含有特定β-乳球蛋白肽的配方物的制作方法

本发明属于包含水解的牛乳蛋白的配方物的领域，该配方物用于患有牛乳蛋白过敏症或有产生牛乳蛋白过敏症风险的婴儿。

背景技术：

1、膳食蛋白暴露于胃肠道中的免疫系统。作为免疫系统的默认应答，产生对这些无害的食物蛋白的口服耐受。口服免疫耐受的产生在婴儿中高度存在，他们在生命早期通过暴露于膳食蛋白而暴露于许多无害蛋白。这种对无害蛋白的天然应答偏离轨道，将发生食物过敏。普遍认为，近几十年来，食物过敏症的患病率一直在上升，特别是在西方国家。在生命早期，牛乳过敏症是最主要的食物过敏症，目前有2-5％的婴儿患有牛乳过敏症，并且更高比例的婴儿有产生过敏症的风险。

2、对于患有牛乳蛋白过敏症的婴儿，市售的婴儿配方物包含深度水解的蛋白(深度蛋白水解产物)，或者甚至仅包含游离氨基酸作为氮源。在这些配方物中，几乎不存在或不存在变应原性蛋白或肽。

3、一方或双方患有特应性疾病的父母生出的婴儿，或者有一个或多个患有特应性疾病的兄弟姐妹的婴儿，具有较高的变为对膳食蛋白过敏的风险。对于这一类，除了优选的母乳喂养外，低变应原性配方物是市售可得的，其包含部分蛋白水解产物(部分水解的蛋白)。这些部分水解的蛋白具有降低的变应原性。已经证明该方法可有效防止适应性配方物(adapted formula)中存在的天然蛋白的致敏。通常，蛋白的水解程度低于用于已经患有过敏症的婴儿的深度水解的蛋白的水解程度。这些配方物的优势不仅在于通过预防对蛋白的致敏作用而降低了产生过敏反应的风险，而且还支持天然产生对完整蛋白的口服免疫耐受。其带来的优势在于日后可以在膳食中引入天然蛋白，并具有降低的过敏反应风险。

4、几十年来，人们一直建议严格避开变应原，以预防和管理变应原敏感性。在最近几十年中，对完全避免食物变应原的关注可能无意中导致了食物过敏症的增加。预防或治疗过敏症的更好方式是制定促进对变应原的口服耐受诱导的策略，例如口服免疫疗法，或以有利于诱导天然耐受机制的形式呈递食物变应原(allen et al,2009,pediatr allergimmunol 20:415-422)。

5、ep 2 044 851公开了一种营养组合物，其含有水解度为15％至25％的部分水解的乳蛋白和50至1000ng的tgf-β/100ml，用于初级预防对膳食蛋白的过敏反应和预防在幼小的哺乳动物中发生特应性疾病。

6、ep 0 629 350公开了非变应原性的乳清蛋白水解产物的用途，据称该水解产物能够诱导对牛乳蛋白的耐受性。

7、ep 0 827 697公开了已被酶法水解的乳清用于制备在易感哺乳动物中诱导对牛乳的口服耐受的组合物的用途。所述乳清的变应原性蛋白的免疫学检测水平比未水解的乳清的水平低＞＝100倍。

8、wo 00/42863公开了一种用于在有蛋白过敏症风险的婴儿中诱导蛋白耐受的低变应原性组合物，其包含深度水解的非变应原性蛋白主要成分(basis)和/或游离氨基酸主要成分，所述组合物包含至少一种变应原性蛋白的致耐受性的肽作为活性成分。

9、wo 2011/151059公开了含有部分水解的蛋白和非消化性低聚糖的婴儿营养物，其用于诱导对天然膳食蛋白的口服耐受。

10、wo 2015/090347涉及经鉴定的能够诱导对牛乳，特别是对β-乳球蛋白的耐受性的肽。

11、wo 2017/144730公开了用于在人类或动物中实现对乳蛋白变应原(如β-乳球蛋白)脱敏或诱导对其的耐受性的策略，其包括配制并使用一种组合物，所述组合物包含纯化的完整的表达的乳蛋白以及一种或多种纯化的来自所述完整的乳蛋白的肽。

12、wo 2016/0148572公开了对合成的β-乳球蛋白肽和益生菌的特定混合物的口服免疫耐受。

13、然而，现有技术中的低变应原性组合物通常仅通过避免存在潜在的变应原(因而无法解决潜在的问题)和/或通过需要存在特殊成分(例如生长因子或者合成或纯化的肽)而提供其效果。此外，在现有技术中经鉴定的肽可能不适合在大范围人群中诱导口服免疫耐受。因此，仍然需要包含牛β-乳球蛋白的特定水解产物与特定的肽和组分的营养物，所述特定的肽和组分进一步增强有产生食物过敏症的风险或患有食物过敏症的受试者的口服免疫耐受，并对针对食物蛋白(特别是牛乳蛋白)口服免疫耐受诱导有改善的效果。

14、因此，本发明根本的技术问题是提供用于克服上述缺陷，特别是用于在人类中提供改善的对膳食蛋白的口服免疫耐受诱导的组合物、方法、用途和手段，所述人类特别是有产生食物过敏的风险的人类，特别是有产生牛乳蛋白过敏症的风险的婴儿。

技术实现思路

1、本发明人对本领域中的以下信念做出了贡献，即预防或治疗过敏症的更好方式是开发促进对变应原的口服耐受诱导的策略(例如口服免疫疗法)，或以有利于诱导天然耐受机制的形式呈递食物变应原(allen et al,2009,pediatr allerg immunol 20:415-422)。

2、所有t细胞应答(包括诱导调节性t细胞(tregs))的基础都由三个相互联系的过程组成：t细胞受体激活、共刺激和细胞因子信号传导。通过识别由抗原呈递细胞上的mhc ii类分子所呈递的称为t细胞表位的特异性肽，可以促进cd4+t细胞上的t细胞受体的激活。蛋白水解产物中的t细胞表位的存在对于诱导牛乳特异性treg至关重要。成熟的β-乳球蛋白(blg)的氨基酸(aa)#13-48是特别值得关注的，因为在预防性情况下，覆盖这一区域的合成肽能够显著降低牛乳过敏症的小鼠模型中的急性过敏性皮肤反应。综合考虑，blg中的这一区域似乎对乳清蛋白的耐受性产生很重要。

3、研究人员使用一种新方法发现，基于特定的部分水解的乳清的婴儿配方物含有特定的、明确的β-乳球蛋白(blg)肽，该肽作为t细胞表位起作用，以支持在更广泛的人类受试者群体(例如具有不同的hla-drb1等位基因)中产生对牛乳蛋白的口服耐受。这些特定的等位基因是最相关的，因为hla-dr等位基因是mhc ii类的主要同种型，在cd4+t细胞的选择和激活中起着核心作用。hla-dr是包含hla-dra和hla-drb链的异二聚体分子。虽然hla-dra基因在人类中高度保守，但是有多个hla-drb基因。其中，hla-drb1是多态性最高的基因，其表达量比其功能性旁系同源基因(paralogs)高5倍。

4、首先，开发了一种新的液相色谱-质谱(lc-ms)方法，以确定有限的特定、明确的blg衍生肽列表，这些肽以最高的发生率天然存在于含有乳清蛋白水解产物的配方物中，集中于成熟牛blg的aa#13-48区域。本发明人可在这一目的区域中鉴定出总计13种最小具有9个氨基酸的blg肽，其中6种是在不同的生产批次中被始终如一地鉴定出的。

5、其次，对配方物进行proimmune抗原呈递测定和mhc ii类结合算法，以鉴定相关的hla-drb1限制性肽。已证实这些肽是由人树突状细胞加工和呈递的。上述肽聚集在两个独特的序列组中，即diq…dis(aa#11-30)和ama…apl(aa#23-39)。据评估，blg的经鉴定的两个独特序列组的片段具有高的亲和力去结合选择的hla-drb1等位基因。已发现，blg肽的混合物是最优选的以确保覆盖与人类群体中通常存在的几种hla-drb1等位基因的相互作用。特别地，至少包含blg肽seq id no:5与blg肽seq id no:2、3或4之一的肽混合物，覆盖了大多数所测试的hla-drb1等位基因。参见实施例2和3。

6、第三，测试了经鉴定的blg肽的序列，发现它们被从不同过敏供体获得的人牛乳特异性t细胞系识别，并诱导t细胞增殖/激活。参见实施例4和与其相关联的图2。当在这些不同的t细胞系上进行测试时，观察到t细胞反应性的不同模式，虽然并非每个肽都与每个细胞系反应，但合起来看(特别是单独的blg肽seq id no:4，或blg肽seq id no:1与seq idno:2、3或5之一的组合)，涵盖了每种细胞系的反应性。这些结果表明，含有这些明确的blg衍生肽的水解产物对针对乳清蛋白的口服免疫耐受的产生有改善作用，或降低了产生口服免疫耐受的风险。

7、如实施例6所证明，所述肽具有更多的mhc ii类结合结构域，因此增加了呈递给t细胞的可能性。

8、当与产乳酸菌的菌株一起，全部或不与非消化性低聚糖一起食用时，aa#13-48区域中的blg肽对口服免疫耐受诱导提供进一步改善的效果或进一步降低产生口服免疫不耐受的风险，因此这些结果也表明包含水解蛋白的组合物的进一步改善的效果，所述水解蛋白包含这样的blg衍生肽的混合物，所述肽由对应于由seq id no：1、seq id no:2、seq idno:3、seq id no:4和seq id no:5表示的β-乳球蛋白的连续氨基酸的氨基酸序列组成，优选地与产乳酸菌的菌株一起，全部或不与非消化性低聚糖(益生菌或合生元)一起。

9、此外，在所附的实验部分中证明，发现产乳酸菌的存在增加了hla-dr分子在树突状细胞表面上的表达(实施例6)。hla-dr的表达增加也表明肽向t细胞的呈递改善，从而改善口服免疫耐受诱导。

10、优选条款列表

11、1.一种包含蛋白水解产物的营养组合物，所述蛋白水解产物来自哺乳动物的乳，优选牛属(bos)、野牛属(bison)、水牛属(bubalus)或山羊属(capra)的种的乳，更优选牛属的种的乳，优选来自牛乳，所述营养组合物用于在人类受试者中

12、-诱导对乳蛋白的口服免疫耐受；和/或

13、-预防或治疗对乳蛋白的口服免疫不耐受；和/或

14、-降低产生对乳蛋白的口服免疫不耐受的风险，

15、其中所述蛋白水解产物包含至少两个具有选自seq id no:1、seq id no:2、seqid no:3、seq id no:4和seq id no:5的序列的肽，

16、所述组合物优选地还包含至少一种产乳酸菌的菌株。

17、2.根据条款1的用途，其中蛋白水解产物包含：

18、(i)至少一种具有根据seq id no:5的序列的肽和至少一种具有根据seq id no:2、seq id no:3或seq id no:4的序列的肽；或

19、(ii)至少一种具有根据seq id no:1或seq id no:4的序列的肽和至少一种具有seq id no:2、seq id no:3或seq id no:5的序列的肽。

20、3.根据条款1或2的用于所述用途的营养组合物，其中所述组合物包含少于6μg的变应原性β-乳球蛋白/克总蛋白，优选少于3.5μg的变应原性β-乳球蛋白/克总蛋白。

21、4.根据前述条款中任一项的用于所述用途的营养组合物，其中基于总蛋白计，所述组合物包含至少50重量％，优选至少95重量％的水解乳清蛋白。

22、5.根据前述条款中任一项的用于所述用途的营养组合物，基于总蛋白计，其包含小于10重量％，优选小于6重量％的大小为5kda或以上的肽或蛋白。

23、6.根据前述条款中任一项的用于所述用途的营养组合物，其中基于总蛋白计，存在于所述组合物中的至少1重量％的肽或蛋白的大小为1kda或以上，优选至少5重量％，更优选至少10重量％，基于总蛋白计。

24、7.根据前述条款中任一项的用于所述用途的营养组合物，其中所述组合物包含0.8μg以上的变应原性β-乳球蛋白/克总蛋白。

25、8.根据前述条款中任一项的用于所述用途的营养组合物，其中所述乳蛋白来自牛属、野牛属、水牛属或山羊属的种，更优选地来自牛属的种，优选地为牛乳蛋白。

26、9.根据前述条款中任一项的用于所述用途的营养组合物，其中所述人类受试者是婴儿。

27、10.根据前述条款中任一项的用于所述用途的营养组合物，其中所述人类受试者有产生乳的乳蛋白过敏症的风险或患有乳的乳蛋白过敏症，所述乳来自牛属、野牛属、水牛属或山羊属的种，更优选来自牛属的种。

28、11.根据前述条款中任一项的用于所述用途的营养组合物，其中所述组合物包含属于双歧杆菌属(bifidobacterium)，优选属于短双歧杆菌(bifidobacterium breve)种的产乳酸菌的菌株。

29、12.根据前述条款中任一项的用于所述用途的营养组合物，其包含一种或多种选自以下的非消化性低聚糖：低聚果糖、非消化性糊精、低聚半乳糖、低聚木糖、低聚阿拉伯糖、阿拉伯半乳低聚糖、低聚葡萄糖、葡甘露低聚糖、半乳甘露低聚糖、低聚甘露糖、壳低聚糖、糖醛酸低聚糖、唾液酸低聚糖和低聚岩藻糖及其混合物，优选低聚果糖。

30、13.根据条款12的用于所述用途的营养组合物，其中所述非消化性低聚糖包含至少两种选自低聚果糖和低聚半乳糖的非消化性低聚糖，优选长链低聚果糖与短链低聚果糖或短链低聚半乳糖的混合物。

31、14.根据前述条款中任一项的用于所述用途的营养组合物，包含105至1011cfu的产乳酸菌的菌株/克干重，以及任选地基于干重计，至少2重量％的非消化性低聚糖。

32、15.根据前述条款中任一项的用于所述用途的营养组合物，其包含长链多不饱和脂肪酸，优选二十二碳六烯酸(dha)，更优选基于总脂肪酸计至少0.35重量％的dha。

33、16.根据前述条款中任一项的用于所述用途的营养组合物，其为婴儿配方物、后续配方物或幼儿(young child)配方物。

34、17.一种营养组合物，其包含：

35、a.属于双歧杆菌属的产乳酸菌的菌株；

36、b.来自牛属、野牛属、水牛属或山羊属的种的乳蛋白水解产物，更优选来自牛属的种，其中所述乳蛋白水解产物包含至少两个具有选自seq id no:1、seq id no:2、seq idno:3、seq id no:4和seq id no:5的序列的肽，

37、c.少于6μg的变应原性β-乳球蛋白/克总蛋白，优选少于3.5μgβ-乳球蛋白/克总蛋白，

38、d.基于总蛋白计，少于10重量％的大小为5kda或以上的肽或蛋白，和

39、e.基于总蛋白计，至少50重量％，优选至少95重量％的水解的乳清蛋白，

40、f.任选地，一种或多种选自以下的非消化性低聚糖：低聚果糖、非消化性糊精、低聚半乳糖、低聚木糖、低聚阿拉伯糖、阿拉伯半乳低聚糖、低聚葡萄糖、葡甘露低聚糖、半乳甘露低聚糖、低聚甘露糖、壳低聚糖、糖醛酸低聚糖、唾液酸低聚糖和低聚岩藻糖及其混合物，优选低聚果糖，和

41、g.任选地，长链多不饱和脂肪酸，优选二十二碳六烯酸(dha)，更优选基于总脂肪酸计，至少0.35重量％的dha。

42、18.根据条款17的营养组合物，其中蛋白水解产物包含：

43、(i)至少一种具有根据seq id no:5的序列的肽和至少一种具有根据seq id no:2、seq id no:3或seq id no:4的序列的肽；或

44、(ii)至少一种具有根据seq id no:1或seq id no:4的序列的肽和至少一种具有根据seq id no:2、seq id no:3或seq id no:5的序列的肽。

45、19.根据条款17或18的营养组合物，其中变应原性β-乳球蛋白的量为0.8μg以上/克蛋白，和/或其中所述组合物包含基于总蛋白计，大于1重量％的大小为1kda或以上的肽或蛋白，更优选至少5重量％，更优选至少10重量％。

46、20.根据条款17至19中任一项的营养组合物，其中所述产乳酸菌的菌株属于短双歧杆菌种。

47、21.根据条款17至20中任一项的营养组合物，其中所述非消化性低聚糖包含至少两种选自低聚果糖和低聚半乳糖的非消化性低聚糖，优选地为长链低聚果糖与短链低聚果糖或与短链低聚半乳糖的混合物。

48、22.根据条款17至21中任一项的营养组合物，包含105至1011cfu的产乳酸菌/克干重。

49、23.根据条款17至22中任一项的营养组合物，其包含基于干重计，至少2重量％的非消化性低聚糖。

50、24.根据条款17至23中任一项的营养组合物，其为婴儿配方物、后续配方物或幼儿配方物。

51、25.一种用于向有产生过敏症风险或患有过敏症，更优选乳蛋白过敏症的人类受试者提供营养的方法，其包括向所述人类受试者给予根据条款17至24中任一项的营养组合物。

52、26.根据条款25的方法，其中所述人类受试者是婴儿或幼儿，优选婴儿。

53、27.根据条款25或26的方法，其中所述乳蛋白来自牛属、野牛属、水牛属或山羊属的种，更优选来自牛属的种，优选地为牛乳蛋白。

54、28.一种方法，其用于在人类受试者中：

55、-诱导对乳蛋白的口服免疫耐受；和/或

56、-预防或治疗对乳蛋白的口服免疫不耐受；和/或

57、-降低产生对乳蛋白的口服免疫不耐受的风险，

58、包括向所述受试者给予营养组合物，所述营养组合物包含蛋白水解产物，所述蛋白水解产物来自哺乳动物乳，优选来自牛属、野牛属、水牛属或山羊属的种的乳，更优选来自牛属的种的乳，优选来自牛乳，其中所述蛋白水解产物包含至少两个具有选自seq idno:1、seq id no:2、seq id no:3、seq id no:4和seq id no:5的序列的肽，所述组合物优选地还包含至少一种产乳酸菌的菌株。

59、29.蛋白水解产物用于制备营养组合物的用途，所述营养组合物用于：

60、-诱导对乳蛋白的口服免疫耐受；和/或

61、-预防或治疗对乳蛋白的口服免疫不耐受；和/或

62、-降低产生对乳蛋白的口服免疫不耐受的风险，

63、其中所述营养组合物包含蛋白水解产物，所述蛋白水解产物来自哺乳动物乳，优选来自牛属、野牛属、水牛属或山羊属的种的乳，更优选来自牛属的种的乳，优选来自牛乳，其中所述蛋白水解产物包含至少两个具有选自seq id no:1、seq id no:2、seq id no:3、seq id no:4和seq id no:5的序列的肽，所述组合物优选地还包含至少一种产乳酸菌的菌株。