1.本发明涉及食品和生物技术领域，尤其是一种黑木耳可溶性蛋白多糖复合物的制备方法。
背景技术：
2.黑木耳(auricularia auricular)又名木菌、光木耳、云耳、木蕊、木菌、树鸡等，分类上属于真菌门、担子菌纲、木耳目、木耳科、木耳属，是世界四大人工栽培食用菌之一；黑木耳含有占干重约11.66～17.74％的蛋白质，还含有占干重约63％的碳水化合物，其主要成分为多糖类物质。
3.黑木耳蛋白总氨基酸含量为75.83％左右，其中8种必需氨基酸含量约为26.35％(占比34.7％)，其含量丰富的天冬氨酸、谷氨酸和赖氨酸对人体发育和健康有重要作用。黑木耳蛋白具有易被人体吸收、不易热变性等优点。黑木耳蛋白中含有大量胶原蛋白，在食品、化妆品、保健品领域应用广泛。黑木耳蛋白中含有多种活性成分，例如酸性蛋白app，对鼠的红细胞有血凝作用，对淋巴细胞有很强的免疫活性，可促进脾细胞的繁殖。
4.黑木耳多糖主要成分为甘露糖、葡萄糖、木糖和己糖酸等，具有多种生理功效：通过对机体防御系统产生一定的作用而间接对肿瘤产生抑制效果；通过对机体细胞的损伤产生保护而延缓组织衰老；通过降低总胆固醇、甘油三酯和低密度脂蛋白含量而发挥抗血栓作用；通过抑制凝血酶活性和血小板凝集而发挥降血脂作用；通过增加胰岛素的分泌量降低机体餐后的血糖水平；对由高功率微波福射引发的机体损伤具有防护作用。
5.因此，开发黑木耳蛋白多糖复合物的生产技术及产品，对于促进黑木耳资源深度利用和食品工业发展具有重要意义。
6.国内目前已有多个关于食药用菌蛋白多糖复合物的专利，如cn1295247c、cn104922162b、cn103907738a、cn110903408b等。
7.而关于黑木耳蛋白多糖的专利，国内目前仅见：
8.cn1071060a公布了木耳和银耳菌丝体蛋白多糖酸法生产技术：以木耳和银耳菌丝体作原料，经破碎、水提取、酸沉淀和干燥制得蛋白多糖，含量达95％以上，该专利采用温和的水提取法，但未采用蛋白增溶技术，因此溶解度低、冲调性差，且酸沉淀法的蛋白得率较低。
9.cn105053461a公布了一种黑木耳蛋白糖的制作方法：将黑木耳粉与麦芽糖、蛋白质干、奶粉等，按一定比例复配成具有营养保健作用的食品，该专利未涉及蛋白和多糖的提取及增溶技术。
技术实现要素：
10.本发明的目的是在于克服、补充现有技术中存在的不足，提供一种黑木耳可溶性蛋白多糖复合物的制备方法，提供一种氮溶解指数高、溶解度大、冲调性好的新型食用菌蛋白多糖产品；该产品同时具备蛋白和多糖的多种营养和保健功效，作为食品和保健品领域
的新产品或新配料，具有广阔的应用前景。
11.本发明提供一种黑木耳可溶性蛋白多糖复合物的制备方法，该方法包括超微粉碎、高温处理、碱液浸提、化学改性、浓缩脱盐、喷雾干燥、物理筛分共七个工艺步骤，在确保提取收率前提下增加了产品溶解度，具有简单实用、适合工业化大规模生产的特点。
12.本发明采用的技术方案是：
13.一种黑木耳可溶性蛋白多糖复合物的制备方法，其中：采用黑木耳子实体、菌丝体或其残次菇为原料，依次通过超微粉碎、高温处理、碱液浸提、化学改性、浓缩脱盐、喷雾干燥和物理筛分，获得可溶性蛋白多糖复合物，具体制备步骤如下：
14.(1)超微粉碎
15.将黑木耳子实体、菌丝体或其残次菇原料，采用超微粉碎技术进行破壁处理，过300目筛，得到超微粉；
16.(2)高温处理
17.将超微粉在100～200℃高温处理1～10h；
18.(3)碱液浸提
19.将经过步骤(2)处理的超微粉中加入碱液调节ph至12，搅拌，离心，并将离心得到的菌渣加入去离子水搅拌均匀，再次离心，合并两次离心的上清液得到浸提液；
20.ph12的强碱性条件下，黑木耳蛋白分子处于溶融态，其三级结构解体而维持原有的一、二级结构；随着稀盐酸的缓慢滴加，水中离子强度发生改变，使得溶剂体系发生物理相变，水分子氢键发生重排而产生自由水，并渗透到蛋白质内部结构；同时以剪切、挤压、撞击为特征的机械搅拌造成分子水平上的胁迫，改变了蛋白的保守疏水结构、遏制其去离子化过程中复性、阻止聚集体形成；物理相变耦联机械胁迫机制能在维持蛋白一级机构的基础上实现二级结构的折叠-转角转变，最终形成聚集度较低的极性蛋白体颗粒，提高蛋白溶解度。
21.(4)化学改性
22.将浸提液中加入亚硫酸钠和氨基酸，溶解后滴加稀盐酸进行中和，并在30～60min内将浸提液ph值调节至ph 6～9，反应结束后，将料液升温至80～100℃，并保持5～10min，然后迅速冷却至室温；
23.(5)浓缩脱盐
24.将改性后的料液过陶瓷膜进行浓缩，并用去离子水洗涤浓缩液，直至浓缩液电导率小于4000us/cm；
25.(6)喷雾干燥
26.浓缩脱盐后的料液进行喷雾干燥，并收集水分含量小于10％的干燥粉末；
27.(7)物理筛分
28.将干燥粉末过100目筛，得到黑木耳可溶性蛋白多糖复合物。
29.优选的是，所述的黑木耳可溶性蛋白多糖复合物的制备方法，其中：所述步骤(1)中黑木耳子实体、菌丝体或其残次菇原料，包括含水的鲜品和经干燥处理后的干品。
30.优选的是，所述的黑木耳可溶性蛋白多糖复合物的制备方法，其中：所述步骤(3)中搅拌温度为25℃～40℃，搅拌时间为4～8h。
31.优选的是，所述的黑木耳可溶性蛋白多糖复合物的制备方法，其中：所述步骤(3)
中碱液为氢氧化钠、碳酸钠或碳酸氢钠的一种，所述碱液与物料的重量比为10:1～100:1，优选20:1，所述菌渣与去离子水的重量比为1:1～10:1，优选5:1。
32.优选的是，所述的黑木耳可溶性蛋白多糖复合物的制备方法，其中：所述步骤(3)中离心转速为9000～10000rpm，离心时间为5～10min。
33.优选的是，所述的黑木耳可溶性蛋白多糖复合物的制备方法，其中：所述步骤(4)中亚硫酸钠加入量为料液体积的0.01～0.1％，优选0.05％，氨基酸加入量为料液体积的0.001～0.1％，优选0.02％，所述氨基酸为蛋氨酸、胱氨酸和l-半胱氨酸的一种或几种，优选l-半胱氨酸。
34.蛋氨酸、胱氨酸和l-半胱氨酸均属于含硫氨基酸，分子内存在甲硫基和巯基，黑木耳蛋白也富含这三种氨基酸；在ph12强碱性溶融态下，黑木耳蛋白结构呈打开状态，导致其含硫基团与极性的亲水基团均暴露在外，从而易与外源氨基酸发生化学反应形成二硫键复合物，同时不同蛋白分子之间也能通过外源氨基酸的媒介作用形成复合物，使得其亲水基团不会再次折叠在内部；超分子结构共组装机制能在维持蛋白一级机构的基础上重组为相对展开的三维构象，导致其聚集度下降、极性基团暴露，形成亲水性纳米离子。
35.优选的是，所述的黑木耳可溶性蛋白多糖复合物的制备方法，其中：所述步骤(4)的稀盐酸的浓度为0.2m～0.4m。
36.优选的是，所述的黑木耳可溶性蛋白多糖复合物的制备方法，其中：所述步骤(5)中陶瓷膜分离级别为2000～50000d分子量，优选8000d(5nm)分子量的分离级别。
37.优选的是，所述的黑木耳可溶性蛋白多糖复合物的制备方法，其中：所述步骤(6)中喷雾干燥的进风温度为195℃～200℃，出风温度为90℃～100℃。
38.本发明的优点：
39.(1)本发明的黑木耳可溶性蛋白多糖复合物的制备方法，黑木耳的胶质成分含量高，在水中易溶胀形成粘稠的胶胨状料液，影响后续的固液分离，本发明将黑木耳超微粉在100～200℃下高温处理，使得胶质发生凝聚、固化等物理化学改变，从而有效地降低料液的粘稠度，提高生产效率。
40.(2)本发明的黑木耳可溶性蛋白多糖复合物的制备方法，采用物理相变耦联机械胁迫机制和超分子结构共组装机制来对黑木耳蛋白进行改性增溶处理，显著提高了黑木耳蛋白的溶解度、明显改善了其冲调性。
41.(3)本发明的黑木耳可溶性蛋白多糖复合物的制备方法，将超微粉碎、高温处理、碱液浸提、化学改性与陶瓷膜浓缩脱盐相结合，既确保了提取收率、增溶了蛋白，又高效地实现了脱盐目的。
42.(4)本发明的制备方法生产成本低、效率高、操作简单、实用性强、便于工业化实施。
具体实施方式
43.下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。
44.实施例1
45.一种黑木耳可溶性蛋白多糖复合物的制备方法包括以下步骤：
46.(1)超微粉碎
47.将黑木耳子实体干品用hr3868型飞利浦破壁料理机(飞利浦中国投资有限公司)进行破壁处理，收集过300目筛的超微粉；
48.(2)高温处理
49.将超微粉在150℃烘箱中高温处理2h；
50.(3)碱液浸提
51.称取高温处理后的黑木耳子实体超微粉2千克，加入20倍(约40l)用食品级氢氧化钠预调至ph12的碱液，充份搅拌均匀，置于25℃室温搅拌12小时；然后9000rpm离心10分钟，获得的菌渣加入5倍(约10l)去离子水，搅拌均匀，再次9000rpm离心10分钟；合并两次离心的上清液(约49.8l)即为浸提液；
52.(4)化学改性
53.在浸提液中加入0.05％食品级亚硫酸钠(24.9g)和0.02％食品级l-半胱氨酸(9.96g)，溶解后，边搅拌边缓慢滴加0.2m稀盐酸进行中和；控制稀盐酸滴加速度，在30分钟内将料液ph值调节至8.2，反应结束后，将料液(约70l)升温至100℃，并保持5分钟，然后迅速冷却至室温；
54.(5)浓缩脱盐
55.将改性后的料液过njlc-1*2型陶瓷膜设备(南京溧翠环保科技有限公司)进行浓缩，膜孔径为5nm(8000d分子量级别)、机器容量60l，过膜流速为30l/h。当料液体积浓缩至初始体积的五分之一时，加入与浓缩液同等体积的去离子水进行水洗脱盐，共洗涤4次，最终浓缩脱盐后的料液电导率为3860us/cm、体积约14l；
56.(6)喷雾干燥
57.浓缩脱盐后的料液采用sp-5000型喷雾干燥机(上海顺仪实验设备有限公司)进行喷雾干燥，机器的进风温度为195℃、出风温度为90℃，进料速度5l/h，干燥时间3h；
58.(7)物理筛分
59.将干燥粉末过100目筛，得到420.6克黑木耳可溶性蛋白多糖复合物，提取收率为21.03％(计算公式：可溶性蛋白多糖复合物质量
÷
原料质量
×
100％)。
60.经测定，制备的黑木耳可溶性蛋白多糖复合物，蛋白含量为18.0％(以干基计)、多糖含量为18.2％(以干基计)、氮溶解指数(nsi)为93％、水分含量为5.75％、灰分含量为9.06％(以干基计)。
61.实施例2
62.一种黑木耳可溶性蛋白多糖复合物的制备方法包括以下步骤：
63.(1)超微粉碎
64.将黑木耳子实体干品用hr3868型飞利浦破壁料理机(飞利浦中国投资有限公司)进行破壁处理，收集过300目筛的超微粉；
65.(2)高温处理
66.超微粉在150℃烘箱中高温处理2h；
67.(3)碱液浸提
68.称取高温处理后的黑木耳子实体超微粉2千克，加入100倍(约200l)用食品级氢氧化钠预调至ph12的碱液，充份搅拌均匀，置于25℃室温搅拌12小时；然后9000rpm离心10分钟，获得的菌渣加入10倍(约20l)去离子水，搅拌均匀，再次9000rpm离心10分钟；合并两次
离心的上清液(约210l)即为浸提液；
69.(4)化学改性
70.在浸提液中加入0.1％食品级亚硫酸钠(210g)和0.1％食品级l-半胱氨酸(210g)，溶解后，边搅拌边缓慢滴加0.2m稀盐酸进行中和；控制稀盐酸滴加速度，在40分钟内将料液ph值调节至9.0，反应结束后，将料液(约308l)升温至100℃，并保持5分钟，然后迅速冷却至室温；
71.(5)浓缩脱盐
72.将改性后的料液过njlc-1*2型陶瓷膜设备(南京溧翠环保科技有限公司)进行浓缩，膜孔径为31.25nm(50000d分子量级别)、机器容量60l，过膜流速为30l/h，当料液体积浓缩至初始体积的五分之一时，加入与浓缩液同等体积的去离子水进行水洗脱盐，共洗涤4次，最终浓缩脱盐后的料液电导率为3382us/cm、体积约63.8l；
73.(6)喷雾干燥
74.浓缩脱盐后的料液采用sp-5000型喷雾干燥机(上海顺仪实验设备有限公司)进行喷雾干燥，机器的进风温度为195℃、出风温度为90℃，进料速度10l/h，干燥时间6.5h；
75.(7)物理筛分
76.将干燥粉末过100目筛，得到307.3克黑木耳可溶性蛋白多糖复合物，提取收率为15.37％(计算公式：可溶性蛋白多糖复合物质量
÷
原料质量
×
100％)。
77.经测定，制备的黑木耳可溶性蛋白多糖复合物，蛋白含量为20.07％(以干基计)、多糖含量为20.82％(以干基计)、氮溶解指数(nsi)为91％、水分含量为8.27％、灰分含量为5.34％(以干基计)。
78.实施例3
79.一种黑木耳可溶性蛋白多糖复合物的制备方法包括以下步骤：
80.(1)超微粉碎
81.将黑木耳子实体干品用hr3868型飞利浦破壁料理机(飞利浦中国投资有限公司)进行破壁处理，收集过300目筛的超微粉；
82.(2)高温处理
83.超微粉在150℃烘箱中高温处理2h；
84.(3)碱液浸提
85.称取高温处理后的黑木耳子实体超微粉2千克，加入20倍(约40l)用食品级氢氧化钠预调至ph12的碱液，充份搅拌均匀，置于25℃室温搅拌12小时；然后9000rpm离心10分钟，获得的菌渣加入5倍(约10l)去离子水，搅拌均匀，再次9000rpm离心10分钟；合并两次离心的上清液(约49.8l)即为浸提液；
86.(4)化学改性
87.在浸提液中加入0.05％食品级亚硫酸钠(24.9g)和0.02％食品级l-半胱氨酸(9.96g)，溶解后，边搅拌边缓慢滴加0.2m稀盐酸进行中和；控制稀盐酸滴加速度，在60分钟内将料液ph值调节至8.2，反应结束后，将料液(约70l)升温至100℃，并保持5分钟，然后迅速冷却至室温；
88.(5)浓缩脱盐
89.将改性后的料液过njlc-1*2型陶瓷膜设备(南京溧翠环保科技有限公司)进行浓
缩，膜孔径为5nm(8000d分子量级别)、机器容量60l，过膜流速为30l/h；当料液体积浓缩至初始体积的五分之一时，加入与浓缩液同等体积的去离子水进行水洗脱盐，共洗涤4次，最终浓缩脱盐后的料液电导率为3860us/cm、体积约14l；
90.(6)喷雾干燥
91.浓缩脱盐后的料液采用sp-5000型喷雾干燥机(上海顺仪实验设备有限公司)进行喷雾干燥，机器的进风温度为195℃、出风温度为90℃，进料速度5l/h，干燥时间3h；
92.(7)物理筛分
93.将干燥粉末过100目筛，得到420.6克黑木耳可溶性蛋白多糖复合物，提取收率为21.03％(计算公式：可溶性蛋白多糖复合物质量
÷
原料质量
×
100％)。
94.经测定，制备的黑木耳可溶性蛋白多糖复合物，蛋白含量为18.1％(以干基计)、多糖含量为18.5％(以干基计)、氮溶解指数(nsi)为97％、水分含量为6.80％、灰分含量为7.22％(以干基计)。
95.实施例1-3成品指标测试
96.实施例1-3获得的黑木耳可溶性蛋白多糖复合物为浅灰色至灰色，具有黑木耳应有的滋味与气味，无其他异味，加水冲调后易溶解，蛋白含量大于18％(以干基计)、多糖含量大于18％(以干基计)、氮溶解指数(nsi)大于90％，水分含量小于10％，灰分含量小于10％(以干基计)。
97.蛋白含量测定方法：按gb 5009.5《食品安全国家标准食品中蛋白质的测定》规定的方法测定。
98.多糖含量测定方法：按ny/t 1676-2008《食用菌中粗多糖含量的测定》规定的方法测定。
99.氮溶解指数(nsi)测定方法：
100.精确称取100mg样品，加蒸馏水20ml，配制成5mg/ml浓度；4℃下9000rpm离心15min，取上清液；按gb 5009.5《食品安全国家标准食品中蛋白质的测定》的规定，测定样液(上清液)和样品中的含氮量，采用公式计算氮溶解指数(nsi)：
[0101][0102]
式中：
[0103]
c——样液的含氮量(g/ml)；
[0104]
v——样液的体积(ml)；
[0105]
x——样品的含氮量(g/100g)。
[0106]
水分含量测定方法：按gb 5009.3《食品安全国家标准食品中水分的测定》规定的方法测定。
[0107]
灰分含量测定方法：按gb 5009.4《食品安全国家标准食品中灰分的测定》规定的方法测定。
[0108]
最后所应说明的是，以上具体实施方式仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照实例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。