多种；
11.优选地，乳脂为牛乳脂和/或羊乳脂；
12.优选地，结构脂选自milkopas结构脂1、milkopas结构脂2、milkopas结构脂3和milkopas结构脂4中的一种或多种。
13.在一个或多个实施方案中，油脂组合物含有植物油、乳脂和结构脂，其中，以油脂组合物总重计，植物油的含量为30～80wt％、优选35～55wt％，乳脂的含量为15～28wt％、优选15～25wt％，结构脂的含量为30～40wt％、优选32～38wt％；
14.优选地，植物油含有0～15wt％、优选8～10wt％的菜籽油，20～50wt％、优选23～45wt％的葵花籽油和/或高油酸葵花籽油，1～10wt％、优选2～7wt％的椰子油和/或棕榈仁油，以及2～3wt％的亚麻籽油，重量百分比以油脂组合物总重计。
15.在一个或多个实施方案中，油脂组合物含有占油脂组合物总重10～25wt％、优选13～24wt％的opl+opo。
16.本发明第二方面提供本文任一实施方案所述的油脂组合物的用途，用途为下述用途中的任意一种或多种：
17.用于制备用于降低对象血清中总甘油三酯、总胆固醇及低密度脂蛋白-胆固醇含量，提高对象血清中高密度脂蛋白-胆固醇含量的组合物中的用途；
18.用于制备用于增加对象血清中总胆汁酸含量和牛磺酸结合型胆汁酸含量的组合物中的用途；
19.用于制备用于提高对象血清中游离胆汁酸鹅脱氧胆酸、脱氧胆酸、石胆酸、熊脱氧胆酸、猪脱氧胆酸、α鼠胆酸及ω鼠胆酸中的一种或多种的水平，以及结合胆汁酸牛磺脱氧胆酸、牛磺鹅脱氧胆酸、牛磺熊脱氧胆酸、牛磺α鼠胆酸、牛磺β鼠胆酸、牛磺ω鼠胆酸中的一种或多种的水平；
20.用于制备用于提高对象肠道中总胆汁酸含量、促进胆汁酸从粪便中排泄的组合物中的用途；
21.用于制备用于提高对象肠道中游离胆汁酸胆酸、脱氧胆酸、石胆酸、熊脱氧胆酸、猪脱氧胆酸及ω鼠胆酸中的一种或多种的水平，以及结合型胆汁酸牛磺胆酸、牛磺鹅脱氧胆酸及牛磺熊脱氧胆酸中的一种或多种的水平的组合物中的用途；
22.用于制备用于提高对象肠道菌群chao、ace和shannon指数，即增加对象肠道菌群中的otu总数、提升对象肠道菌群的丰富度的组合物中的用途；
23.用于制备用于提高对象拟杆菌门(bacteroidetes)、疣微菌门及放线菌门中一种
或几种的丰度的组合物中的用途；
24.用于制备用于提高对象放线菌门嗜粘蛋白阿克曼菌(akkermansia)、毛螺菌(lachnospiraceae)、s24-7菌及颤螺旋菌(oscillosporia)中一种或几种的丰度的组合物中的用途；
25.用于制备用于降低肠道菌属中厚壁菌门的丰度的组合物中的用途；
26.用于制备用于降低肠道菌属中髌骨菌门和脱硫杆菌中一种或几种的丰度的组合物中的用途；
27.用于制备用于降低肠道菌属中多尔氏菌(dorea)、巨球型菌(megasphaera)、布劳特氏菌(blautia)和瘤胃球菌(ruminococcus)中一种或几种的丰度的组合物中的用途；
28.用于制备用于促进对象肝脏中cyp7a1和cyp27a1的表达，促进对象肝脏fxr的表达、抑制对象肠道fxr的蛋白表达，和/或，促进对象肠道中tgr5的表达的组合物中的用途；
29.在制备用于对象减肥的组合物中的用途；优选地，在制备用于减少婴幼儿肥胖，以预防其成人期发生肥胖的组合物中的用途；
30.在制备用于预防或治疗对象肝脏疾病如酒精性肝病的组合物中的应用；
31.在制备增加婴幼儿肠道菌群多样性，从而预防与肠道菌群多样性延迟相关的过敏、哮喘和营养不良的组合物中的应用。
32.本发明第三方面提供一种一种食品、营养剂或药品，其含有前述任一油脂组合物；优选地，食品选自奶粉，尤其是婴幼儿奶粉，食用油，面制品，油炸食品和婴幼儿辅食；营养剂包括代餐食品和健身用的营养剂；药品为降血脂药或降糖药。
33.本发明第四方面提供一种婴幼儿配方奶粉，其含有前述任一种油脂组合物；优选地，婴幼儿配方奶粉中还含有生牛乳、乳糖、白砂糖、葡萄糖浆、玉米糖浆、果糖和麦芽糊精中的一种或多种。
附图说明
34.图1：不同油脂组合物中对sd大鼠血清生化指标的影响。a、sd大鼠血清中甘油三酯(tag)含量变化图；b、sd大鼠血清中总胆固醇(tc)含量变化图；c、sd大鼠血清中高密度脂蛋白-胆固醇(hdl-c)含量变化图；d、sd大鼠血清中低密度脂蛋白-胆固醇(ldl-c)含量变化图。
35.图2：油脂组合物产品大鼠血清胆汁酸与血清生化指标的相关性分析结果。
36.图3：不同油脂组合物对sd大鼠胆酸合成蛋白和受体蛋白表达量的影响。a、胆酸合成蛋白cyp7a1表达含量变化图；b、胆酸合成蛋白cyp27a1表达含量变化图；c、肠道fxr(lleum fxr)表达含量变化图；d、肝脏fxr(liver fxr)表达含量变化图；e、结肠tgr5表达含量变化图。
37.图4：不同油脂组合物对sd大鼠肠道菌群多样性和组成结构的影响。a、肠道菌群chao含量变化图；b、肠道菌群ace含量变化图；c、shannon指数变化图；d、simpson指数变化图。
38.图5：不同油脂组合物对sd大鼠肠道菌群(门水平)组成结构的影响。a、厚壁菌门相对丰度变化图；b、疣微菌门相对丰度变化图；c、放线菌门相对丰度变化图；d、拟杆菌门相对丰度变化图；e、变形菌门相对丰度变化图；f、厚壁菌门/拟杆菌门相对丰度比值变化图；g、
髌骨细菌相对丰度变化图；h、脱硫杆菌相对丰度变化图。
39.图6：油脂组合物产品对sd大鼠肠道菌群(属水平)组成结构的影响。a、巨球型菌相对丰度变化图；b、s24-7菌属相对丰度变化图；c、布劳特氏菌相对丰度变化图；d、拟杆菌门相对丰度变化图；e、瘤胃球菌属相对丰度变化图；f、嗜粘蛋白阿克曼菌属相对丰度变化图；g、毛螺菌属相对丰度变化图、h、颤螺旋菌相对丰度变化图；i、多尔氏菌属相对丰度变化图。
具体实施方式
40.应理解，在本发明范围中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成优选的技术方案。
41.油脂组合物
42.适用于本发明的油脂组合物，油脂组合物的脂肪酸组成中，sn-2 c16:0的含量为25～50wt％，优选为30～38wt％；优选地，sn-2 c16:0占比为55～65wt％，优选为55～62wt％。
43.在一些实施方案中，本发明的油脂组合物中，sfa的含量为30～40wt％，mufa的含量为35～45wt％，pufa的含量为18～25wt％。优选地，本发明的油脂组合物中，sfa的含量为33～3835～40wt％，mufa的含量为37～42wt％，pufa的含量为20～24wt％。
44.在一些实施方案中，本发明的油脂组合物中，以脂肪酸总重计，c18:2n-6的含量为15～25wt％，c18:3n-3的含量为1～5wt％；优选地，以脂肪酸总重计，c18:2n-6的含量为18～23wt％，c18:3n-3的含量为1.5～3.5wt％；
45.在一些实施方案中，本发明的油脂组合物中，油脂组合物的脂肪酸组成还具有以下特征中的一种或多种：18～30wt％、优选22～36wt％的c16:0，35～45wt％、优选38～43wt％的c18:1，2.5～4.0wt％的c14:0，3～6wt％的c18:0，和1.5～3.5wt％的c12:0。
46.在一些实施方案中，可通过混合原料油脂来制备得到本发明的油脂组合物。合适的原料油脂包括但不限于植物油、乳脂和结构脂。植物油可以是本领域奶粉配方中常用的植物油，包括但不限于菜籽油、葵花籽油、高油酸葵花籽油、大豆油、玉米油、椰子油、棕榈仁油、亚麻籽油、棕榈油、核桃油、沙棘油和元宝枫油中的一种或多种。乳脂包括但不限于牛乳脂和/或羊乳脂。结构脂包括但不限于milkopas结构脂1、milkopas结构脂2、milkopas结构脂3和milkopas结构脂4。原料油脂还可包括藻油和鱼油等。可将这些原料油脂以一定的比例混合。该比例的选择应确保所得油脂组合物中的sn-2 c16:0的含量及sn-2 c16:0占比在本发明所限定的范围内。
47.在一些实施方案中，本发明的油脂组合物含有植物油、乳脂和结构脂其中，以油脂组合物总重计，植物油的含量为30～80wt％、优选35～55wt％，乳脂的含量为15～28wt％、优选15～25wt％，结构脂的含量为30～40wt％、优选32～38wt％；
48.优选地，植物油含有0～15wt％、优选8～10wt％的菜籽油，20～50wt％、优选23～45wt％的葵花籽油和/或高油酸葵花籽油，1～10wt％、优选2～7wt％的椰子油和/或棕榈仁油，以及2～3wt％的亚麻籽油，重量百分比以油脂组合物总重计。
49.在一些实施方案中，本发明的油脂组合物含有占油脂组合物总重10～25wt％、优选13～24wt％的opl+opo。
50.应理解，本文中，o代表油酸，p代表棕榈酸，l代表亚油酸。opo为1和3位为油酸、2位
为棕榈酸的甘油三酯，opl为1位为油酸、2位为棕榈酸、3位为亚油酸的甘油三酯。
51.用途
52.本发明发现，本发明油脂组合物中的高sn-2 c16:0的含量及sn-2 c16:0占比，可以降低对象血清中总甘油三酯、总胆固醇及低密度脂蛋白-胆固醇含量，提高对象血清中高密度脂蛋白-胆固醇含量，增加对象血清中总胆汁酸含量和牛磺酸结合型胆汁酸含量，提高对象肠道中总胆汁酸含量、促进胆汁酸从粪便中排泄。
53.此外，本发明还发现，油脂组合物中的高sn-2 c16:0的含量及sn-2 c16:0占比可增加对象肠道菌群chao、ace和shannon指数，即油脂组合物中的高sn-2 c16:0的含量及sn-2 c16:0占比可增加对象肠道菌群中的otu总数、提升对象肠道菌群的丰富度，从而增加肠道菌群的多样性。
54.因此，本发明的油脂组合物可用于下述任意一项或多项用途：
55.用于制备用于降低对象血清中总甘油三酯、总胆固醇及低密度脂蛋白-胆固醇含量，提高对象血清中高密度脂蛋白-胆固醇含量的组合物中的用途；
56.用于制备用于增加对象血清中总胆汁酸含量和牛磺酸结合型胆汁酸含量的组合物中的用途；
57.用于制备用于提高对象血清中游离胆汁酸鹅脱氧胆酸、脱氧胆酸、石胆酸、熊脱氧胆酸、猪脱氧胆酸、α鼠胆酸及ω鼠胆酸中的一种或多种的水平，以及结合胆汁酸牛磺脱氧胆酸、牛磺鹅脱氧胆酸、牛磺熊脱氧胆酸、牛磺α鼠胆酸、牛磺β鼠胆酸、牛磺ω鼠胆酸中的一种或多种的水平；
58.用于制备用于提高对象肠道中总胆汁酸含量、促进胆汁酸从粪便中排泄的组合物中的用途；
59.用于制备用于提高对象肠道中游离胆汁酸胆酸、脱氧胆酸、石胆酸、熊脱氧胆酸、猪脱氧胆酸及ω鼠胆酸中的一种或多种的水平，以及结合型胆汁酸牛磺胆酸、牛磺鹅脱氧胆酸及牛磺熊脱氧胆酸中的一种或多种的水平的组合物中的用途；
60.用于制备用于提高对象肠道菌群chao、ace和shannon指数，即增加对象肠道菌群中的otu总数、提升对象肠道菌群的丰富度的组合物中的用途；
61.用于制备用于提高对象拟杆菌门(bacteroidetes)、疣微菌门及放线菌门的丰度的组合物中的用途；
62.用于制备用于提高对象放线菌门嗜粘蛋白阿克曼菌(akkermansia)、毛螺菌(lachnospiraceae)、s24-7菌及颤螺旋菌(oscillosporia)的丰度的组合物中的用途；
63.用于制备用于降低肠道菌属中厚壁菌门的丰度的组合物中的用途；
64.用于制备用于降低肠道菌属中髌骨菌门和脱硫杆菌的丰度的组合物中的用途；
65.用于制备用于降低肠道菌属中多尔氏菌(dorea)、巨球型菌(megasphaera)、布劳特氏菌(blautia)和瘤胃球菌(ruminococcus)的丰度的组合物中的用途；
66.用于制备用于促进对象肝脏中cyp7a1和cyp27a1的表达，促进对象肝脏fxr的表达、抑制对象肠道fxr的蛋白表达，和/或，促进对象肠道中tgr5的表达的组合物中的用途；
67.在一些实施方案中，本发明还提供本发明的油脂组合物在制备用于减肥的组合物中的用途。本文中，对象包括可以是任何感兴趣的对象，尤其指哺乳动物，更具体而言，对象包括人，宠物如猫、狗等。在一些实施方案中，对象为人类婴幼儿。研究表明，婴幼儿时期的
肥胖与其成年后肥胖发生率有关。因此，在这些实施方案中，采用本发明的油脂组合物可减少婴幼儿肥胖，有助于预防其成人期发生肥胖。
68.前期研究结果表明，髌骨菌门的相对丰度与肝脏疾病相关，例如与酒精性肝病指标mda、ast和tg呈正相关性，也与甘油三酯呈正相关性。因此，在一些实施方案中，本发明还提供本文任一实施方案的油脂组合物在制备用于预防或治疗肝脏疾病如酒精性肝病(如酒精性脂肪肝)中的应用。
69.另外，婴儿是肠道菌群建立的关键时期，肠道菌群多样性延迟与过敏、哮喘和营养不良有关。因此，本发明的油脂组合物有助于增加肠道菌群的多样性，从而预防与肠道菌群多样性延迟相关的过敏、哮喘和营养不良。因此，在一些实施方案中，本发明还提供本文任一实施方案的油脂组合物在制备增加婴幼儿肠道菌群多样性，从而预防与肠道菌群多样性延迟相关的过敏、哮喘和营养不良的组合物中的应用。
70.用于制备用于降低对象肝脏和肾脏周围白色脂肪含量的组合物中的用途；
71.用于制备用于降低对象血清中总甘油三酯、总胆固醇及低密度脂蛋白-胆固醇含量，提高对象血清中高密度脂蛋白-胆固醇含量的组合物中的用途；
72.用于制备用于增加对象血清中总胆汁酸含量和牛磺酸结合型胆汁酸含量的组合物中的用途；
73.用于制备用于提高对象血清中游离胆汁酸鹅脱氧胆酸、脱氧胆酸、石胆酸、熊脱氧胆酸、α鼠胆酸、β鼠胆酸及ω鼠胆酸中的一种或多种的水平，以及结合胆汁酸牛磺胆酸、牛磺脱氧胆酸、牛磺鹅脱氧胆酸、牛磺熊脱氧胆酸、牛磺α鼠胆酸、牛磺β鼠胆酸和牛磺ω鼠胆酸中的一种或多种的水平；
74.用于制备用于提高对象肠道中总胆汁酸含量、促进胆汁酸从粪便中排泄的组合物中的用途；
75.用于制备用于提高对象肠道中游离胆汁酸胆酸、脱氧胆酸、石胆酸及熊脱氧胆酸中的一种或多种的水平，以及结合型胆汁酸牛磺脱氧胆酸、牛磺鹅脱氧胆酸及牛磺熊脱氧胆酸中的一种或多种的水平的组合物中的用途；
76.用于制备用于提高对象肠道菌群chao、ace和shannon指数，即增加对象肠道菌群中的otu总数、提升对象肠道菌群的丰富度的组合物中的用途；
77.用于制备用于提高对象拟杆菌门(bacteroidetes)、放线菌门(actinobacteria)和变形菌门(proteobacteria)的丰度，降低髌骨细菌(patescibacteria)和脱硫杆菌(desulfobacter)的丰度的组合物中的用途；
78.用于制备用于降低肠道菌属中乳酸杆菌属和拟杆菌属的相对丰度，增加梭菌相对丰度的组合物中的用途；
79.用于制备用于提高嗜粘蛋白阿克曼菌和颤螺旋菌的相对丰度，降低布劳特氏菌、多尔氏菌和瘤胃球菌的相对丰度的组合物中的用途；
80.用于制备用于促进对象肝脏中cyp7a1和cyp27a1的表达，促进对象肝脏fxr的表达、抑制对象肠道fxr的蛋白表达，和/或，促进对象肠道中tgr5的表达的组合物中的用途。
81.在一些实施方案中，本发明还提供本发明的油脂组合物在制备用于减肥的组合物中的用途。本文中，对象包括可以是任何感兴趣的对象，尤其指哺乳动物，更具体而言，对象包括人，宠物如猫、狗等。在一些实施方案中，对象为人类婴幼儿。研究表明，婴幼儿时期的
肥胖与其成年后肥胖发生率有关。因此，在这些实施方案中，采用本发明的油脂组合物可减少婴幼儿肥胖，有助于预防其成人期发生肥胖。
82.前期研究结果表明，髌骨菌门的相对丰度与肝脏疾病相关，例如与酒精性肝病指标mda、ast和tg呈正相关性，也与甘油三酯呈正相关性。因此，在一些实施方案中，本发明还提供本文任一实施方案的油脂组合物在制备用于预防或治疗肝脏疾病如酒精性肝病(如酒精性脂肪肝)中的应用。
83.另外，婴儿是肠道菌群建立的关键时期，肠道菌群多样性延迟与过敏、哮喘和营养不良有关。因此，本发明的油脂组合物有助于增加肠道菌群的多样性，从而预防与肠道菌群多样性延迟相关的过敏、哮喘和营养不良。因此，在一些实施方案中，本发明还提供本文任一实施方案的油脂组合物在制备增加婴幼儿肠道菌群多样性，从而预防与肠道菌群多样性延迟相关的过敏、哮喘和营养不良的组合物中的应用。
84.应理解，本文各用途中的组合物可以是油脂组合物、食品、营养剂以及药物组合物等。
85.本文中，cyp7a1、cyp27a1、fxr和tgr5具有本文所周知的含义，分别指细胞色素p450家族成员7a1、细胞色素p450家族成员27a1、法尼醇x受体、g蛋白偶联胆汁酸受体。这些蛋白或其基因序列可从已知的数据库中获得。
86.食品、营养剂和药品
87.本发明的油脂组合物可作为油脂，用于各类食品、营养剂和药品中。
88.本文的食品可以是常规的各类食品，包括但不限于奶粉(尤其是婴幼儿奶粉)、油、面制品、油炸食品和婴幼儿辅食等。优选地，奶粉是婴幼儿配方奶粉或婴幼儿辅食，其中的油脂的一部分或全部为本发明的油脂组合物。
89.本文的营养剂可以是例如代餐食品，健身用的营养剂等。
90.本发明的药品可以使例如，降血脂药或降糖药。
91.本文中，奶粉除含有上述油脂组合物外，还可以包含常规奶粉的组成成分，包括但不限于生牛乳、乳糖、白砂糖、葡萄糖浆、玉米糖浆、果糖、麦芽糊精、植物油和香精香料。在一些实施方案中，配方奶粉的成分包括以下成分中的一种或多种：脱盐乳清粉、精炼植物油、脱脂乳粉、乳糖、1,3-二油酸-2-棕榈酸甘油三酯、低聚半乳糖(gos)、低聚果糖(fos)、浓缩乳清蛋白粉、二十二碳六烯酸(dha)、花生四烯酸(aa)、益生菌(动物双歧杆菌bb-12，活菌数不少于1
×
106cfu/g)、碳酸钙、硫酸镁、硫酸亚铁、硫酸锰、硫酸铜、碘化钾、亚硒酸钠、醋酸维生素a、维生素d3、l-抗坏血酸、l-抗坏血酸钠、dl-α-醋酸生育酚、混合生育酚浓缩物、盐酸硫胺素、核黄素、盐酸吡哆醇、氰钴胺、植物甲萘醌、叶酸、烟酰胺、d-泛酸钙、d-生物素、叶黄素、l-肉碱酒石酸盐、氯化胆碱、肌醇、牛磺酸、核苷酸(5'单磷酸腺苷、5'-胞苷酸二钠、5'-鸟苷酸二钠、5'-尿苷酸二钠、5'-肌苷酸二钠)、氯化钾、柠檬酸钠、大豆磷脂、柠檬酸和氢氧化钾。
92.下文将以具体实施例的方式阐述本发明。应理解，这些实施例仅仅是阐述性的，并不意图限制本发明的范围。实施例中所用到的方法、试剂和仪器，除非另有说明，否则为本领域常规的方法、试剂和仪器。
93.实施例1：动物饲养
94.30只雄性sprague-dawley(sd)大鼠(21日龄，101.55
±
4.01g)购自中国科学院上
海实验动物中心。首先，大鼠经过5天的适应性喂养，将其随机分为3组(每组10只)：对照组(control组)、类母乳脂a组和b组，并进行4周的实验饲料喂养。实验期间每3天记录一次动物体重和摄食量。3组实验油脂的原料和用量(质量百分百)见表1-1，脂肪酸组成(质量百分百)见表1-2，各组动物饲料配方见表2。
95.表1-1
96.油脂名称controlab菜籽油
ꢀꢀ
9％葵花籽油/高油酸葵花籽油41％43％25％椰子油/棕榈仁油8％7％2％亚麻籽油3％3％2％乳脂14％15％24％棕榈油34％
ꢀꢀ
结构脂1 32％ 结构脂2
ꢀꢀ
38％
97.上述原料均购自秦皇岛金海特油食品工业有限公司。
98.表1-2
[0099] controlabc18:2 n-6(％)19.2319.9820.36c18:3 n-3(％)3.001.882.05sfa36.2235.3534.53mufa40.8540.8840.95pufa21.9622.8723.38sn-2 c16:0(％)10.1631.9536.07sn-2 c16:0占比(％)15.5447.9354.36
[0100]
*：sn-2 c16:0占比(％)指sn-2 c16:0占所有c16:0的含量。
[0101]
表2：动物饲料配方
[0102]
[0103][0104]
实施例2：动物饲养及处死
[0105]
实验饲料喂养4周后，禁食12小时，使用二氧化碳麻醉后进行大鼠解剖。抽取大鼠血液，并在4℃下3500rpm离心10min，取上层血清。收集大鼠的肝脏和肠道内容物，使用生理盐水清洗后收集结肠组织，将上述收集的所有样品储存在-80℃以供进一步分析。
[0106]
实施例3：油脂组合物中sn-2 c16:0的含量及sn-2 c16:0占比对sd大鼠血清生化指标的影响
[0107]
油脂组合物产品对大鼠血清中甘油三酯、总胆固醇、低密度脂蛋白-胆固醇及高密度脂蛋白-胆固醇含量的影响见图1。与control组相比，a组和b组大鼠血清中甘油三酯从0.37mmol/l分别降至0.32mmol/l和0.29mmol/l(p《0.05)，b组大鼠血清中总胆固醇从1.88mmol/l降至1.45mmol/l(p《0.05)，a组和b组大鼠血清中高密度脂蛋白-胆固醇从0.19mmol/l分别升至0.22mmol/l和0.25mmol/l(p《0.05)，上述结果表明提高类母乳脂中sn-2 c16:0含量可显著降低大鼠血清中甘油三酯、总胆固醇含量，显著提高大鼠血清中高密度脂蛋白-胆固醇含量(p《0.05)。血清中甘油三酯和总胆固醇水平是反映机体血脂代谢水平最常用的两个生化指标，低密度脂蛋白-胆固醇和高密度脂蛋白-胆固醇分别是运输胆固醇到肝外组织和将胆固醇从肝外组织转运到肝脏进行代谢的主要运载工具，上述实验结果反映出类母乳脂中sn-2 c16:0含量会影响大鼠体内的脂质代谢。
[0108]
实施例4：油脂组合物中sn-2 c16:0的含量及sn-2 c16:0占比对sd大鼠血清中胆汁酸含量的影响
[0109]
使用超高效液相色谱-三重四极杆质谱联用仪(uhplc 30a/quadrupole 5500,shimadzu&sciex,japan)对大鼠血清中胆汁酸进行定量。其中，血清胆汁酸的前处理如下：取50μl血清样品于离心管，加入200μl蛋白沉淀液(甲醇：乙腈＝5:3，含50ng/ml霉酚酸)，充分涡旋，于-20℃静置1h，12000rpm离心15min，取上清液90μl加入10μl甘氨熊脱氧胆酸(gudca)内标溶液(250ng/ml)，充分混匀后上机检测。液相条件：色谱柱：acquity uplc beh c18 2.1
×
100mm,1.7m；柱温：40℃；流动相a:0.1％(v/v)甲酸-乙腈溶液；b:0.1％(v/v)甲酸-水溶液。洗脱梯度见表3。
[0110]
表3：液相流动相洗脱梯度
[0111]
时间(min)a(％)b(％)流速(ml/min)09550.419550.4440600.465950.485950.48.19550.4109550.4
[0112]
质谱条件：负离子模式进行定量测试，离子源esi。气帘气：35psi，离子化电压：-4500v，去溶剂温度：500℃，雾化气：55psi，辅助加热气：55psi，采用多重反应监测(mrm)器对样品进行分析。原始数据通过analyst 1.6.3(ab sciex)软件进行分析，结果见表4。
[0113]
表4：油脂组合物中sn-2 c16:0的含量及sn-2 c16:0占比对sd大鼠血清中胆汁酸含量的影响(nmol/l)
[0114] controlab胆酸976.65a±
115.20930.63a±
348.441085.56a±
162.19鹅脱氧胆酸347.65a±
51.1451.25b±
90.51456.95b±
81.34脱氧胆酸36.27a±
6.6445.64
ab
±
36.0757.38b±
8.11石胆酸7.79a±
1.147.27a±
4.1111.30b±
1.94熊脱氧胆酸25.71a±
2.5728.68
ab
±
32.8432.82b±
3.61牛磺胆酸508.95a±
72.4507.15a±
55.9571.05a±
110.05牛磺脱氧胆酸57.36a±
10.177.15a±
11.8137.42b±
22.85牛磺鹅脱氧胆酸85.38a±
12.5107.35
ab
±
13.96141.32b±
27.75牛磺熊脱氧胆酸4.05a±
0.758.65
ab
±
1.1213.19b±
2.75甘氨胆酸8.74b±
0.876.74a±
1.067.09b±
1.01甘氨石胆酸0.51a±
0.080.11a±
0.010.38a±
0.05甘氨脱氧胆酸0.93a±
0.131.07a±
0.160.82a±
0.15甘氨鹅脱氧胆酸0.61a±
0.071.06a±
0.174.16c±
0.55甘氨熊脱氧胆酸1.18a±
0.130.49a±
0.111.52a±
0.15猪脱氧胆酸64.29a±
12.8683.56a±
8.28200.09b±
28.01牛磺α鼠胆酸25.95a±
4.9576.05b±
10.2483.75b±
11.55牛磺β鼠胆酸69.47a±
12.45106.15
ab
±
14.05130.05b±
25.5
牛磺ω鼠胆酸105.46a±
19.35141.43a±
24.43461.45b±
33.5α鼠胆酸124.36a±
13.41142.28b±
68.65155.88b±
17.26β鼠胆酸217.43a±
36.41219.29a±
17.22295.79a±
48.38ω鼠胆酸249.55a±
26.29388.79b±
57.5414.33b±
41.55
[0115]
a,b
表示各组间差异显著性(spss软件，p＜0.05)。
[0116]
如表4所示，与control组大鼠血清胆汁酸含量相比，a组和b组大鼠血清游离胆汁酸中鹅脱氧胆酸、脱氧胆酸、石胆酸、熊脱氧胆酸、猪脱氧胆酸、α鼠胆酸和ω鼠胆酸水平显著提高(p《0.05)；与control组大鼠血清胆汁酸含量相比，a组和b组大鼠血清结合胆汁酸水平显著提高，具体为牛磺脱氧胆酸、牛磺鹅脱氧胆酸、牛磺熊脱氧胆酸、牛磺α鼠胆酸、牛磺β鼠胆酸、牛磺ω鼠胆酸(p《0.05)。由于胆汁酸是重要的信号调控因子，在糖脂代谢及能量稳态中发挥重要的信号调控作用。大鼠血清胆汁酸与血清生化指标的相关性分析结果见图2，在血清胆汁酸与上述2中血清生化指标的相关分析中发现：提高类母乳脂中sn-2c16:0含量，大鼠血清中总胆汁酸和牛磺型结合胆汁酸含量与血清中甘油三酯、总胆固醇、低密度脂蛋白-胆固醇的含量呈显著负相关，而与血清中高密度脂蛋白-胆固醇的含量呈显著正相关(p《0.05)。
[0117]
实施例5：油脂组合物中sn-2 c16:0的含量及sn-2 c16:0占比对sd大鼠肠道内容物中胆汁酸含量的影响
[0118]
使用超高效液相色谱-三重四极杆质谱联用仪(uhplc 30a/quadrupole 5500,shimadzu&sciex,japan)对大鼠肠道内容物中胆汁酸进行定量。肠道内容物胆汁酸的前处理如下：称取50mg肠道内容物，加入1ml蛋白沉淀液(甲醇：乙腈＝5:3，含50ng/ml霉酚酸)，将其置于2ml研磨管加入2个研磨珠，研磨匀浆，后超声处理1h，在12000rpm离心10min，取上清液90μl加入10μl甘氨熊脱氧胆酸(gudca)内标溶液(250ng/ml)，充分混匀后上机检测。液相条件质谱条件同实施例4中所列。结果见表5。
[0119]
表5类母乳脂中sn-2 c16:0的含量及sn-2 c16:0占比对sd大鼠肠道内容物中胆汁酸含量的影响(nmol/g)
[0120]
[0121][0122]
a,b,c
表示各组间差异显著性(spss软件，p＜0.05)。
[0123]
如表5所示，与control组大鼠肠道内容物中胆汁酸含量相比，a组和b组大鼠肠道内容物中游离型胆汁酸水平显著提高的分别是：胆酸、脱氧胆酸、石胆酸、熊脱氧胆酸、猪脱氧胆酸及ω鼠胆酸(p《0.05)。结合型胆汁酸水平显著提高的分别是：牛磺胆酸、牛磺鹅脱氧胆酸及牛磺熊脱氧胆酸(p《0.05)。提高类母乳脂中sn-2 c16:0含量可显著提高大鼠肠道内容物中总胆汁酸含量，增加了胆汁酸通过粪便的排泄。
[0124]
实施例6：油脂组合物中sn-2 c16:0的含量及sn-2 c16:0占比对sd大鼠胆酸合成蛋白和受体蛋白表达量的影响
[0125]
利用elisa试剂盒对大鼠肝脏中促进胆固醇转变成胆汁酸的限速酶cyp7a1和cyp27a1、肝脏中胆汁酸受体蛋白fxr、结肠中胆汁酸受体蛋白fxr和tgr5的表达量分别进行测定。类母乳脂产品对sd大鼠胆酸合成蛋白cyp7a1和cyp27a1表达量的影响见图3a和图3b。与control组相比，a组和b组大鼠cyp7a1表达量从12.39u/l分别升至14.60u/l和16.41u/l；a组和b组大鼠cyp27a1表达量从13.66u/l分别升至15.93u/l和17.61u/l。上述结果表明：增加类母乳脂中sn-2 c16:0含量可促进大鼠肝脏中cyp7a1和cyp27a1的表达。cyp7a1和cyp27a1是肝脏中促进胆固醇转变成胆汁酸的限速酶，增加了肝脏中胆汁酸的合成，该结果与前述的血清胆汁酸结果相吻合。此外，cyp7a1和cyp27a1表达量与血清中甘油三酯、总胆固醇、低密度脂蛋白-胆固醇的含量呈负相关，与血清中高密度脂蛋白-胆固醇的含量呈正相关。
[0126]
类母乳脂产品对sd大鼠结肠和肝脏中fxr表达量的影响见图3c和图3d。与control组相比，b组大鼠肝脏fxr表达量从250.68pg/ml升至332.03pg/ml(p《0.05)；肠道fxr表达量从699.73pg/ml降至568.88pg/ml(p《0.05)，上述结果表明：增加类母乳脂中sn-2 c16:0含量可促进大鼠肝脏fxr的表达，抑制肠道fxr的蛋白表达(p《0.05)。fxr广泛分布在肝、小肠等富含胆汁酸的器官中，可调控胆汁酸的合成、代谢及转运。在结肠中，fxr可诱导成纤维细胞生长因子15/19(fgf15/19)与肝细胞质膜上的fgfr4/β-klotho复合物结合，启动细胞外信号调节激酶1/2(erk1/2)和c-jun氨基末端激酶(jnk)信号通路，进而抑制cyp7a1表达和胆汁酸合成，熊脱氧胆酸，牛磺熊脱氧胆酸和牛磺鹅脱氧胆酸是fxr受体的拮抗剂，这与本研究观察到的结果一致。而在肝脏中，激活fxr可诱导小异二聚体伴侣(shp)的表达，shp增加可与肝受体同系物-1(lrh-1)形成抑制性复合物，此复合物可阻断cyp7a1的转录，从而抑制胆汁酸合成。这与本实验结果不同，这是由于结肠fxr激活比肝fxr激活更能抑制cyp7a1介导的胆汁酸合成。fxr最有效的内源性配体是鹅脱氧胆酸，这与本研究中增加血清中鹅脱氧胆酸含量，从而促进肝脏fxr蛋白的表达结果相一致。control组大鼠肝脏中fxr表达及鹅脱氧胆酸的减少可能导致肥胖易感的表型，这是由于肝脏中fxr的表达与脂质代谢密切相
关，通过激活肝脏中fxr可以抑制脂质合成的关键基因及其调控因子的表达，从而减少脂质在肝脏的积累。
[0127]
类母乳脂产品对sd大鼠结肠中tgr5的表达量影响见图3e。与control组相比，b组大鼠结肠中tgr5表达量从6.62nmol/l升至9.71nmol/l(p《0.05)；上述结果表明：增加类母乳脂中sn-2 c16:0含量可促进大鼠肠道中tgr5的表达(p《0.05)。tgr5受体通过刺激肠内分泌细胞l细胞(glp-1)的释放，减少脂肪生成并诱导脂肪酸氧化，从而改善肝脏脂肪的变性。不同的胆汁酸可以作为信号因子通过tgr5受体调节机体代谢，对tgr5激动能力最强的是石胆酸，熊脱氧胆酸也具有tgr5受体的亲和性，最近的研究也表明，给小鼠灌胃熊脱氧胆酸和石胆酸的混合物可以改善高脂饮食诱导的肥胖及脂肪肝变性。这与我们的研究结果增加类母乳脂中sn-2 c16:0含量，大鼠肠道内容物中熊脱氧胆酸和石胆酸含量升高，促进大鼠结肠中胆酸受体tgr5的表达，从而调节大鼠脂质代谢的结果相一致。
[0128]
实施例7：油脂组合物中sn-2 c16:0的含量及sn-2 c16:0占比对sd大鼠肠道菌群多样性和组成结构的影响
[0129]
采用ctab方法提取大鼠肠道内容物菌群的dna，之后利用琼脂糖凝胶电泳检测dna的纯度和浓度，取适量的样本dna于离心管中，使用无菌水稀释样本至1ng/μl。以16s高变区中的v3+v4区为目标测序片段，采用带barcode的特异引物341f(5'-cctaygggrbgcascag-3')和806r(5'-ggactacnngggtatctaat-3')对目标片段进行pcr扩增，每个样品进行3次重复。pcr扩增产物通过质量分数2％琼脂糖凝胶电泳进行检测，并对目标片段进行回收、纯化。对纯化后的pcr产物使用truseq
tm dna sample prep kit建库试剂盒进行文库构建，构建好的文库经过qubit和qpcr定量，文库合格后，在illumina miseq进行上机测序。
[0130]
根据barcode序列从下机数据中拆分出各样本数据，利用trimmomatic软件对双端序列分别进行去杂后，使用flash软件对每个样本的高质量双端reads进行拼接，得到最终的有效数据(effective tags)。利用uparse软件对所有样本的全部effective tags进行聚类，默认以97％的一致性将序列聚类成为otus(operational taxonomic units)。选取otu代表序列，与silva数据库比对，进行物种注释分析，获得分类学信息并在门、科、属分类水平下统计各样本的群落组成。使用mothur软件计算shannon指数、simpson指数、ace指数、chao指数。
[0131]
类母乳脂产品对sd大鼠肠道菌群alpha多样性指数的影响见图4。由图4a和图4b可知，增加类母乳脂中sn-2 c16:0含量可增加大鼠肠道菌群ace和shannon指数(p《0.05)，ace是用来估计群落中otu数目的指数。shannon指数是用来估算样品中微生物多样性指数之一，shannon值越大，说明菌群多样性越高。结果表明：增加类母乳脂中sn-2 c16:0含量可增加大鼠肠道菌群中otu总数，提升大鼠肠道菌群的丰富度(p《0.05)。
[0132]
类母乳脂产品对sd大鼠肠道菌群组成结构的影响见图5，三组大鼠肠道菌群中丰度较高的菌群为厚壁菌门(firmicutes)、疣微菌门(verrucomicrobia)、放线菌门(actinobacteria)，拟杆菌门(bacteroidetes)和变形菌门(proteobacteria)；从图5a中可看出，与control组相比，b组大鼠厚壁菌门相对丰度和厚壁菌门/拟杆菌门相对丰度的比例从71.69％和101.9分别下降至52.8％和10.98(p《0.05)、拟杆菌门和疣微菌门相对丰度从0.75％和21.35％上升至4.73％和37.8％(p《0.05)。前期的研究结果表明：厚壁菌门和拟杆菌门存在一种相互促进的共生关系，共同促进宿主吸收或储存能量，拟杆菌门降低、厚壁菌
门增加及厚壁菌门/拟杆菌门比例的升高都会导致肥胖，而疣微菌门对保护大鼠免受高脂肪饮食引起的肥胖、肠道炎症和胰岛素抵抗有关，说明提高类母乳脂中sn-2 c16:0含量可显著调节肠道菌群中与肥胖、脂质代谢有关的菌门(p《0.05)。
[0133]
此外，与control组相比，b组大鼠放线菌门的相对丰度从3.40％上升至4.88％(p《0.05)、a组大鼠变形菌门相对丰度从0.50％上升至1.01％(p《0.05)。而在肠道菌对胆汁酸代谢的第二条途径中氧化胆酸上的醛基需要hsdh酶，这种酶则在厚壁菌，放线菌，拟杆菌及变形菌四种肠道菌门中存在，说明提高类母乳脂中sn-2 c16:0含量可显著调节肠道菌群中与胆酸代谢有关的菌门(p《0.05)。
[0134]
除上述菌门外，本研究还讨论了在门水平相对丰度较低但五组间仍有显著性差异的菌门：髌骨细菌(patescibacteria)和脱硫杆菌(desulfobacter)，从图中可以看出，与control组相比，b组大鼠的髌骨菌门和脱硫杆菌相对丰度从0.09％和0.01％分别降至0.02％和0.00％(p《0.05)。前期研究结果表明：髌骨菌门的相对丰度与肝脏疾病相关，且与甘油三酯呈正相关性，这与本实验结果中甘油三酯含量降低的趋势相符，而脱硫杆菌是会产生h2s气体的有害菌，总之，增加类母乳脂中sn-2 c16:0含量可显著调节肠道菌群中与肥胖、脂质代谢及胆汁酸代谢有关的菌门，抑制有害菌门的生长，对宿主肠道健康具有积极作用。
[0135]
依次对菌属进行差异性分析见图6：与control组相比，b组大鼠的嗜粘蛋白阿克曼菌(akkermansia)、毛螺菌(lachnospiraceae)、s24-7菌、颤螺旋菌(oscillosporia)的相对丰度显著升高(p《0.05)；多尔氏菌(dorea)、巨球型菌(megasphaera)、布劳特氏菌(blautia)和瘤胃球菌(ruminococcus)相对丰度显著降低(p《0.05)。上述菌属均是与肥胖症和脂质代谢有关的菌属，其中，嗜粘蛋白阿克曼菌通过激活回肠和结肠中参与葡萄糖和脂质转运和氧化(pgc-1α)的基因表达，降低脂质水平；且其可促进肝脏胆固醇转运基因(低密度脂蛋白受体)的表达，通过激活参与胆汁酸合成和转运相关基因调节胆汁酸代谢。毛螺菌和s24-7菌是肠道短链脂肪酸(如乙酸、丙酸和丁酸)的产生菌，这些短链脂肪酸具有调节肝脏脂质代谢和抑制体重增加的作用。颤螺旋菌的相对丰度与血清胆固醇含量呈负相关。而在巨球型菌丰度较高的患者中，肝性脑病更为常见。在肥胖症的发展过程中，布劳特氏菌、多尔氏菌和瘤胃球菌的相对丰度明显增加。上述结果都表明提高类母乳脂中sn-2 c16:0含量和可显著调节肠道菌群中与肥胖、脂质代谢有关的菌属(p《0.05)。
[0136]
综上，提高类母乳脂中sn-2 c16:0含量及sn-2 c16:0占比，会增加大鼠血清和肠道内容物中游离型胆汁酸和结合型胆汁酸含量。其中，肠道内容物中牛磺鹅脱氧胆酸及牛磺熊脱氧胆酸含量增加抑制肠道fxr-fgf15信号通路，肠道fxr-fgf15信号的抑制伴随着肝脏中胆汁酸合成途径相关酶cyp7a1和cyp27a1表达的增加，促进胆固醇转变成胆汁酸；同时血清中鹅去氧胆酸增加，激活肝脏fxr受体，从而减少脂质在肝脏的积累，降低血清胆固醇水平。肠道内容物中石胆酸和脱氧胆酸含量升高激活大鼠结肠中胆酸受体tgr5的表达,这种激活可能会上调偶联蛋白和线粒体肌酸激酶的表达，导致白色脂肪组织产热升高,减轻肥胖。
[0137]
进一步地，提高类母乳脂中sn-2 c16:0含量及sn-2 c16:0占比，对于肥胖、脂质代谢及胆汁酸代谢相关的肠道菌群具有显著调节作用，同时抑制有害菌门的生长，对宿主肠道健康具有积极作用。