专利名称：具有第八因子活性的新蛋白质，便用遗传工程细胞制备该蛋白的方法以及含这些蛋白的 ...的制作方法
技术领域：
本发明涉及到一些具有第8因子活性的新的蛋白质以及使用遗传工程细胞系感微生物来制备它们的方法。
第8因子是一种医学上重要的蛋白质，因为它是血液凝固机制中的一种方要成分。它在健康人血浆中的浓度大约为100ng/ml。第8因子缺乏导致称为血友病A的一种出血性疾病，它主要见于男性，因为第8因子基因位于X-染色体上。本病是一种重要的遗传性出血性疾病，男性人群发病率约0.01%。
血友病A可以通过输入自健康人获得的含第8因子的血浆来治疗。然而该疗法有几种缺点。首先，第8因子的来源有限且价格昂贵，因为它在供者血中的浓度很低。其次，现行的血浆分级分离方法产率较低，第8因子的实际含量不足。第三，每一例血友病A患者接受了采自许多供血者的血液制品，从而获得传染病的危险性升高，这些传染病包括例如由存在于供血中的非甲、非乙型肝炎病毒，乙型肝炎病毒，艾滋病(AIDS)病毒引起的各种疾病。另一问题是所谓抑制因子的出现，它是接受外源性，同种基因性第8因子制品治疗的血友病患者所产生的抗第8因子抗体。
这些问题已促使人们去认真研究用重组DNA技术的方法来获得第8因子，以代替自供者血液中的分离方法。几组学者已报道了由人类mRNA所获的第8因子cDNA分子克隆和在哺乳类，酵母菌，或细菌细胞中生产具有第8因子活性的蛋白质(WO85/01961，EP0160457，EP150735，EP0253455)。
欧洲专利申请0253455介绍了一种使用转化微生物生产具有第8因子活性蛋白质的方法。该种蛋白适于制备具有第8因子活性的药学制品并可激发能识别具有第8因子活性蛋白的抗体。
另一组研究者的目标是发现具有第8因子活性并能纠正血友病A患者凝血缺陷的其它种蛋白质。欧洲专利申请EP150735，EP123945，和Brinkhous等(1985)指出，第8因子活性不仅取决于第8因子蛋白本身，而且还决定于它的某些蛋白水解产物。蛋白水解酶作为凝血链式反应的一环见于血液之中，并部分降解第8因子为分子量92KDa和80KDa的两个亚单位多肽。据认为，当这两个亚单位的复合体或其一部分在血中出现时，第8因子活性增强(Fay等，1986，Eaton等1986a)。
与其它血浆蛋白不同，当以已知的重组DNA方法制备时，第8因子是一种不尽理想的低产蛋白质。甚至该蛋白并不以完整肽链的形式出现，因此制品很难进一步分离和纯化，费用也高。
Eaton等(1986b)发现，从第8因子蛋白的中心区去除第797-1562之间的766个氨基酸之后，余下的蛋白仍保有第8因子活性。而且，用含有编码该缩短的蛋白质的DNA的载体转化的哺乳类细胞比带有编码全部长度蛋白的密码的易感细胞表现出更高的产率。
PCT专利申请WO86/06101透露，既使将第8因子蛋白删除到仅离中心区880个氨基酸仍显示第8因子活性。最多的缺失延伸达Thr-760到Asn-1639(按表4计数)。已提及的从Thr-760到Lys-1674的更大的缺失显然对其并无影响。这些蛋白可以用含编码这些蛋白质的cDNA的一个载体转化得到的哺乳类细胞系体外培养来制备。对所有天然的或制备的第8因子蛋白来讲，缺失绝不能延伸到中心区边界以外，因为该分子的余下部分是维持凝血活性的基础。
第8因子是纠正象血友病A那样的凝血缺陷的蛋白质，其特性即第8因子活性。第8因子以与一种蛋白质，VonWillebrand因子(VWf)，结合状态循环于血液中，该蛋白防止第8因子过旱衰变。
第8因子由表4所述的氨基酸顺序所定性。顺序的编号开始于Ala-1，它为含19个氨基酸的信号序列后的第一个氨基酸，末端为Tyr-2332。该编号用于本专利说明书。
“具有第8因子活性的蛋白质”“第8因子蛋白质”或“类第8因子化合物”包括在天然第8因子之内的各种大小的蛋白质，它们均具有经确定的氨基酸顺序的核心部分或与第8因子的一部分氨基酸顺序是同质的，当输给血友病A患者时，它们具有第8因子活性以纠正凝血缺陷。该凝血缺陷的纠正可能受到已被破坏的凝血机能中直接干扰的影响或上述抑制因子患者体内的抗第8因子蛋白抗体中和作用的影响从而随后输入的凝血第8因子蛋白能显示其全部活性。
作为激活蛋白对全长第8因子蛋白作用的结果，形成了亚单位蛋白质，它们的分子量分别为92KDa和80KDa。92KDa-亚单位自全长第8因子蛋白的氨基末端始而向下延伸，80KDa-亚单位自羧基末端始而向上延伸。
为本发明的需要，92KDa-多肽规定为全长第8因子的自Ala-1至Arg-740的氨基酸序列，80KDa-多肽定为自Gln-1649至TYR-2332氨基酸序列，这些顺序是经蛋白水解位点标明的。第8因子蛋白的其余部分为中心区，它与所谓的B-区间非常适应，B-区间的边界氨基酸是Ser-741和Arg-1648。
“具有第8因子活性蛋白质”的概念包括92KDa和80KDa多肽及其一部分，它们可能本身不具有活性，但当一起输入或与另一种适当的蛋白质结合时，显示出第8因子的活性，该后一种蛋白可能存在于血友病A患者体内。
“具有第8因子活性的蛋白质”的概念还包括含有既与80KDa又与92KDa-蛋白质或它们的片段相对应的氨基酸顺序的蛋白质。据认为它们来自于缺失了在上述92KDa和80KDa亚单位之间的中心区的第8因子蛋白或缺失了92KDa-和80KDa-亚单位界限以外部分。它们一般被称为缺失突变蛋白。
该概念包括在人体外用如重组DNA技术生产的具有第8因子活性的蛋白质。它包括在体内显示出天然的第8因子生物学特性以及具有其主要部分已确定或与第8因子的一部分氨基酸顺序同质的任何蛋白质。
由遗传工程得到的“具有第8因子活性的蛋白”可能与天然存在的产品一致，它还可以是象80KDa-或92-KDa片段那样的一个片段或是有同样活性但勿需具备同样的氨基酸顺序或分子量的一个片段。
“具有第8因子活性的药物制品”意指输入哺乳类体内后能纠正与第8因子缺乏有关的凝血缺陷的任何制品。
为方便起见，名词“蛋白质”常包括蛋白质和更小的多肽链。至于“来自另一顺序的一个顺序”指的是与另一顺序一致或是天然形成、经遗传工程所得变种、或化学合成的一个顺序，该顺序维持或增强所需功能。
“信号顺序”指的是蛋白质氨基端的一部分，在细胞膜运输时往往由成熟蛋白上被清除。
所用缩写Ug＝微克，Kb千硷基对，bp＝硷基对，KDa＝千道尔顿已发现，能从全长第8因子蛋白制备它的缺失突变。虽然它具有目前普遍认为有损于其生物活性的超长缺失，但表现出第8因子活性。
这种新型蛋白质显示出未曾预料到的令人满意的特性，能使它适于有规律地生产。它们在遗传工程的宿主细胞中被生产，该细胞作为含有偏码全长第8因子或已知缺失突变体的DNA的易感态细胞，大量分泌该蛋白。该突变体系已在PCT专利申请WO86/06101所述。
该新蛋白可以用N-L-C式表示。N代表从第8因子蛋白氨基端伸展的氨基酸顺序，C代表由羧基端伸展的顺序。中间连接体L代表一个连接肽键或一个1-20个氨基的连接顺序。
按本发明的蛋白的特征在于N区本质上是第8因子丙-1到脯-740氨基酸序列的复制品或在该序列羧基末端每次截掉一个氨基酸直到最短的丙-1-到天冬-712序列的一个较短序列复制品。C区本质上是第8因子谷酰1638到酪-2332氨基酸序列的复制品或在该序列氨基末端每次截掉一个氨基酸直到最短的丝-1690到酪-2332C序列的一个较短序列的复制品。第8因子氨基酸顺序见表4。
优先的蛋白包括顺序3，3b，7，8和9(如表1所示)。顺序1涉及全部长度的第8因子，顺序2系缺失695个氨基酸活化的第8因子蛋白。
本发明还包括两种分离蛋白的混合物，其一以顺序N为特征，另一以顺序C为特征，顺序N和C的含义如前文所述。
本发明还提供了由PSV2衍生的通用克隆载体，它能被重组到一种表达载体之中，该表达载体含有至少一种偏码上述蛋白质之一的结构基因DNA。它还能在转化的宿主细胞内表达至少一种上述可分离形式的蛋白质。当使用与编码信号顺序的DNA结合的载体时，该蛋白可以被分泌于介质之中。需被表达的DNA可被整合到宿主染色体上，也可使用一个随体复制子而使其在染色体外保存和复制。
按照本发明的表达载体可以特别包括适于在哺乳类细胞中以5′-3′的转录方向被表达的下列DNA顺序一个转录和翻译起始调节区，具有信号顺序的为第8因子多肽编码的开启读码结构，和转录及翻译终止调节区。
对COS细胞较理想是用可被哺乳类细胞转录系统识别的SV40早期转录单位的转录启动子(SVEP)。最好是，将启动子SVep与Rous肉瘤病毒长末端重复启动子(RSV-LTR)按一前一后串接方式结合，二者按正确方向表达。见图1。
然而，在另一些特殊的细胞系中，更适于使用其它启动子，如脊椎动物、哺乳类、病毒的启动子，包括SV40后期启动子，腺病毒启动子，金属巯基组氨酸三甲基内盐启动子(metallothionenpromoter)，βactine病毒，或巨细胞病毒启动子。
成帽位点定位于cDNA插入段之前，并确定了来自表达载体上的转录单位的mRNA的开端。
为了适宜的基因表达，已发现在转译起始密码ATG周围的核苷酸顺序在动物细胞中是重要的。例如，KOZaK(1983)已深入研究了这些区域对于在COS-细胞中胰岛素的表达的影响。因此，修饰起始密码ATG周围的核苷酸顺序可能是重要的。这一工作可经点突变或将外源基因融合于一个高效表达基因的起始区来完成。
象许多可从细胞中正常地分泌到周围培养基中的蛋白质一样，成熟的第8因子蛋白也以信号肽为先导。一般来说，普遍认为信号肽具有能使蛋白穿过细胞膜的特性。对于第8因子多肽链的分泌，宁可使用天然形成的第8因子先导顺序，但其它可能是衍生于天然第8因子信号顺序的信号顺序也同样适用。
信号顺序之后接着含cDNA插入段的片段，该插入段编码既可以是全长蛋白，也可以是按本发明提供的一种新的缺失突变蛋白的成熟第8因子蛋白质。
能以几种方式完成对结构基因有目的的删除，如对全长第8因子cDNA的切割、再修饰和连接，纯化片段，或直接点突变，特别是如Kramer等(1984)(GeneralMethodssection，z)所介绍的圈出突变(loopout)。
终止区可来源于获得起始区的同一基因的3′末端区，也可来自于另一不同的基因。迄今已知和已发现的许多终止区均令同一或不同属和种的宿主细胞满意地接受。终止区可以包括将哺乳类细胞mRNA适当处理所得顺序，即一个小的内含子和多聚腺苷信号。
在组建表达暗盒时，通常将DNA的各种片段克隆于一个适合的克隆载体之中，该载体考虑到了DNA的扩展和修饰，或对顺序的连接和移除等操作。正常情况下，该载体应能够在大肠杆菌中至少以相当高的拷贝数来复制。许多载体很易于供克隆使用，包括PBR322，PML2，PUC7-PUC19，PSP64，PSP65，PSP18，PSP19，PTZ18，PTZ18R，PTZ19，PTZ19R，等载体。
克隆载体以在大肠杆菌中带有一个至少在功能上是有效的复制原点为特征。该克隆载体将有至少一个特定的限制酶切点，而通常是很多特定的限制酶切点，并可包括多种限制点，特别是两个同样酶的限制点供置换。此外，克隆载体将有一个以上的标记以供选择转化体时用。这些标记一般表现为抗细胞毒试剂，如抗菌素，重金属和毒素等，也可是对营养缺陷型宿主的补充，或对噬菌体具有免疫性，载体或暗盒通过适当的限制酶作用，适宜的末端修饰，反复处理，或填平突出部分等方法来得到平钝末端。再经过加入连接体，或加尾等方法。为连接和载体与表达暗盒或其它成分的结合提供互补末端。
某些情况下，需使用一个穿梭载体，它能在需要不同的复制系统的不同宿主体内复制。本发明更愿意使用Simian病毒(SV40)复制原点，它使质粒在COS-1-细胞内增殖(Glu-zman，1981)。
牛多瘤病毒(BPV-1)用于表达载体在C127细胞中的随体维持和增殖(见Howley等，1983)。
为微生物生产选用的建株细胞系或宿主微生物最好是宿主系统。来源于培养的原始组织的正常初级细胞或细胞系适于选用。宿主细胞最好是哺乳类细胞系，如猴COS-细胞，仓鼠CHO细胞或鼠C127-细胞，但某些微生物细胞，如酵母菌，最好是Kluyveromyces，或细菌，最好是枯草杆菌。
为使这些细胞系或带有第8因子密码顺序的表达载体的宿主稳定地转化，以及随后能使插入宿主染色体中的载体扩增，CHO(中国仓鼠卵巢)细胞适于选用。转化必须包括与一种选择标记基因，如dhfr(双氢叶酸还原酶)基因或G418(neo-)抗药基因等，连在一起的表达载体对宿主细胞的转染，以及它在染色体上的整合和对稳定转化体的选择。获得稳定的转化体之后，用标准方法选择第8因子活性和第8因子抗原性。
使宿主细胞系稳定转化的另一方法使用了含有BPV-1-顺序的表达载体。C127细胞是达此目的理想选择。转化包括表达载体对宿主细胞的转染。用中心点(foci)的形成来识别转化体。用标准方法确定稳定的转化体和选择第8因子活性。反之，当表达实现于PSV-2来源的表达载体向COS-1细胞的过渡转化系统时，没有选择步骤。
按照本发明更进一步的内容，提供了按本发明使用培养的转化哺乳类细胞或微生物宿主生产蛋白质的方法，该微生物宿主按照本发明存在于营养培养基中而产生含该蛋白的培养物，由此分离出蛋白质。
本发明更进一步的优点在于所表达的蛋白能从完整的细胞膜或宿主细胞壁分泌到培养基之中。
使用常规技术从培养基中分离和纯化表达蛋白，如使用固相抗体的亲和层析，氨基己基琼脂糖层析，或混合电解质法。
本发明的主要优点是所需蛋白以未断裂的糖基化单链分子形式分泌。经凝胶电泳分离后，它们表现为预计大小的完整单链。没发现象80KDA多肽的降解链，见表3和图3。该现象在制备缺失后的或熟蛋白中是新出现的，并对第8因子蛋白的成功分离与纯化至关重要。
本发明进一步证实，当与缺失的蛋白比较，该蛋白质溶液显示出未曾估计到的很高的第8因子活性(见表2)。还发现较大的缺失导致较高的蛋白产量。随之获得具有较高第8因子活性的溶液。从对抗原决定簇试验的评价(该试验是用以测定第8因子蛋白量)中可以看出培养基中第8因子活性的增加与第8因子蛋白量的增加呈正比。结论是新的第8因子蛋白有与全部长度的第8因子同样的单位蛋白重量活性(比活性)。
按照本发明，表达蛋白适于作为药物学制品，当将其输给哺乳类，包括患有第8因子缺乏症的病人和作为对含该因子抑制体病人的治疗时，它可对抗血友病A的凝血缺陷。该蛋白在生产工艺中通常要与非肠道吸收的赋形剂和其它适宜的赋形剂相混合。
为了适于非肠道吸收，本发明的药物学制品可以常规包括该蛋白的灭菌冷冻干燥制品，使用时加入与受者血液等渗的无菌溶剂而制成溶液。该制剂可以单位容量或大剂量分装，如密封安瓿或小瓶，它们的用法与已知的人第8因子蛋白类似，为增效可加入适宜的佐剂。
按本发明得到的具有第8因子活性的蛋白质，比带有相应较少抗原决定簇的全部长度天然第8因子蛋白更小，所以预期抗原性更弱，从而受者更少诱发抑制体。它们也更少被存在于血友病人体内的抑制因子识别。
一般方法1.克隆技术常规克隆技术参见Maniatis等人的手册(1982)限制酶按制造者的推荐使用，它们可分别从新英格兰生物学试验室(Biolabs)，贝塞斯达研究实验室(BRL)，或贝林格，曼海姆(Boehringer)实验室获取。一般来说处理1μgDNA需要1-5单位的酶。
连接步骤，DNA片段混于琼脂糖凝胶，电泳抽提，过NACS柱(BRL见制造者的介绍)纯化，乙醇沉淀，于含50mM和Tris-HCl缓冲液PH7.4;10mM氯化镁，10mM二硫苏糖醇，1mMATP和T4DNA连接酶(Biolads)中温育。
填充5′末端突出部限制性位点使用DNA聚合酶Ⅰ的大的Klenow片段(Biolabs)。在含10mMTris-HCl缓冲液PH7.7;50mMNaCL，10，mM二硫苏糖醇和20mM未标记核苷酸中温育30℃，15分钟。
3′末端突出部限制性片段末端的降解如Maniatis等(1982)所述，用T4DNA聚合酶来完成。
大肠杆菌的转化可以按经典的氯化钙法(Maniatis等，1982)或Hanahan(1983)法进行。转化体的选择和所需质粒的确定按Maniatis等(1982)方法实行。
从限制性片段的连接体或自制寡核苷酸连接顺序得到的全部组建体均经序列分析检查，以便证实读码结构的完整性和在第8因子编码顺序或表达载体的必须的调节顺序中已排斥在外的核苷酸取代结构。序列分析可以用Maxam和Gilbert(1980)技术或Sanger等人(1977)的双脱氧核苷酸法进行。
寡核苷酸的人工合成可在一种应用生物系统308B型DNA人工合成器内完成。该寡核苷酸经乙醇沉淀法纯化。
2.圈出突变由寡核苷酸指引的圈出突变按双缺口技术(Kramer等，1984)进行。
M13mp8和M13mp9基因组在主要的M13基因上包括两个amber突变，并仅能在大肠杆菌抑制菌株，如JM101(Yanisch-Perron等，1985)中繁殖。取自不含amber突变的M13mp18或M13mp19的重复形式DNA被分离和用EcoRⅠ和HindⅢ限制酶作用以去除多聚连接体区。用琼脂糖凝胶电泳分离出近7.2Kb的限制性M13mp18片段。纯化后的M13mp187.2Kb片段加入含靶片段的单股M13mp8(或M13mp9)DNA和适量的突变诱导剂(1.25nmol/ml)。混合液加热至90℃，10分钟，随后在55℃下退火30分钟。所获双缺口通过用Klenow-片段DNA聚全酶加三磷酸脱氧核苷酸的温育而被填充，再用T4DNA连接酶连接。所获闭环双股DNA通常转染非抑制性大肠杆菌菌株HB2154(mut1+)及其HB2151(Carter1985)。由于噬菌体基因中有琥珀突变使得含靶片段的M13mp18(+)DNA链不能增殖。反之，含突变片段的M13mp8(-)互补DNA链能够对噬菌体繁殖起到模板作用，所致噬斑应该全部或至少富含突变片段。取自认定为突变体的单股DNA被分离，再用适当的引物将其顺接于突变下游的50-100个硷基对区。
3.转染，过渡表达，代谢标记和凝胶电泳以COS-1细胞和PSV2衍生表达载体为基础的一个类第8因子组分过渡表达系统分泌于转染细胞培养基之中。按Lopata等(1984)和Luthman与Magnusson(1983)所述，转染原本使用载体DNA的DEAE-右旋糖2小时内沉淀物，随后2小时内经氯喹休克以加强转化。用于COS-1-细胞生长和维持的培养基是添加了热灭活10%(v/v)小牛血清的Iscove氏DMEM培养基。转染后将培养基吸水保鲜48小时，再过48小时后进行收获。
转染细胞中的蛋白质代谢标记过程使用无血清的RPM1培养基完成。转染后两天用50u Ci/ml的L-35S-蛋氨酸(Amersham，1985;370M Beq/330μl特异活性1000ci/mmol以上)温育1小时，接着在收获控制条件培养物之前再用1mML-蛋氨酸温育过夜。为了抑制蛋白质降解衰变，通常是在收获后将蛋白酶抑制剂，如PMSF加入到控制条件培养基中。当需抑制蛋白糖基化时，向控制条件培养基中加入终浓度0.001mg/ml的tunicamycin。
4.免疫沉淀分析为确定制造出的第8因子蛋白质分子大小，使用由血浆来源第8因子诱发得到的单克隆和多克隆血清抗体，先结合于蛋白A-琼脂糖(每10mg蛋白A-sepharose对10μl血清)。接着与从转化的COS-1细胞分泌的类第8因子样组分代谢标记物共同温育。按Laommli(1972)法在5%聚丙烯酰胺凝胶电泳上用10%β-巯基乙醇还原后分离沉淀的类第8因子分子。
5.第8因子的生物学活性按制造者Kabi-vitrum所述进行产色素活性或Kabicoatest试验，除了全部容量分为四份和每次检查维持培养基25μl以外。第8因子类蛋白在15分钟内被活化，接着加入产色底物(S2222)。
标准凝集或血凝试验(所谓activatedpartialthromboplastintime试验)按Veltkamp等(1968)所述使用血友病人血浆进行。检查前维持培养基被柠檬酸化抗凝处理。
按标准的贝塞斯达方法(Kasperc.k等，1975)测定抑制作用，所用免疫球蛋白经离子交换和蛋白A-琼脂糖层析纯化获得。
第8因子生物学活性试验的标准品是柠檬酸化血浆库(经浓度0.5mM)假定它每毫升含1个单位的第8因子活性或抗原性。
6.抗原性的决定，以便确定第8因子的存在为了确认培养基中的第8因子抗原，使用了Riethorst，w等人建立的新的ELISA(酶联免疫吸附试验)。
以适当稀释的特异性单克隆抗体αCagA(5mg/L)(溶于0.05M碳酸盐缓冲液PH9.8)200μl/每孔包被ELISA塑料板孔。封好后在4℃温育过夜。每两次温育之间，反应板都应用含0.05%吐温20的磷酸盐缓冲液冲洗三次，每次至少一分钟。
试验样品(正常血浆)系列稀释后加入反应孔内(200μl/每孔)。反应板封好后37℃温育2小时，勿震荡。稀释抗原所用缓冲液含50mMTris-HCl，2%牛血清白蛋白和1.0MNaCl，PH7.4。
αCag117-辣根过氧化物酶结合物用含50mMTris-HCl缓冲液，0.2%吐温20，和1.0NaClPH7.4缓冲液稀释10000倍(依据敏感度的需要)。每孔加入该稀释液200μl;反应板封好后在37℃暗处温育2小时。
冲洗反应板后，每孔加入150μl用0.1M醋酸/拘椽酸缓冲液PH5.5新配制的四甲基联苯胺(TMB)液(0.1g/l)和过氧化氢(0.006%)，室温下暗处温育30分钟。加入150μ12N硫酸终止酶反应，用ELISA微量测定仪在光波450nm下测定吸光率。
7.抗第8因子单克隆和多克隆抗体的制备以其定性以纯化的人类第8因子-VonWillebrand因子复合物免疫Balb/c品系小鼠来制备单克隆抗体。按VanMourik和Mochtar(1970)所述，纯化过程经对结晶沉淀物的琼脂糖凝胶过滤法或用于治疗目的的第8因子浓缩制品(由荷兰红十字输血服务中心实验室提供，阿姆斯特丹，荷兰)来完成。按Galfre′等(1977)所述进行淋巴细胞杂交。用以分离产生抗第8因子单克隆抗体克隆的技术细节另有提供(Stel，1984)。抗第8因子单克隆抗体与第8因子多肽的反应按英国专利申请GB8617594所述鉴定。
要得到抗第8因子多肽的多克隆抗体，根据标准步骤用层析法纯化的第8因子制剂免疫家兔(见stel，1984)。再根据以前的专利申请GB8617594所述的免疫吸印法鉴定所得抗体，该方法用纯化的第8因子-VonWillebrand因子或由SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离纯化的多肽进行。然后将该抗体转移到硝酸纤维纸上作为靶蛋白。分析结果表明产生了三个明显不同的多克隆抗血清(RH63271，RH63272，RH63275)。这些抗血清与80KDa双带，92KDa多肽及更大的多肽反应，它们也与较小的肽反应。
图1表示为全长第8因子蛋白编码的表达载体(PCLB201)的结构。
环形质粒PCLB201显示了在从质粒PSV2(Gorman，1985;Mulligan和Berg，1981)衍生的4217对硷基的HindⅢ-BglⅡ片段中EcoRⅠ位置有断裂。图还指明了旱期SV40启动子区SVep。该载体也含有从质粒PRSV-neo(Gorman，C，1985)衍生的NdeⅠ-HindⅢ片段，质粒PRSV-neo带有插入SalⅠ点的Rous肉瘤病毒长末端重复区(LTR)。全长第8因子是由7440对硷基的SalⅠ-HpaⅠ片段编码。
该片段用第8因子cDNA表示(H＝HindⅢ，Sal＝SalⅠ)。组建PCLB201时失去的限制性内切酶切点在括号内。质粒大小用千对硷基(Kb)表示。
图2过滤表达第8因子蛋白缺失突变的载体a.PSV2衍生的载体的标志两个位置随机的启动子SV40旱期转录启动子(SVep)和Rous肉瘤病毒长末端重复区(RSV-LTR);带帽位点(Capsite)和信息RNA的5′端;携带具有起始密码(ATG)，开链读码和终止密码(TGA)的全长第8因子编码区的cDNA插入体;具有短内含子和从SV40DNA衍生多腺苷信号(polyA)的信息RNA3′端非编码区b.表示携带全长第8因子编码cDNA的7440对碱基片段SalⅠ-HpaⅠ。也指出了读码的起始和终止密码。还显示了在全长cDNA内限制内切酶切点涉及组建PCLB202和PCLB203的突变。
c.第8因子蛋白的氨基酸顺序图。显示了19氨基酸长信号肽和血浆第8因子的显性或重复结构，A1，A2和A3是同质氨基酸序列。B是一个单一区，而C1和C2又是同质序列(Vebar等，1984)。给出了靠近A和C重复区的氨基酸位置。图下端的蛋白酶切点，这些切点剪接第8因子，已用箭头标出了活化的蛋白质c(APC)，凝血因子(Ⅱa)，活化的凝血因子X(Xa)和类胰蛋白酶(用？表示)。还说明Xa也一直切到Ⅱa-和APC切点(Eaton等人，1986a;Fay等人，1986)图中都给出了它们的切点，B区含有多个切点。
d.活化第8因子的亚单位结构92KDa和80KDa的第8因子亚单位分别用92K和80K表示。还给出了全长顺序内氨基端和羧基端氨基酸的位置。
e.表示cDNA和在B中提及PstⅠ和BamHⅠ点间含有直接融合的PCLB202蛋白的结构。显示所得蛋白在丙-867和天门-1563间含有一个肽键。该蛋白全长为1637个氨基酸。
f.表示cDNA和含为4个额外氨基酸编码的MluⅠ连接子序列的PCLB203蛋白的结构，这四个氨基酸桥接着b所示的MaeⅢ点和HgiAⅠ点。该蛋白全长为1411个氨基酸。
e，f，g给出了重复区边界位置的界碑和特异蛋白酶切点，其解释见上面。
图3用免疫沉淀法及电泳法测定n种缺失突变的第8因子蛋白分子量(见一般方法3)。
出现的放射自显影表明是载体PCLB202(2道)和PCLB203(1道)产生蛋白的泳道，还指出了分子量的参照标志物(见表3)。
例1组建PCLB201以前的申请GB8617594和GB8630699中已叙述内容，如从人肝脏中提取第8因子的mRNA，制备，纯化和鉴定其cDNA，以及质粒PEP121中组建质粒PCLB99均包括在本申请中。
为在细胞培养系统中表达，已组建和修饰了从Mulligan和Berg(1981)的PSV2载体衍生的一个载体。质粒PSV2.tPA(VanZonneveld等，1986)的单一HindⅢ点修饰成SalⅠ位点。为此，将HindⅢ粘性未端变成平钝端，SalⅠ-连接子(5′-CGTCGACG-3′);连接到这些末端，筛选含SalⅠ位点的质粒PCLB91。这个质粒与PSVtpA的不同仅在于它含插入HindⅢ点中的一个SalⅠ连接子。
纯化来自PCLB89含有第8因子cDNA(见表4)的长7440碱基对的SalⅠ-HpaⅠ片段(见Maniatis等人，1982)，用SalⅠ和BglⅡ酶解，将其插入PSV2衍生的载体PCLB91中。筛选出的表达载体PCLB200含有完整的SalⅠ切点，其HpaⅠ点连接到BglⅡ点，恰好吻合。
将一个额外的Rous肉瘤病毒长末端重复区序列作为一个附加转录启动子接到质粒PCLB200上。用NdeⅠ和HindⅢ酶解质粒PRSVneo(Gorman，1985)，再与DNA聚合酶的Klenow片段一起温育，制造平钝端，提取0.6千对碱基片段，插入到同样被变成平钝端的PCLB200的SalⅠ位点中。所得表达载体PCLB201，在转录起始点右边含RSV-LTR，再提取全长第8因子的cDNA(见图1)。
例2组建PCLB202如专利申请GB86175-94和GB8630699中所述，在质粒PGB860中组建一个突变体，该突变体在第8因子序列的第2660个核苷酸(见表4)到4749个核苷酸一段缺失。PGB860中第8因子的编码DNA在中心区含有一段为695个氨基酸编码的缺失。表达载体PCLB202是从PGB860和PCLB201衍生的。两种质粒均用KpnⅠ和XbaⅠ限制酶酶解。在PGB860中第8因子中心区含有缺失的3.1千对碱基KpnⅠ-XbaⅠ片段被连接到来自PelB201的7千对碱基的KpnⅠ-XbaⅠ片段上。所得质粒PCLB202具有完整的KpnⅠ和XbaⅠ切点。图2e图解了它的结构。
例3组建PCLB203将来自PCLB897440对碱基的SalⅠ-HpaⅠ片段(图1)插入用SalⅠ和SmaⅠ酶切的质粒PsP64中(见Melton等人，1984)。所得质粒含一个完整SalⅠ点，并将HpaⅠ端连接到SmaⅠ端。
PCLB101的组建包括下列步骤(括号中数字参照表Ⅳ)步骤1.用KpnⅠ和TthlllⅠ酶解质粒PCLB100，得到一个631对碱基的片段从KpnⅠ(1817)到TthlllⅠ(2447)。用MaeⅢ(切点在2199)切纯化的631对碱基长的片段，填平所得MaeⅢ粘性端，得到383对碱基片段。
步骤2.用ApaⅠ和BanⅠ酶解质粒PCLB100，提取669对碱基的ApaⅠ(6200)-BanⅠ(5532)片段。
步骤3.用HgiAⅠ酶解质粒PCLB100，产生634对碱基的HgiAⅠ片段，将其与T4DNA聚合酶温育，使其变成平钝端。再用BamⅠ酶解该片段，得到565对碱基的片段。
步骤4.用ApaⅠ和KpnⅠ酶解质粒PCLB100，制造一个含5.9千对碱基长的片段ApaⅠ(6200)-KpnⅠ(1817)的载体序列，保存并在大肠杆菌中增殖。
步骤5.纯化步骤1-4所得片段，将等量的各片段与10倍摩尔数的过量MlnⅠ连接子(CCACGCGTGG)连接，得到质粒PCLB101。
鉴定在MaeⅢ和HgiAⅠ点间(见图26)含MluⅠ-连接子的质粒PCLB101。证实了KpnⅠ，BamⅠ和ApaⅠ点均是完整的。图2f图解天冬-712和谷氨酰-1638间(见表4)的四个额外氨基酸(脯-精-缬-丙)。
质粒PCLB203是直接从PCLB101和PCLB201衍生的。两种质粒均用KpnⅠ和XbaⅠ酶解。将来自含有缺失的PCLB101的2.4千对碱基片段KpnⅠ-XbaⅠ连接到PCLB200衍生的7.0千对硷基长KpnⅠ-XbaⅠ片段。筛选的质粒PCLB203具有完整的KpnⅠ和XbaⅠ切点，它们的结构图解在图2f中。
例3a组建PCLB212用Kranser等人所述圈出突变技术(loop-outmutagenesis)(见一般方法2)组建PCLB212。用下列寡核苷酸使第8因子cDNA中心区缺失突变3′TTCCAAAGATCAACACTGGTT引物DTTGGGTGGTCAGAAC5′在第8因子cDNA内发生为第713(赖)到1674(丝)氨基酸编码的序列(引物D)的缺失。
其相应的蛋白质与全长第8因子蛋白比较含有925个氨基酸的内缺失部分。
为得到圈出突变的靶片段。选用来源于PCLB203(见例3)的1.4千对碱基的HindⅢ-PstⅠ片段。HindⅢ点的核苷酸位置(见表4)在全长第8因子序列的1025核苷酸处，恰好在欲饰区的上游;PstⅠ点在5165核苷酸处，恰好在该区下游。图1指出了这些点。将1.4千对碱基片段亚克隆到M13mp9中，然后进行圈出突变。筛选具有准确缺失的片段后再将含所需缺失的HindⅢ-PstⅠ片段的KpnⅠ-PstⅠ部分插入到合适的表达载体中，插入是通过制备具粘性单一限制酶末端(数字参照表4)的片段完成的，步骤如下步骤1为表达突变第8因子分子，组建一个新质粒PCLB211。因此，从PCLB89衍生有7440对碱基(见图1)的SalⅠ-HpaⅠ片段插入表达载体PSVL(pharmacia，N，27-4507-01，Uppsala，Sweden)，使其能在哺乳动物细胞中从晚期SV40启动子转录。用XhoⅠ和SmaⅠ酶解质粒PSVL，所得质粒PCLB211含连接到SalⅠ端的XhoⅠ端，因为这些酶的5′端突起端是相同的，SmaⅠ端连接到HpaⅠ端。
步骤2用ApaⅠ和SalⅠ酶解质粒PCLB211，提取长1.4千对碱基的ApaⅠ(6200)-SalⅠ(该点在PCLB211的PSVL部分中是唯一的)片段。
步骤3用NdeⅠ，PstⅠ和ApaⅠ酶解质粒PCLB100，提取363对碱基的PstⅠ(5165)-NdeⅠ(5527)片段和674对碱基的NdeⅠ(5527)-ApaⅠ(6200)片段。
步骤4用KpnⅠ和SacⅠ酶解质粒PCLB100，产生一个1799对碱基的KpnⅠ(1817)-SacⅠ(19)片段，提取之。
步骤5用SalⅠ和SacⅠ酶解质粒PCLB211。得到一个4.5千对碱基的SalⅠ(在PSVL载体中的唯一切点)-SalⅠ(19)片段。
步骤6用KpnⅠ和PstⅠ酶解具有含序列分析证实有所需缺失的Hind(1025)-PstⅠ(5165)片段的M13噬菌体。得到并纯化584对硷基的PstⅠ(5165)-KpnⅠ(1819)片段。
步骤7将步骤2到6分离所得6种片段等量混合及连接。筛选含所有片段的质粒。质粒PCLB212表达典型化合物3b(见表2)，化合物3b不同于化合物3(见图3f)，由于它失去MluⅠ连接子和因而失去相应的四种氨基酸。
例4组建PCLB208，PCLB209，和PCLB210用Kramer等人(1984)所述(一般方法2)圈出突变技术组建PCLB208，PCLB209，和PCLB210。用下列寡核苷酸进行第8因子cDNA中央区的缺失突变3′TTACGGTAACTT-GGTTCTCTT引物a
TATTGAGCATGATGA5′3′TTACGGTAACTTGGTTCTAGT引物bCAACTTTACTTCTTC5′3′TTACGGTAACTTGGTTCTTCG引物cAAAGTTTTCTTTTGT5′由于在第8因子cDNA产生了为丝-747到精1648(引物a)，丝-741到异亮-1668(引物b)，及丝-741到精1689(引物c)编码序列的内部缺失，相应的蛋白质分别含有908，928，和949个氨基酸残基的内部缺失。
为得到一个圈出突变的靶片段，由PCLB101衍生的0.8千对碱基的片段组建如下用EcoRⅠ酶解质粒PCLB101，将EcoRⅠ切点填平，再用KpnⅠ进一步酶解。分离479个碱基对的由KpnⅠ(在表4的核苷酸号为1819)开始到EcoRⅠ(2279)平端片段。用BamHⅠ酶解质粒PCLB101，填平粘性末端，用PstⅠ进一步酶解。第二个长416个碱基对的从BamHⅠ(4746)(末端已填平)到PstⅠ(5165)的片段被分离出来。将这些片段等摩尔连接，亚克隆到M13mp19amber中。含有从欲修饰区上游的1819核苷酸到该区下游5165核苷酸的895对碱基的KpnⅠ-PstⅠ片段并具有第8因子区编码序列大缺失区的M13噬菌体被选用于圈出突变。选择在M13噬菌体中的引物a，b和c得到准确缺失的片段后，将含所需缺失的KpnⅠ-PstⅠ片段插入来源于PCLB211的合适表达载体，见例36，其步骤如下，制备具有单一限制酶粘性末端的片段(核苷酸号参见表4)步骤1用ApaⅠ和SalⅠ酶解质粒PCLB211。分离1.4千对碱基的ApaⅠ(6200)-SalⅠ(PCLB211质粒中PSVL部分的唯一切点)片段。
步骤2用NdeⅠ，PstⅠ和ApaⅠ酶解质粒PCLB100，分离363对碱基的PstⅠ(5165)-NdeⅠ(5527)片段和另一个674对碱基的NdeⅠ(5527)-ApaⅠ(6200)片段。
步骤3用KpnⅠ和SacⅠ酶解质粒PCLB100，分离产生的1799对碱基的KpnⅠ(1817)-SacⅠ(19)片段。
步骤4用SalⅠ和SacⅠ和酶解质粒PCLB211。得到4.5千对碱基的SalⅠ(PSVL载体的唯一切点)-SacⅠ(19)片段。
步骤5用KpnⅠ和PstⅠ酶解含有所需突变片段的M13噬菌体。分离含有三种所需突变的KpnⅠ-PstⅠ片段。
步骤6分离步骤1-5所得6种片段，等摩尔数混合并连接。筛选含所需片段的质粒。用上面所示的引物a，b，或c组建表达表Ⅰ所示举例化合物的新表达载体1.用引物a组建的表达化合物7的PCLB208。
2.用引物b组建的表达化合物8的PCLB209。
3.用引物c组建的表达化合物9的PCLB210。
用不同启动子和细胞株可提高表达的水平。
例5组建生产具有第8因子活性蛋白的稳定细胞株，a.在CHO细胞中表达用磷酸钙沉淀技术(GramanVanderEb，1973)将质粒PCLB203(10μg)和PAdD26sv(A)-3(1μg，kaufman和sharp，1982)引入DHFR缺陷型CHO细胞中(chasin和Urlaub，1980)。如Kaufman和Sharp(1982a)所述，用逐滴加入增加氨甲喋呤(MTX)浓度的方法使第8因子和DHFR编码序列扩增。将抗200nM氨甲喋呤的转化体取出，建立稳定的在宿主基因组含为第8因子编码DNA的细胞株。这些细胞株可使每毫升培养基产生约95毫单位的第8因子活性。通过增加氨甲喋呤浓度进一步扩增第8因子编码序列，从而使分泌到培养基中第8因子的量进一步增加。
建立生产具有第8因子活性蛋白质的细胞株是合适的。
为大量生产这种凝血因子，也可用其它启动子(如巨细胞病毒启动子或腺病毒启动子)和/或细胞株(如人293细胞，骨髓瘤细胞或诸如肝细胞的特异分化细胞)。
b.在C127细胞株中表达如上所述，表达载体可被引入真核细胞中，它们整合到宿主细胞的基因组中。随后再扩增表达暗盒(表达序列)。对表达载体整合的补充是作为随体稳定地保存在细胞内，例如用随体BPV系统(Howley等人，1983)表达一种突变第8因子蛋白。BPV-1基因组(BamHⅠ切的)首先被引入PTZ18R(来自Pharmacia公司)用BamHⅠ切的衍生物，PTZ18R在BamHⅠ切点的两处含有XhoⅠ点。随后用XhoⅠ酶切所得PTZX-BPV质粒，得到2.9千对碱基的PTZ片段和具有Xho-Ⅰ突端的8千对碱基的BPV片段。后一个片段连接到质粒PCLB212，该质粒在它唯一的SalⅠ切点处被切(即在原始PSVL载体的2040位置)。所得表达载体PGB881含有SV40晚期启动子，为缺失925个氨基酸的第8因子编码的cDNA(主要为B-部分)和SV40晚期聚腺苷信号。由于有BPV-基因组存在，这个载体在合适宿主细胞，如小鼠C127细胞中可以随体形式保存下来。用磷酸钙沉淀技术(Graham和VanderEb，Supra)将质粒PGB881(10μg)转染到C127细胞中。转染后14天分离Foci，随后建立稳定的细胞株。一些细胞株可在每毫升培养基中产生40个毫单位的第8因子活性。
一般在本发明范围内可改变表达载体，特别是启动子和/或启动子/加强子组合(Hurwitz1987)以及宿主，目的是提高本发明第8因子活性蛋白的水平。
例6表达重组第8因子DNA和测试产生的蛋白将根据上述例子得到的表达载体用DEAE转染技术(见一般方法3)引入Cos-1细胞。转染后4天收集控制条件的培养物。测试产生的蛋白。
根据一般方法部分(第5章)用(1)标准凝血或成血块试验和(2)成色活性试验(Kabicoatest)测定控制条件培养物中第8因子的活性。加入已知是从血浆衍生具有第8因子活照泳道出现一个较小的带。
同样从表3看出，似乎第8因子是糖蛋白，与天然第8因子相似。因为在有或无已知是天冬氨酸连接的糖化抑不同蛋白的结果均收集在表2A和ⅡB，表明缺失突变蛋白质甚至影响92KDa区，显示第8因子的凝血活性。
用ELISA试验(见一般方法6)确定第8因子蛋白量。从表2A和ⅡB可看出培养液中第8因子活性是随着其中第8因子蛋白的含量增加而增加的。
用一般方法部分第3章所述的凝胶电泳确定产生的第8因子蛋白的大小。从图3及表3资料可推导出新的第8因子蛋白分子大小与糖蛋白分子相仿。对照泳道出现一个较小的带。
同样从表3看出，似乎第8因子是糖蛋白，与天然第8因子相似。因为在有或无已知是天冬氨酸连接的糖化抑制剂时，形成的蛋白大小有明显的区别。
表4第八因子CDNA插入到pCLB89中。第八因子从丙-1到酪-2332的氨基酸顺序和它的信号序列蛋(-19)到丝(-1)。下面对应有其编码的核苷酸序列。苯丙-973是由TTC编码。
权利要求
1.其氨基酸序列如下式，具有第8因子活性的蛋白质N--L--C其中N代表的区包括蛋白氨基末端伸展的氨基酸序列，C代表的区包括蛋白羧基末端伸展的氨基酸序列，而L代表一个连接的肽键或1到20个氨基酸的序列，其特征在于N区本质上是第8因子丙-1到脯-740氨基酸序列的复制品或在该序列羧基末端每次截掉一个氨基酸直至最短的丙-1到天冬-712序列的一个较短序列复制品，C区本质上是第8因子谷酰-1638到酪-2332氨基酸序列的复制品或在该序列氨基末端每次截掉一个氨基酸直至最短的丝-1690到酪-2332 C序列的一个较短序列的复制品。
2.根据权利要求1所述蛋白，其中N和C分别代表表Ⅳ所示顺序的本质上为丙-1到天冬-712序列和谷酰-1638到酪-2332序列复制品的氨基酸序列，而L是脯-精-缬-丙序列或一个肽键。
3.根据权利要求1所述蛋白，其中N和C分别代表Ⅳ所示顺序的本质上为丙-1到天冬-740和丝-1649到酪-2332或丙-1到精-740和丝-1669到酪2330或丙-1到精740和丝1690到酪-2332序列复制品的氨基酸序列，而L是一个肽键。
4.为权利要求1到3中任一种蛋白质编码的DNA分子。
5.表达载体，它含有调节序列和为根据权利要求1到3中任一种具有第8因子活性的蛋白编码的插入DNA，能转化哺乳动物细胞和微生物宿主使其表达至少一种可分离形式的具第8因子活性的蛋白质。
6.根据权利要求5的载体，其特征在于其调节序列含有SV40旱期启动子和RSV-LTR启动子，前者随机位于后者的上游。
7.本质上是PCLB202，PCLB203，PCLB208，PCLB209，PCLB210，PCLB212中任一个的表达载体的复制品。
8.用权利要求5-7中任一种表达载体转化的哺乳动物细胞。
9.用权利要求5的表达载体转化的微生物宿主。
10.由权利要求5-7中任一种表达载体转化的COS细胞，CHO细胞或小鼠C127细胞衍生的哺乳动物细胞培养物。
11.制备具有第8因子活性蛋白的方法，包括将权利要求8-10中任一种哺乳动物细胞或微生物宿主细胞培养在营养物培养基中，产生含有该蛋白的培养物，然后从中分离出该蛋白。
12.用于治疗第8因子缺陷病的药物组合物，包括权利要求1-3中任一项的蛋白及药物学可接受的载体或稀释剂，如果需要的话，可加一种或多种佐剂。
13.药物组合物，包括一种无菌冷冻干燥的权利要求1-3中任一项的蛋白质，它可重新制成治疗第8因子缺陷病的与血液等渗的无菌溶液。
14.无菌的具有权利要求13组合物的容器。
全文摘要
本发明提供通过908-949氨基酸缺失制备突变第8因子cDNA的方法。cDNA在转化的COS细胞中表达，得到在赖-338到谷酰-1638间氨基酸有相应缺失的第8因子蛋白。所得蛋白似乎能纠正血友病A病人的凝血缺陷，该蛋白具有完整的链，表现出相对高的表达水平。
文档编号C12N15/12GK1030609SQ8810348
公开日1989年1月25日 申请日期1988年6月11日 优先权日1987年6月12日
发明者瓦·奥耶·阿尔伯特·约翰森·约瑟夫, 帕尼科克·汉森, 弗比特·马蒂尼·菲利浦斯, 瓦利·罗伯特·威廉姆 申请人:吉斯特-布罗卡迪斯公司