粗淀粉料混菌固体发酵制备菌体蛋白及菌株选育方法

专利名称：粗淀粉料混菌固体发酵制备菌体蛋白及菌株选育方法
技术领域：
本发明属利用微生物固体发酵生产菌体蛋白饲料的新技术。
把粗淀粉料通过微生物方法转化为蛋白精饲料，是解决畜禽蛋白饲料不足的有效途径，特别是薯类(木薯、甘薯、马铃薯等)，生长快、产量高，是一种很有前途的饲料资源，但由于薯类含粗蛋白仅2.5%-3.0%，并且质量低劣，大部分为非蛋白含氮物，因而影响其应用，为此，国内外广泛开展用微生物发酵方法把价廉物丰的粗淀粉料转化为蛋白精料的技术研究，国外报道(“Proteinenrichmentofstarchysubstratesforanimalfeedsbysolid-statefermentation”WorldAnimalReview，No.35，1980)一种用黑曲霉选拔系对木薯及木薯渣等进行单菌固体发酵生产菌体蛋白的技术，但未透露具体菌株特性资料，而且该技术对培养料须用70-80℃蒸汽进行胶化处理，然后喷N.P溶液和接种，工艺复杂且耗能较多，同时生产单位蛋白质所消耗的碳化合物较多，因而生产成本较高。
本发明的目的是提供一种将粗淀粉及其渣料转化为蛋白质产品-菌体蛋白(SCP或MBP)的生料混菌固体发酵新技术以及所利用菌株的选育方法。
本发明根据发明人所获得的一系列微生物对白地霉具明显刺激作用的发现，以粗淀粉料为培养料，采用对白地霉有强刺激作用且孢子少的黑曲霉(AspergillusnigervanTieghen)选拔株与白地霉AS·2·361菌株(GeotrichumcandidumLinkAS·2·361)配伍进行混菌固体发酵生产菌体蛋白饲料(SCP和MBP)。
本发明所进行的固体发酵可以是生料不灭菌固体发酵，即在固体发酵过程中，培养料以生料状态进行，不必采用专门的灭菌手段。
本发明制备菌体蛋白饲料的工艺包括下列步骤(1)黑曲霉选拔株及白地霉AS·2·361斜面单菌种制备;
(2)以糠麸和水的混和物为培养物制备黑曲霉选拔株及白地霉AS·2·361的二级种;
(3)以糠麸、硫酸铵、水的混和物为培养料制备黑曲霉选拔株及白地霉AS·2·361的混合母种;
(4)粗淀粉料(生料不灭菌)混菌固体发酵。
对于步骤(3)，特点是把黑曲霉选拔株和白地霉AS·2·361(均为二级种)以混合种状态接入培养料，接入的混合种比例为白地霉AS·2·361∶黑曲霉选拔株＝10∶0.1-2.0，接种量为培养料的5-10%(重量计)，培养料可采用下列配方麦麸40-99.5%，米糠0-60%，硫酸铵0.5-2.5%，各组分总和为100%(以重量计)，料∶水＝1∶0.6-1.2(重量计)。
对于步骤(4)，其培养料可采用下列配方粗淀粉料88-95%，硫酸铵1-6%，尿素2.5-3.5%，过磷酸钙0.2-0.5%，食盐0.5-0.7%，各组分总和为100%(以重量计)，料∶水＝1∶0.75-1.0(重量计)。
上述配方中的粗淀粉料视需要可采用下列种类的全部或一部分
(1)粮食类稻谷、碎米、玉米、大麦、小麦、高粱、小米等;
(2)薯类木薯、甘薯、马铃薯、芋艿等;
(3)糠麸类米糠、麦麸、玉米皮、统糠等;
(4)渣泊类各种薯渣、玉米渣、酒糟、豆渣、蔗渣、木薯叶、花生苗、玉米高粱杆粉、糖蜜、脚粉、某些草粉、某些果渣和工业废渣等。
配方中的粗淀粉料要含有不低于20%的渣糠类(麦麸、米糠、薯渣、草粉等)兼作填充剂和疏松剂。
经上述工艺发酵完成的产品可作为饲料直接应用或按饲养标准掺入其他干原料，补足微量元素、氨基酸等以后压粒应用或将产品干燥至含水12%以下装袋密封保存备用。
本发明采用的菌种中，白地霉AS·2·361是已知菌种，其菌学性状与《常见和常用真菌》中的“白地霉”(中国科学院微生物研究所编写，“科学出版社”1978年版p160-162)的记载完全一致，该菌种在中国科学院微生物研究所菌种室有保藏，保藏号为AS·2·361。
所采用的黑曲霉选拔株是根据发明者所提供的选育方法，由一系列待选菌株，包括从自然界分离的黑曲霉菌株或经人工诱变的黑曲霉菌株中筛选而出菌株，该菌株除具有一般黑曲霉的菌学特征外，最主要特点是对白地霉有明显的刺激作用而又很少长孢子。
本发明提供的黑曲霉选拔株的选育方法是平板点种生长圈筛选法，它以刺激白地霉的生长圈大且产生孢子少为筛选目标反复进行选育。其做法是在玻璃平板上倒入由混有白地霉悬液的PSA培养基，每100ml培养基混入10ml白地霉PDA液体菌种，在其上点种待选的黑曲霉菌株(从自然界分离的菌株或经人工诱变的菌株)，在28-30℃培养，筛选出在点种周围产生大而厚的刺激生长圈且孢子少的黑曲霉株为较好的选拔株。
通过上述方法筛选而获得的一系列黑曲霉菌株的任一菌株均可作为所说的黑曲霉选拔株而为本发明所采用。
本发明提供一株通过上述方法筛选而得的优良的黑曲霉选拔株，这是一株经诱变和筛选获得的黑曲霉突变株，编号为No.303(AspergillusnigerNO.303该菌株寄存于武汉中国典型培养物保藏中心，寄存号为CCTCCNOM87054)，该菌株对白地霉有明显刺激作用而又很少长孢子，其细菌学的主要特性如下(1)在不同培养基中的繁殖状态(一)察氏培养基平皿点植试验30℃培养40小时，φ3.15mm，菌落明显凸起，浅黄色，有极少孢子出现。表面皮革状，边缘较整齐，背面浅黄色，皱纹不明显;65小时，φ5.5mm，菌落凸出4mm左右，中央浅黄色，边缘不整齐，白色，表面粗糙皮革样。背面皱纹不明显，孢子极少，味霉;7天后，分泌棕色;8天，φ22mm，孢子只长中央。
液培试验30℃培养24小时，φ0.2mm，零星菌球，液清晰，PH2.5-3.0;48小时，φ0.2mm，少量菌球出现，瓶壁有白色菌层。
(二)PSA培养基平皿点植试验30℃培养40小时，φ9mm，白色明显凸起，有皱纹，有零星孢子，边缘整齐，背面淡黄;65小时，φ20mm，斗笠状，皱纹很多，有少量孢子，边缘整齐，背面稍白，有像鸡冠花状皱纹。培养时间长了，分泌黑绿色素，表面有黑褐色液滴。
液培试验30℃培养24小时，φ＜1mm，少量菌球，PH2.0-2.5;48小时，φ1mm，较多菌球，瓶壁有菌层，但不见孢子。
(2)菌态特征察氏平皿点种后在30℃培养7天，染色载片滴加乳酸石炭酸棉兰液置625倍显微镜观察;载片培养观察小梗和顶囊。结果是菌丝表面光滑，有横隔、宽3-7.5μ;分生孢子梗从基质长出，侧生或直立，无横隔、壁光滑、长短不一，宽10-18μ，足细胞有分隔，大小不一;顶囊球形至椭圆形，可孕，小梗瓶状，双层，无横隔;分生孢子圆形，表面光滑，壁厚光滑，φ5μ;分生孢子头紧凑。
(3)同化N源试验硝酸铵十，硫酸铵十，尿素十，亚硝酸钠一，但当亚硝酸钠浓度为0.2%时生长良好。
本发明的混菌固体发酵制备菌体蛋白饲料的方法和工艺中，用黑曲霉No.303和白地霉AS·2·361配伍，可获得良好效果。
应用本发明生产的菌体蛋白产品，经分析其粗蛋白含量比培养料提高280%，氨基酸总和占粗蛋白质的52-55%，维生素B1提高72%，B2提高155%。
产品经“三致”试验，大剂量喂养，病理组织验查，黄曲霉毒素B1、氢氰酸、核酸、重金属，有害细菌和厌气菌检测试验，证明产品安全无毒;经畜禽饲养试验，表明该产品有较高营养价值，可代替鱼粉和部分豆饼作为一种良好的畜禽蛋白源饲料。
本发明利用黑曲霉选拔株如其优良突变株No.303与白地霉AS·2·361菌株的互生关系，以粗淀粉料为培养料，采用生料不灭菌固体发酵技术，生产菌体蛋白产品，具有原料来源广，产品得率(可达80%)及粗蛋白含量(20%以上)较高，维生素丰富的优点，且工艺简单，设备投资少，其推广应用有利于饲料工业和畜牧业的发展。
附表一为产品成分及营养表;
附表二为产品氨基酸含量表。
本发明生产工艺的实施例实施例一(1)斜面单菌种生产(一)将黑曲霉No.303菌株接在PSA斜面上，在25-35℃下培养2-7天，获得成熟菌种备用。
(二)将白地霉AS·2·361菌株接在PDA斜面上，在24-37℃上培养1-5天，获得成熟菌种备用。
(2)二级种生产配方∶麦麸∶水＝1∶0.8-1.0(重量计)用三角瓶装培养料，1.1Kg/cm2灭菌60分钟，分别接入黑曲霉No.303菌种(接种量约0.2cm2菌苔)和白地霉AS·2·361菌种(接种量约0.5cm2菌苔)摇匀后在28-30℃下分别培养24小时-72小时，即可培养出黑曲霉No.303和白地霉AS·2·361二级种。
(3)混合母种生产原料配方麦麸99%，硫酸铵1%料∶水＝1∶1料拌匀后蒸熟(100℃)，搅拌使速冷，然后将白地霉AS·2·361二级种和黑曲霉No.303二级种按10∶0.5(重量计)混合为混合种，接入培养料，接种量为培养料的7%，在温度为30℃。湿度为90%条件下培养24小时获得混合母种。
(4)生淀粉料不灭菌固体发酵粗淀粉料90%(其中木薯片∶木薯渣粉∶木薯叶粉＝6∶2.5∶1.5)，硫酸铵6%，尿素2.5%，过磷酸钙0.75%，食盐0.75%(均以重量计)培养料∶水＝1∶0.8(重量计)将混合母种接入上述培养料(接种量为培养料干重的20%，加水混合并搅拌均匀后装入活动曲架或发酵池，在温度为28-30℃，湿度为90%的条件下进行固体发酵，培养22-28小时，当料洁白，结饼、发出浓郁香味，发酵即告完成。
(5)产品后处理实施例二二级种生产的原料配方为麦麸50%米糠50%(重量计)
其余工艺流程同实施例一实施例三混合母种生产原料配方为麦麸50%，米糠49%，硫酸铵1%(重量计)其余工艺流程同实施例一或实施例二实施例四生淀粉料不灭菌固体发酵的培养料可分别采用下述任一配方(1)木薯片60%，麦麸10%，米糠20%，硫酸铵6%，尿素2.5%，过磷酸钙0.75%，食盐0.75%;
(2)薯片粉60%，稻草粉30%，尿素3%，硫酸铵6%，食盐0.5%，过磷酸钙0.5%;
(3)薯渣70%，薯片粉20%，尿素3%，硫酸铵6%，食盐0.5%，过磷酸钙0.5%;
(4)马铃薯片(粉)70%，麦麸20%，尿素3%，硫酸铵6%，食盐0.5%，过酸酸钙0.5%(总组分为100%)(5)玉米粗粉50%，麦麸40%，尿素2%，硫酸铵7%，过磷酸钙0.5%，食盐0.5%;
(6)木薯片(粉)60%，甘蔗渣30%，尿素2%，硫酸铵7%，过磷酸钙0.5%，食盐0.5%。(总组分为100%)上述配方均以重量计，其他工艺流程与实施例一或实施例二同。
实施例五黑曲霉选拔株No.303的选育方法
(1)从酸性木薯中分离黑曲霉菌株;
(2)以PDA液体培养基接种白地霉AS·2·361，在24-37℃，220rpm摇培16小时制得白地霉液体菌种;
(3)用100mlPSA培养基熔化后，冷却至45℃，倒入10ml白地霉液体菌种，充分摇匀制得混有白地霉悬液的PSA培养基;
(4)在28×33cm2玻璃平板中倒入混有白地霉悬液的PSA培养基，点种由(1)分离的待选黑曲霉菌种，每个平板点种50-70个，于28-30℃培养24小时，筛选出在点种周围产生大而厚的刺激生长圈且孢子少的黑曲霉菌株为较好菌株;
(5)以上述较好菌株为出发菌株，用UV，15w，30cm，30秒多次处理，30℃静培24小时后过滤分离;
(6)用上述处理过的菌株按(4)进行平板点种生长圈筛选，获得较优S菌株;
(7)将S菌株自然分离后，再按(4)进行平板点种生长圈筛选，获得明显刺激白地霉生长又很少长孢子的黑曲霉优良突变株No.303。
表一.产品成分及营养表%
</tables>＊按公式计算表二.产品氨基酸含量表%
</tables>
权利要求
1.一种以粗淀粉料为培养料的固体发酵制备菌体蛋白饲料的方法，其特征在于采用对白地霉有强烈刺激作用而且孢子少的黑曲霉(Aspergillus niger van Tieghen)选拨株与白地霉AS·2·361菌株(Geotrichum candidum LinkAS·2·361，该菌株保藏于中国科学院微生物研究所，编号为AS·2·361)配伍进行混菌固体发酵。
2.按权利要求1所述的固体发酵制备菌体蛋白饲料的方法，其特征在于所进行的固体发酵为生料不灭菌固体发酵，即在固体发酵过程中，培养料以生料状态进行，不必采用专门的灭菌手段。
3.按权利要求1所述的固体发酵制备菌体蛋白饲料的方法，其特征是制备工艺包括下列步骤(1)黑曲霉选拔株及白地霉AS·2·361斜面单菌种制备;(2)以糠麸和水的混合物为培养物制备黑曲霉选拔株及白地霉AS·2·361的二级种;(3)以糠麸、硫酸铵、水的混合物为培养料制备黑曲霉选拔株和白地霉AS·2·361的混合母种;(4)粗淀粉料(生料不灭菌)混菌固体发酵。
4.按权利要求3所述的固体发酵制备菌体蛋白饲料的方法，其特征是工艺步骤(3)的混合母种制备，黑曲霉选拔株和白地霉AS·2·361以混合种状态接入培养料，接入的混合种比例为白地霉AS·2·361∶黑曲霉选拔株＝10∶0.1-2.0，接种量为培养料的5-10%，(以重量计)，培养料配方为麦麸40-99.5%，米糠0-60%，硫酸铵0.5-2.5%，各组分总和为100%(以重量计)，料∶水＝1∶0.6-1.2(以重量计)
5.按权利要求3所述的混菌固体发酵制备菌体蛋白饲料的方法，其特征是工艺步骤(4)中培养料的配方为粗淀粉料88-95%，硫酸铵1-6%、尿素2.5-3.5%，过磷酸钙0.2-0.5%，含盐0.5-0.7%，各组分总和为100%(以重量计)，料∶水＝1∶0.75-1.0(以重量计)，在培养料配方的粗淀粉料中含有不低于20%(以重量计)的渣糠类〔麦麸和(或)米糠和(或)草粉〕兼作填充剂和疏松剂。
6.按权利要求1或3所述的固体发酵制备菌体蛋白饲料的方法，其特征在于所说的黑曲霉选拔株为一株黑曲霉的优良突变株，编号为No.303，(AspergillusnigerNO.303寄存于武汉中国典型培养物保藏中心，寄存号为CCTCCNOM87054)，该菌株对白地霉有明显的刺激作用而又很少长孢子，其菌态特征是察氏平皿点种后在30℃培养7天，染色载片滴加乳酸石炭酸棉兰液置625倍显微镜观察;载片培养观察小梗和顶囊，结果是菌丝表面光滑，有横隔，宽3-7.5μ;分生孢子梗从基质长出，侧生或直立，无横隔，壁光滑，长短不一，宽10-18μ，是细胞有分隔，大小不一;顶囊球形至椭圆形，可孕，小梗瓶状，双层，无横隔;分生孢子圆形，表面光滑，壁厚光滑，φ5μ;分生孢子紧凑。
7.黑曲霉选拔株(包括黑曲霉No.303)的选育方法，其特征是采用平板点种生长圈筛选法，以刺激白地霉的生长圈大且产生孢子少为筛选目标反复进行选育。
8.按权利要求7所述的黑曲霉选拔株(包括黑曲霉No.303)的选育方法，其平板点种生长圈筛选法特点是在玻璃平板上倒入混有白地霉悬液的PSA培养基，(每100ml培养基混入10ml的白地霉PDA液体菌种)在其上点种待选的黑曲霉菌株(从自然界分离的菌株或经人工诱变的菌株)在28-30℃培养，筛选出在点种周围产生大而厚的刺激生长圈且孢子少的黑曲霉菌株为较好选拔株。
9.权利要求1或3所制备的菌体蛋白饲料产品特点是安全无毒，可做畜禽的蛋白源饲料。
全文摘要
本发明属利用微生物进行固体发酵生产菌体蛋白饲料的新技术，提供由黑曲霉选拨株与白地霉配伍进行生料不灭菌固体发酵的方法和工艺，可把薯类(片、粉、渣、叶)或其他淀粉原料转化为高级畜禽蛋白饲料。本发明工艺简单，设备投资少，产品得率及粗蛋白含量高，安全无毒，其推广应用有利于饲料工业和畜牧业的发展。
文档编号C12N1/14GK1030608SQ8710480
公开日1989年1月25日 申请日期1987年7月11日 优先权日1987年7月11日
发明者郭维烈, 郭庆华 申请人:广东省微生物研究所