一种基于3D打印的细胞培养鱼肉及其制备方法

：本发明属于干细胞和动物细胞培养肉，具体涉及一种基于3d打印的细胞培养鱼肉及其制备方法。

背景技术

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背景技术：

1、在当今社会中，随着人们对健康生活方式的追求，高脂肪、高胆固醇等食品的需求逐渐减少。此外，由于全球人口的不断增长和海洋资源的减少，海产品的供应量逐年下降，价格也不断上涨。因此，如何开发一种既健康又有可持续性的替代品来满足人们对海产品的需求已成为一个热门话题。细胞工程学技术是其中一项潜在的解决方案。

2、细胞培养肉是一种新兴的技术，它利用细胞工程学，可以通过体外培养细胞来生产鱼肉。这种方法可以消除野生渔业和水产养殖对环境的影响，也可以提高鱼肉的品质和安全性，但缺乏一种有效的方法来生产具有鱼肉质感和口感的产品。随着3d打印技术的发展，人们开始尝试使用3d打印技术来制造具有复杂形状和结构的食品。这种技术在细胞培养鱼肉的制备中具有广泛的应用前景。但现有的3d打印技术往往只能够打印单一类型的细胞培养肉，同时打印肌肉细胞和脂肪细胞时则无法有效融合，脂肪和肌肉分离，与传统的鱼肉有较大区别，品质不佳，需要新的方法来改善3d打印细胞培养鱼肉的品质。

技术实现思路

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技术实现要素：

1、本发明要解决的技术问题是现有的3d打印技术不能对于鱼肉的肌膈与肌节内容进行有效模拟，需要进一步的优化。

2、为解决上述问题，本发明提供了一种基于3d打印的细胞培养鱼肉及其制备方法，通过利用表面含分化的肌管和脂肪微载体作为生物墨水的主要原料，有效实现肌膈与肌节内容的模拟，大大提高了3d打印细胞培养鱼肉的品质。

3、为达到上述目的，本发明通过以下技术方案实现，一种基于3d打印的细胞培养鱼肉的制备方法，包括以下步骤：

4、(1)收集布满细胞的微载体，静置使微载体可沉入底部，弃去上清液，将微载体中多余的水分除去，加入低酶活谷氨酰胺转氨酶，0～15℃下充分搅拌均匀，制备成生物墨水；

5、(2)将步骤(1)的生物墨水导入到3d打印机的进料筒中，选择打印模型进行打印，打印后将具备立体形状的鱼排定型即可。将布满细胞的微载体与3d打印技术相结合，进行细胞层叠，形成3d打印培养鱼肉构建，其中，3d打印机可选为挤出式3d打印机，挤出式3d对打印原材料的粘度、水分等均要适中，否则食品材料挤出成型后极易坍塌，或因硬度太高不易挤出。

6、进一步的，步骤(1)中谷氨酰胺转氨酶与微载体的比例为1～100：1000(w/w)，谷氨酰胺转氨酶的酶活为10～1500u。谷氨酰胺转氨酶的加入可使3d打印的聚合物交联，避免之后的坍塌，同时增加可咀嚼性，形成肉类的口感。同时，因为当谷氨酰胺转氨酶酶活过高将引起生物墨水流动性降低，进而可打印性下降，所以使用低酶活的谷氨酰胺转氨酶可以避免3d打印过程中可打印性的丧失；低温的生物墨水也可以减少谷氨酰胺转氨酶活性，避免生物墨水再打印过程中的流动性丧失，满足打印的需要。

7、进一步的，步骤(2)中3d打印机设置喷嘴直径为0.5～2.00mm，打印速度为10～40mm/s，打印温度为4～15℃。0.5mm～2mm的喷嘴直径和10～40mm/s的打印速度能够保证3d打印的打印精度，过高的喷嘴直径和打印速度将导致打印精度严重下降。4～15℃的打印温度是为了抑制谷氨酰胺转氨酶的活性来保证可打印性，温度较高将引起谷氨酰胺转氨酶交联反应，使生物墨水流动性下降，可打印性显著降低。

8、进一步的，步骤(2)中打印后的鱼排于4℃中静止0.5-20h进行定型。低温定型能够防止3d打印样品发生坍塌，温度较高时3d打印样品流动性增加，易发生坍塌。

9、进一步的，步骤(1)中，将微载体、酶活谷氨酰胺转氨酶和天然可食用蛋白质或多糖充分混合制备生物墨水。例如但不限于大豆分离蛋白，豌豆蛋白，南瓜蛋白，花生蛋白，燕麦蛋白，乳清分离蛋白，黄原胶，卡拉胶，结冷胶。多糖和蛋白质都具有天然黏附性和粘度，可以增加墨水的张力和黏度，使得墨水更易于在打印过程中定位和固定，从而提高生物墨水的稳定性和可打印性。

10、进一步的，步骤(1)所述微载体中肌肉组织微载体与脂肪组织微载体的比例为质量比1:1～1:9。该比例可以定制化鱼肉中细胞培养肌纤维蛋白与脂肪的比例构成。

11、进一步的，步骤(1)所述微载体的制备方法包括以下步骤：

12、(0-1)将干细胞接种于第一级生物反应器的可食性微载体中，干细胞的接种密度为5-40万/ml，微载体密度为0.5-10mg/ml；

13、(0-2)细胞在第一级生物反应器接种后，在10-60rpm恒速搅拌下培养5-7天，待细胞布满微载体后，将生物反应器静置，移除上清，使用pbs缓冲液或d-hanks缓冲液洗涤微载体，随后添加酶消化液消化细胞，离心、移除上清，加入适量培养基重悬转入第二级生物反应器按步骤(0-1)的方法继续扩增；

14、(0-3)第二级生物反应器扩增结束按步骤(0-2)的方法继续放大到第三级生物反应器中，第三级生物反应器培养结束后继续进行放大培养；或进行细胞成熟和收获，即在成肌或成脂分化培养基进行肌生成或脂肪生成，得到的微载体即步骤(1)所述布满细胞的微载体。通过使用布满细胞的微载体，可以实现细胞在构建物中的均匀分布。这对于细胞培养肉的质地和口感的一致性非常重要。

15、进一步的，步骤(0-1)中第一级生物反应器为搅拌型生物反应器，生物反应器体积为50-150ml，培养基体积可为50-150ml，接种条件为10-120rpm搅拌1-60min后静止30-300min，循环1-15次。干细胞可来源于自行分离培养或商业细胞株如斑马鱼肌卫星细胞系，虹鳟鱼肌卫星细胞系，斑马鱼脂肪来源干细胞系等。可食性微载体可来源于自行制备或市售可食性微载体如青岛海洋食品与应用健康创新研究院的3d-edi.mic微载体。

16、进一步的，步骤(0-2)中的酶消化液为质量体积比0.1％胶原酶消化液或0.25％edta-胰酶消化液消化细胞，其中微载体质量与消化液体积的比例为1mg：0.01～5ml，25-40℃孵育5-30min，来将细胞消化。

17、进一步的，步骤(0-2)中消化后在1000-2000rpm条件下离心5min移除上清。

18、进一步的，步骤(0-2)中第二级生物反应器的体积为500-1000ml。

19、进一步的，步骤(0-3)中第三级生物反应器的体积为5000-10000ml。

20、本发明中，使用微载体悬浮培养技术中的原料均为正常市售产品。其中，微载体支架本身必须是食品级、可食用的。否则将细胞与微载体分离需要耗费大量额外的工作。

21、本发明还提供了利用上述方法制备得到的细胞培养鱼肉，具备良好的形状，且外观边界明显且光滑。

22、本发明的有益效果在于：

23、(1)本发明使用微载体悬浮培养技术对干细胞进行大规模扩增，然后将扩增细胞后的微载体加入到生物墨水中，利用表面含分化的肌管和脂肪微载体作为生物墨水的主要原料，有效实现肌膈与肌节内容的模拟，大大提高了3d打印细胞培养鱼肉的品质。

24、(2)本发明的方法利用了3d打印技术，结合细胞工程学技术，可以生产出高质量、富含营养、无害的鱼肉产品，实现了对传统渔业的替代。

25、(3)提供了一种高品质的3d打印细胞培养鱼肉，与传统肉类产品相比，本发明的细胞培养鱼肉不仅没有污染、没有药物残留，而且更加健康、富含营养，无需通过传统渔业捕捞，可以大大减少对海洋资源的压力，具有很高的经济效益和环境效益。