一种负载β-胡萝卜素水包油乳液的制作方法

一种负载
β-胡萝卜素水包油乳液的制作方法
技术领域
1.本发明涉及一种负载β-胡萝卜素水包油乳液的制作方法，属于蛋白加工技术领域。


背景技术：

2.β-胡萝卜素是一种重要的类胡萝卜素之一，广泛分布在许多五颜六色的水果，蔬菜和花卉中。作为膳食中重要的维生素a原来源，β-胡萝卜素表现出优异的健康优势，能够提高人体免疫力，预防肿瘤，动脉粥样硬化和抗衰老。然而，由于共轭双键的存在，β-胡萝卜素极易发生氧化，在光，热、酸时条件下发生降解，这在很大程度上限制了β-胡萝卜素在食品工业中作为营养保健品成分或着色剂的应用。而将生物活性成分封装到合适的输送体系中是提高其抗降解稳定性的一种有效策略，通过将活性成分封装在乳液体系脂质液滴的疏水核心中形成水包油乳液，增加其在水基食品中的溶解度和可分配性，从而保持较高浓度的生物活性物质在目标位点的释放。因此，设计合适的水包油乳液有助于β-胡萝卜素的物理化学稳定性和生物利用率最大化。
3.食源性蛋白因其具有高营养价值和乳化，发泡，凝胶化等出色的生物技术功能特性而经常用作输送体系。与淀粉颗粒，脂质晶体等类型的材料相比，食源性蛋白的优势不仅在于其生物相容性和生物降解性，还在于其出色的结构和功能可调节性。蛋白质颗粒的形态范围可以从球形和中空纳米颗粒到微凝胶和原纤维，当用于构建营养输送体系时，在胶体体系稳定性和消化曲线方面提供不同的机制和性能。另外，蛋白质表面上的多种官能团能够与各种物质相互作用，从而促进包括维生素，益生菌，多酚，抗氧化剂，色素等疏水和亲水性生物活性分子的递送。其中，大豆蛋白是一种生物相容性好的天然可食用蛋白，其特殊的氨基酸组成和结构赋予它独特的两亲特性，在构建胶体输送体系中具有很好的应用前景。多糖作为一种天然来源的生物聚合物，能够与蛋白质组装形成高生物相容性、生物安全和经济可行的复合物输送载体。一方面，多糖分子通过疏水基团与油相之间的亲和力牢固地吸附在油水界面处，在油滴表面形成保护膜，降低油水之间的界面张力，从而防止油滴凝结和油水分层。另一方面，多糖含有大量的亲水基团，可以与水分子相互作用并增加粘度，与致密结构相比，具有扩展分子结构的多糖可以夹带大量的水，增加溶液粘度并促进消耗性絮凝，从而具有良好的稳定乳液的能力。而羧甲基纤维素由于良好的生物粘附性、ph敏感性等特点，不仅在食品中具有广泛的应用，也常被用于各种药物的口服输送和其他生物医学研究中。因此，期望在食品级材料—大豆蛋白、羧甲基纤维素的辅助下，构建以β-胡萝卜素为载体的优异输送体系。
4.本发明利用大豆蛋白与羧甲基纤维素间的静电行为以及氢键作用制备蛋白
–
多糖复合物，以此复合体系作为稳定剂构建负载β-胡萝卜素水包油乳液输送体系，促进β-胡萝卜素渗入到水基食品中，有效提高在加工和储存条件下的稳定性，并延缓在胃酸环境下的降解，促进其在食品、生物以及医药领域的应用，对维持人体健康做出更多贡献。


技术实现要素：

5.为有效利用β-胡萝卜素，提升蛋白质的功能特性，本发明提供了一种负载β-胡萝卜素水包油乳液的制作方法，采用的技术方案如下：
6.(1)提取大豆蛋白：挑选表面完整、无虫咬的市售大豆适量，用粉碎机粉碎后过100目筛得到大豆豆粉，将大豆豆粉与正己烷以1：3料液比混合搅拌40min，随后在4℃，4500r/min下离心15min，收集沉淀并重复搅拌离心三次后得到脱脂豆粉，将脱脂豆粉与水以1：20比例混合，使用2mnaoh调节ph至8.0，室温搅拌2h后在4℃，9000r/min下离心30min去除不溶性杂质，取上清液后用2m hcl调节ph至4.5，室温静置2h后在4℃，7500r/min下离心30min，收集沉淀再次重复搅拌离心三次，得到的沉淀用去离子水低速搅拌溶解，调节ph至7.0后在4℃，9000r/min下离心20min，取上清液预冻后进行冷冻干燥，粉碎研磨后得到大豆蛋白；
7.(2)蛋白溶液准备：准确称取冻干蛋白粉末溶于去离子水中(2％，w/v)，室温下磁力搅拌3h以上，在4℃下过夜保存使溶液充分水合；
8.(3)多糖溶液准备：同样称取羧甲基纤维素粉末分散于去离子水中(0.2～1.0％，w/v)，室温下磁力搅拌6h以上，再经高速剪切机在12,000rpm下剪切2min，于4℃下过夜保存使溶液充分水合；
9.(4)制备蛋白
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多糖复合物：将水合后的蛋白与多糖溶液以等体积比例混合，使用1m hcl调节溶液ph至4.0，室温下磁力搅拌3h以上形成均匀的蛋白
–
多糖复合溶液；
10.(5)超声处理：将蛋白
–
多糖复合溶液在200～600w，5～15min超声条件下进行均一化处理；
11.(6)高能法制备乳液：以蛋白
–
多糖复合溶液为水相，mct油(含或不含β-胡萝卜素，β-胡萝卜素在油相中的浓度为0.1％)为油相，将水相与油相以9：1体积比混合，用高速分散机在12,000rpm下剪切3min，形成粗乳液，然后经高压均质机在40～100mpa的压力条件下循环3次得到新鲜乳液，制备得到的负载β-胡萝卜素的乳液用锡箔纸包裹，避光保存；
12.进一步优选，步骤(2)中所述的蛋白质溶液浓度为2％；
13.进一步优选，步骤(3)中所述的胶体溶液浓度为0.8％；
13.进一步优选，步骤(4)中蛋白
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多糖复合物溶液的大豆蛋白含量为1％，羧甲基纤维素含量为0.4％，溶液ph为4.0；
14.进一步优选，步骤(5)中超声处理条件为：500w，10min；
15.进一步优选，步骤(6)中高压均质压力为80mpa；
16.本发明有益效果：本发明以大豆蛋白和羧甲基纤维素为主要原料，通过二者复合稳定体系作为乳化剂进一步制备具有良好储存稳定性的蛋白
–
多糖乳液，并实现β-胡萝卜素靶向控释提供可能性，在这基础上不仅提高了大豆蛋白的应用范围，也为其它生物活性物质包埋缓释的实现提供参考，具有重要的理论意义和实际应用价值。
附图说明
17.附图1：羧甲基纤维素含量对蛋白
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多糖复合物溶解度和浊度的影响
18.附图2：超声处理条件对蛋白
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多糖复合溶液粒径的影响
19.附图3：不同均质压力处理下乳液14天后的乳析指数对比图
20.附图4：β-胡萝卜素紫外吸收标准曲线(λ＝450nm)
21.附图5：mct油与水包油乳液在储存期间的β-胡萝卜素保留率对比图
具体实施方式
22.下面结合附图对本发明具体实施例进行详细描述，但本发明不受实施例的限制。以下实施例所用的主要原料、试剂以及实验器材如下：
23.(1)主要原料与试剂：精选大豆、羧甲基纤维素、β-胡萝卜素、mct油、正己烷、氢氧化钠、盐酸；
24.(2)实验器材：电热鼓风干燥箱、电子分析天平、实验室ph计、台式高速离心机、磁力搅拌器、真空冷冻干燥机、高速剪切机、超声、高压均质机、紫外可见分光光度计；
25.实施例1：
26.本实施例提供一种蛋白
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多糖复合物的的制作方法，具体步骤如下：
27.步骤一：提取大豆蛋白：挑选表面完整、无虫咬的市售大豆适量，用粉碎机粉碎后过100目筛得到大豆豆粉，将大豆豆粉与正己烷以1：3料液比混合搅拌40min，随后在4℃，4500r/min下离心15min，收集沉淀并重复搅拌离心三次后得到脱脂豆粉，将脱脂豆粉与水以1：20比例混合，使用2m naoh调节ph至8.0，室温搅拌2h后在4℃，9000r/min下离心30min去除不溶性杂质，取上清液后用2m hcl调节ph至4.5，室温静置2h后在4℃，7500r/min下离心30min，收集沉淀再次重复搅拌离心三次，得到的沉淀用去离子水低速搅拌溶解，调节ph至7.0后在4℃，9000r/min下离心20min，取上清液预冻后进行冷冻干燥，粉碎研磨后得到大豆蛋白；
28.步骤二：蛋白溶液准备：准确称取冻干蛋白粉末溶于去离子水中(2％，w/v)，室温下磁力搅拌3h以上，在4℃下过夜保存使溶液充分水合；
29.步骤三：多糖溶液准备：同样称取羧甲基纤维素粉末分散于去离子水中(0.2～1.0％，w/v)，室温下磁力搅拌6h以上，再经高速剪切机在12,000rpm下剪切2min，于4℃下过夜保存使溶液充分水合；
30.步骤四：制备蛋白
–
多糖复合物：将水合后的蛋白与多糖溶液以等体积比例混合，使用1m hcl调节溶液ph至4.0，室温下磁力搅拌3h以上形成均匀的复合胶体溶液，其中，蛋白含量为1％，羧甲基纤维素含量为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5％，以单独的蛋白含量为1％的蛋白溶液作为空白对照；
31.步骤五：溶解度测定：将蛋白
–
多糖复合溶液在4℃，10,000g下离心30min，取上清液稀释后，以牛血清蛋白为标准物，采用bca试剂盒测定蛋白质浓度，溶解度为上清液中蛋白质浓度占总蛋白浓度的百分比；
32.步骤六：浊度测定：采用紫外可见分光光度计测量蛋白
–
多糖复合溶液在600nm处的吸光度值，以吸光度值表示为浊度；
33.本实施例测得结果表明，蛋白
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多糖复合物在0.4％羧甲基纤维素的浓度下，溶解度浊度综合结果最佳；
34.实施例2
35.本实施例提供一种超声处理蛋白
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多糖复合物的制作方法，具体步骤如下：
36.步骤一：提取大豆蛋白：挑选表面完整、无虫咬的市售大豆适量，用粉碎机粉碎后过100目筛得到大豆豆粉，将大豆豆粉与正己烷以1：3料液比混合搅拌40min，随后在4℃，
4500r/min下离心15min，收集沉淀并重复搅拌离心三次后得到脱脂豆粉，将脱脂豆粉与水以1：20比例混合，使用2m naoh调节ph至8.0，室温搅拌2h后在4℃，9000r/min下离心30min去除不溶性杂质，取上清液后用2m hcl调节ph至4.5，室温静置2h后在4℃，7500r/min下离心30min，收集沉淀再次重复搅拌离心三次，得到的沉淀用去离子水低速搅拌溶解，调节ph至7.0后在4℃，9000r/min下离心20min，取上清液预冻后进行冷冻干燥，粉碎研磨后得到大豆蛋白；
37.步骤二：蛋白溶液准备：准确称取冻干蛋白粉末溶于去离子水中(2％，w/v)，室温下磁力搅拌3h以上，在4℃下过夜保存使溶液充分水合；
38.步骤三：多糖溶液准备：同样称取羧甲基纤维素粉末分散于去离子水中(0.8％，w/v)，室温下磁力搅拌6h以上，再经高速剪切机在12,000rpm下剪切2min，于4℃下过夜保存使溶液充分水合；
39.步骤四：制备蛋白
–
多糖复合物：将水合后的蛋白与多糖溶液以等体积比例混合，使用1m hcl调节溶液ph至4.0，室温下磁力搅拌3h以上形成均匀的蛋白
–
多糖复合溶液；
40.步骤五：超声处理：将蛋白
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多糖复合溶液在200～600w，5～15min超声条件下进行均一化处理；
41.步骤六：粒径测量：采用马尔文激光纳米粒度仪测量超声处理后复合胶体溶液的粒径，测量前用相应ph磷酸盐缓冲液对复合胶体溶液稀释100倍以减少多重光散射；
42.本实施例中获得十五个经不同超声条件处理下的蛋白
–
多糖复合物，比较粒径结果发现在500w，10min超声条件处理下获得的蛋白
–
多糖复合物粒径最小；
43.实施例3
44.本实施例提供一种水包油乳液的制作方法，具体步骤如下：
45.步骤一：提取大豆蛋白：挑选表面完整、无虫咬的市售大豆适量，用粉碎机粉碎后过100目筛得到大豆豆粉，将大豆豆粉与正己烷以1：3料液比混合搅拌40min，随后在4℃，4500r/min下离心15min，收集沉淀并重复搅拌离心三次后得到脱脂豆粉，将脱脂豆粉与水以1：20比例混合，使用2m naoh调节ph至8.0，室温搅拌2h后在4℃，9000r/min下离心30min去除不溶性杂质，取上清液后用2m hcl调节ph至4.5，室温静置2h后在4℃，7500r/min下离心30min，收集沉淀再次重复搅拌离心三次，得到的沉淀用去离子水低速搅拌溶解，调节ph至7.0后在4℃，9000r/min下离心20min，取上清液预冻后进行冷冻干燥，粉碎研磨后得到大豆蛋白；
46.步骤二：蛋白溶液准备：准确称取冻干蛋白粉末溶于去离子水中(2％，w/v)，室温下磁力搅拌3h以上，在4℃下过夜保存使溶液充分水合；
47.步骤三：多糖溶液准备：同样称取羧甲基纤维素粉末分散于去离子水中(0.8％，w/v)，室温下磁力搅拌6h以上，再经高速剪切机在12,000rpm下剪切2min，于4℃下过夜保存使溶液充分水合；
48.步骤四：制备蛋白
–
多糖复合物：将水合后的蛋白与多糖溶液以等体积比例混合，使用1m hcl调节溶液ph至4.0，室温下磁力搅拌3h以上形成均匀的蛋白
–
多糖复合溶液；
49.步骤五：超声处理：将蛋白
–
多糖复合溶液在500w，10min超声条件下进行均一化处理；
50.步骤六：高能法制备乳液：以蛋白
–
多糖复合溶液为水相，mct油为油相，将水相与
油相以9：1(v/v)的比例混合，用高速分散机在12,000r/min条件下剪切3min，形成粗乳液，然后经过高压均质机，在40～100mpa的压力条件下，循环3次得到新鲜乳液；
51.步骤七：乳析指数测定：分别取30ml新鲜乳液置于带有刻度的试管中，并于4℃下储存，乳析指数(creaming index,ci)按下式计算：
52.式中：hs—乳析相高度/cm；h
t
—乳液总高度/cm；
53.本实施例比较了不同高压均质处理后的乳液在14后的的乳析指数变化，结果表明80mpa均质压力处理下的乳液在14天后的乳析指数最小；
54.实施例4
55.本实施例提供一种负载β-胡萝卜素水包油乳液的制作方法，具体步骤如下：
56.步骤一：提取大豆蛋白：挑选表面完整、无虫咬的市售大豆适量，用粉碎机粉碎后过100目筛得到大豆豆粉，将大豆豆粉与正己烷以1：3料液比混合搅拌40min，随后在4℃，4500r/min下离心15min，收集沉淀并重复搅拌离心三次后得到脱脂豆粉，将脱脂豆粉与水以1：20比例混合，使用2m naoh调节ph至8.0，室温搅拌2h后在4℃，9000r/min下离心30min去除不溶性杂质，取上清液后用2m hcl调节ph至4.5，室温静置2h后在4℃，7500r/min下离心30min，收集沉淀再次重复搅拌离心三次，得到的沉淀用去离子水低速搅拌溶解，调节ph至7.0后在4℃，9000r/min下离心20min，取上清液预冻后进行冷冻干燥，粉碎研磨后得到大豆蛋白；
57.步骤二：蛋白溶液准备：准确称取冻干蛋白粉末溶于去离子水中(2％，w/v)，室温下磁力搅拌3h以上，在4℃下过夜保存使溶液充分水合；
58.步骤三：多糖溶液准备：同样准确称取羧甲基纤维素粉末分散于去离子水中(0.8％，w/v)，室温下磁力搅拌6h以上，再经12,000rpm高速剪切机剪切2min，于4℃下过夜保存使溶液充分水合；
59.步骤四：制备蛋白
–
多糖复合物：将水合后的蛋白与多糖溶液以等体积比例混合，使用1m hcl调节溶液ph至4.0，室温下磁力搅拌3h以上形成均匀的蛋白
–
多糖复合溶液；
60.步骤五：超声处理：超声处理：将蛋白
–
多糖复合溶液在500w，10min超声条件下进行均一化处理；
61.步骤六：高能法制备β-胡萝卜素乳液：称取β-胡萝卜素溶于mct中，使β-胡萝卜素在油相中的浓度为0.1％(w/w)，避光搅拌直至完全溶解，以复合胶体溶液为水相，将水相与油相以9:1的比例(v/v)混合后，用高速分散机在12,000r/min条件下分散2min，形成粗乳液；然后经过高压均质机，在80mpa的压力条件下，循环3次得到新鲜乳液。制备的β-胡萝卜素乳液用锡箔纸包裹，避光保存；
62.步骤七：标准曲线绘制：准确称取20mgβ-胡萝卜素标品，以少量正己烷溶解，加入正己烷定容100ml得到母液。取母液4ml至50ml容量瓶中，定容，得到标准液。分别取0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0ml的标准液于容量瓶中，加入正己烷定容至10ml，以正己烷为空白对照，使用紫外可见分光光度计处测定其在450nm处的吸光度，计算得到标准曲线；
63.步骤八：乳液中β-胡萝卜素含量测定：准确称取1g乳液，正己烷+乙醇(3:2)混合溶剂连续提取3次，合并上相，定容至10ml，以正己烷为参比，测定450nm处吸光度，结果通过标
准曲线算出；
64.步骤九：储存期间乳液中β-胡萝卜素保留率的变化：分别测量1、3、5、10、14天时的乳液中β-胡萝卜素含量，以负载β-胡萝卜素的油相作为空白；
65.本实施例测定了乳液在1、3、5、10、14储存天数下的β-胡萝卜素的保留率，结果表明乳液中β-胡萝卜素的保留率明显高于mct油，表明乳液可以有效隔绝一些促使β-胡萝卜素降解的因子；
66.综上所述，本发明以大豆蛋白和羧甲基纤维素为主要原料，通过二者制成的复合物进一步制成乳液，所制备的乳液工艺简单、生产成本低且具有良好储存稳定性，对β-胡萝卜素的起到了保护作用，这一输送体系不仅拓宽了生物活性物质在食品医药领域中的实际应用，也同时为大豆蛋白的利用和开发提供一定的参考依据。
67.本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无法对所有的实施方式予以穷举。凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。