专利名称：人工培育的伪狂犬病病毒及其疫苗的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种(非自然界存在的)伪狂犬病病毒(PRV)，它具有一个或多突变基因组。
伪狂犬病是一种除马以外所有家畜的共患病，能引起严重的损伤，特别是猪和牛，猪为伪狂犬病病毒的自然宿主。PRV是一种疱疹病毒，又称Aujesky's病毒。感染PRV的猪出现呼吸器官的疾病和脑炎，最终导致死亡。
PRV由鼻道感染动物，并在上呼吸道和消化道的粘膜内开始增殖，沿神经侵害脑。感染程度可表明为急性到亚临床型各种症候，主要取决于病毒的毒力和感染动物的年龄。
为了限制感染动物的死亡和生长迟缓所造成的经济损失，对此病需进行免疫接种。为此研制的致弱活苗和灭活死苗都是可用的，但一般来讲更喜欢用致弱的活苗。因活苗容易制备，成本低廉。
最初研制的弱毒活苗存在一些缺点。一般来讲，这些疫苗的研制是使毒株在培养细胞上进行一系列传代(50-900代)，从而导致病毒不能控制的突变，结果这样的疫苗组成是非同源的，这种非同源的混合物中含有未知毒力和未知保护力的变异病毒。此外，这种病毒还存在毒力恢复的危险。
基因工程技术的发展揭开了克服上述缺陷而获得弱毒活苗的可能性。文献描述PRV基因组的结构(Virol.97 151-163(1979))表明PRV基因组含有大约150，000对核苷酸，对2个反转重复和2个独立序，一个短序列和一个长序列，分别称之为Us和Ul。上述PRV根据DNA序列被划分为D-疱疹病毒。
强毒PRV的NIA-3株的基因如
图1所示显示HindⅢ和BamHI的限制内切部位，反转重复被证明为IR1和IRr，此外长序列(Ul)和短序列(Us)也在图中注明。
普通病毒学杂志(J.gen.Virol.)68卷523-534(1987)论述了PRV缺失突变的NIA-3株，其毒力大大降低，但仍能诱导足够高的中和抗体滴度，因此，这些突变株适用于作疫苗生产，缺失位于BamHI片段7的MluI-BgⅢ片段内。很清楚，这些突变引起糖蛋白gI和gp63基因编码功能的丧失。上述的这些突变株还在HindⅢB片段末端周围的缺失，这种伴随的缺失仅引起轻微的毒力降低。
现在已发现，经同野毒型PRV基因组相比较，PRV突变株基因组具有蛋白激酶(PK)和/或28K基因由于基因控制而丧失功能，但PRV突变株仍具有复制能力。
此外，还发现PRV突变株的基因含有已丧失功能的蛋白激酶(PK)基因，这种突变株有一定毒性，但较野毒型已下降，仍具有良好的免疫原性。另外，28K基因功能的丧失没有检测到是否对于毒力和免疫原性有影响。
事实上，PRV的蛋白激酶基因和28K基因不影响病毒繁殖，这就能使有利的突变基因引入到这些区域内。因此，本发明涉及的伪狂犬病毒，(非自然界中存在的)，其蛋白激酶基因区和(或)28K基因区含有突变的基因;本发明还涉及含有这样病毒的疫苗;以及制备疫苗(防制猪感染病原)的方法。根据本发明，伪狂犬病毒被制成具有免疫特性的药用组分。
突变是在上述区域内遗传信息的改变，有关的信息存在于自然出现的伪狂犬病毒的这些区域内。突变包括核酸替换，缺失、插入或倒位，或它们的结合。特别是本发明涉及的PRV在上述一个或2个区域内有缺失和/或插入。
PK基因定位于Bam HI片段10上，就是说在编码糖蛋白gx序列的上游，编码28K蛋白的序列位于11K基因的下游，(Bam HI7片段转换为12片段)。
PK基因的DNA序列已被确定，如图2所示，转录开始位点由水平箭头所示，TATA基因盒序列由画线注明，IR意为反转重复，gx基因的起始密码子是在1395位置上。
28K基因的DNA序列如图3所示，转录的开始位置由水平箭头所表示，TATA基因盒序列如画线所示。Poly-A-位置如双股线所示。反转重复由IR表示，DR表示直接重复(26bp)。11K基因的终止密码子在位置7上。
图4是PRV的已知的Us区域中7个基因的位置。图4A是丧失功能的PK基因的插入突变株HindⅢB片段的图解，所述的PK基因将在后面论述。图4B是丧失功能的28K基因的缺失突变的HindⅢB片段图解，所述的28K基因也将在后面论述。
在图4中，BamHI的限制性位置由B所表示，Bg 1Ⅱ用Bg表示，HindⅢ用H表示。
编码PK和28K蛋白DNA序列的位置由下列程序所确定。
gx1170核苷酸上游的起始阅读框架(下面用ORF表示)完全位于Us区内(图2)，体外转录和翻译的试验已经肯定了ORF的存在，假如在163位置上第一个ATG密码子作为翻译起始密码子，就可翻译出390个氨基酸的蛋白(43K)，然而，mRNA图谱实验表明在325位置上第三个ATG密码子可能是非常重要的翻译起点，蛋白可能为336个氨基酸长度(37K)。
早在感染后2个小时，由PRV感染的组织细胞中检测到由这个区域的转录体。2.7kb mRNA的5'-末端完全由引物延长实验所确定。发现2个转录起始位点超过95%的mRNA的起始位点在258，260或261的位置(分别为C.U或A)，因此为编码37K产物。另一部分mRNA起始位点在99位置上，因此为编码43K产物。
蛋白含有一个丝氨酸/苏氨酸的蛋白激酶的保守区段，(科学241、42-52(1988)它与疱疹病毒1型(HSV-1)Us3编码的蛋白激酶是同源的(J.Mol.Biol 181，1-13(1985))，因此该PRV蛋白可能是在PRV感染的细胞中发现的38K蛋白激酶(Eur.J.Biodem 152，57-65(1985)和Eur.J.Biodcem 167，507-512(1987))。
28K蛋白11K的768核苷酸下游的ORF编码256氨基酸的蛋白(28K)(图3)。体外转录或翻译已证明了这种ORF的存在。最低程度上28K蛋白是和HSV-1的Us2蛋白同源(J.Mol.Biol，1981，1-13(1985)。
早在培养细胞感染的2个小时，28K特异的mRNA就能检测到，然后感染5个小时，转录水平大大增加。
借助于引物扩增实验可以确定1.15kbmRNA的5'-末端。mRNA在146、147、148或149的位置开始，(分别为C、A、C或A)。图3还显示了反转重复序列的一小部分，它含有5个26bp相同的直接重复序列(较短的一个为24bp)。
根据目前突变的发明，PRV的区域可由含有编码PK蛋白或28K蛋白基因序列的核酸为特征和有这些基因5'和3'末端的核酸序列为特征，因此这些侧边序列不编码多肽。因而，区域还含有一些所涉及基因的调节和表达的重要序列。
根据本发明，这样的突变可能存在于PK基因区和/或在28K基因区，这些区域由1-1394核酸序列为特征，如图2所示，或图3表明的7-1725的核酸序列为特征。
更可取的是，突变存在于编码PK蛋白和/或编码28K蛋白的基因上，非常适合于插入的区域位于163-1332的核酸序列内，如图2所示，和232-999核酸序列内，如图3所示。
例如，更适合的突变是来源于1个或更多猪病原体基因序列的核酸插入，但不同于PRV。这些也是含有与诱导保护性免疫应答有关的遗传信息的核酸序列。根据本发明，用这样重组病毒免疫接种动物之后，病毒能在靶细胞内增殖，因此建立了含有外源信息的许多载体病毒。随后，这种病毒再次感染靶细胞，又开始新的增殖循环。结果，大量外源的基因产物提供给宿主的免疫系统，这和亚单位疫苗是不同的。
尽管不同于PRV的病原体基因的插入可能存在于蛋白激酶基因区内或存在于28K基因内，或这2个区内，但用于疫苗在PRV株基因插入的状况下，28K基因更适合一些，因为编码28K基因的核酸序列的功能丧失不影响PRV突变株的繁殖，毒力和免疫原性。
更可取的是，PRV载体的基因组含有把外源基因引入到28K基因内或/和引入蛋白激酶基因内，这样实际上PRV载体就是由gI糖蛋白和/或胸腺嘧啶激酶缺失而致弱的PRV。
外源核酸序列的插入可在上述区内任何适宜的位置内完成，而PK基因和/或28K基因完全或部分缺失。
譬如，若考虑将外源遗传信息插入到PRV载体的遗传信息可选择一些病毒，如猪霍乱病毒、细小病毒、传染性胃肠炎病毒、猪地方性腹泻病毒和流感病毒，或细菌性病原，如多杀巴氏杆菌、支气管败血性博代氏杆菌、胸膜肺炎放线菌、猪链球菌、猪痢疾密螺旋体、大肠杆菌和钩端螺旋体，或支原体，例如猪肺炎支原体和猪鼻支原体等。
PRV亚基因片段中病原体核酸序列的克隆技术并随后将这些序列整合到PRV基因组中的技术一般是已知的，举例讲，由亚基因片段重组的PRV构建方法见M.Van zijl等文献(J.Virol 62，2191-2195(1988))。
在研究PRV蛋白激酶和28K基因的功能丧失分别对繁殖和病毒特性的影响中，应用寡聚核苷酸插入引起涉及的基因区内突变，寡聚核苷酸具有翻译终止信号，此外含有酶限制位点，这种限制位点不存在于NIA-3上。应用的寡聚核苷酸有下面的顺序5'-TAGGCTAGAATTCTAGCCTA-3'3'-ATCCGATCTTAAGATCGGAT-5'这种寡聚核苷酸在2个方向上含有3个翻译终止密码子，TAG，每一个可能有3个阅读框架，此外，它还含有EcoRI识别位点，GAATTC，另外，寡聚核苷酸是一个回文结构，这种双股寡聚核苷酸插入到任何编码蛋白的基因内，任何方向，任何阅读框架中都能导致那个基因RNA的翻译终止。在寡聚核苷酸EcoRI识别位点的存在(NIA-3基因组中不存在)可促进寡聚核苷酸插入位置的确定，进一步控制在此克隆中寡聚核苷酸已被插入的克隆体。
上述寡聚核苷酸可由已知的合成方式获得，合成是借助于磷胺(fosforamidite)方法。
下面详细论述了一些突变株的构建和生物学特性。
1、PRV NIA-3株的HindⅢB片段克隆的构建质粒PBR322载体引导物是在dATP和dTTP存在下DNA多聚酶Ⅰ的klenow片段处理而使EcoRI的位置缺失的状况下构建。PRV的NIA-3株的27kbp HinclⅢB片段是在后者载体的HindⅢ位置上克隆。
2、在准随机位置的线性克隆。
HindⅢ-B克隆的共价闭合环状DNA(25μg)在37℃，15分部分消化，然后分别再选用下列任何一种酶消化FnuDⅡ，HaeⅢ和RsaⅠ。消化在下列体系中进行，125μl体积的溶液含有DNA和2u FnuD Ⅱ 20 mM Tris-HCLpH7.5，8mM Mgcl2，50μg溴化乙锭，或DNA与1单位Hac Ⅲ，20 mM Tris-HCL，pH 7.5，50mMNaCL，8 mM MgCL2，5μg/ml溴化乙锭或与0.5uRsaI孵育，在20 mM Tris-HCL，pH 7.5，50 mM NaCL，8 mM MgCL2，0.5μg/ml EtBr.
这些部分消化结果有30%完全长度的线状DNA片段的形成，琼脂凝胶电泳确定。因为所用的限制性酶识别位点散在整个DNA片段上。这个部分可以被认为是在克隆内准随机位点上线性化过程。这种线性DNA可由氯化铯密度梯度离心而纯化，去除未消化的闭合环状DNA，然后，通过制备的琼脂糖凝胶电泳去除单股分子片段，和不止一次切断的分子。
3、寡聚核苷酸插入到线状HindⅢ-B克隆内3个部分酶消化的样品每一份取1μg的线状DNA与蛋白激酶处理的寡聚核苷酸0.03μg连接，(摩尔数超过50倍)，体积为15μl。HindⅢ-B片段和寡聚核苷酸交联的连接物由EcoRI消化，而形成在2个末端具有一半寡聚核苷酸的完整长度片段，这些片段由制备性琼脂糖凝胶电泳和电洗脱而分离，然后将3个部分消化制备的3种DNA制备物合并。0.5μgDNA由一半EcoRI识别位点与线性HindⅢ-B片段的2个末端交联成环状，体积为400μl，从交联的混合物的沉淀出DNA并溶于10μl 10mM Tris-Hcl，pH7.5，1mM EDTA中，用Hanahan的方法将上述DNA转化到大肠杆菌DH5中，结果在一系列HindⅢ-B克隆的突变株中，每株在准随机位点都有寡聚核苷酸的插入。
4、重组克隆的分析重组克隆的完整性由BamHI和HindⅢ限制性内切酶的消化而检测，然后通过琼脂糖凝胶电泳。寡聚核苷酸在这些重组克隆中每株的插入位置由BamHI+EcokI和BgⅢ+EcokI限制酶消化，然后进行琼脂糖电泳。
5、伪狂犬病毒突变株的构建按照Van Zijl等(J.Virol.622191-2195，1988)介绍的方法从载体PJBF克隆出病毒亚基因片段克隆，以亚基因片段重新装配出PRV。克隆含有PRV NIA-3株HindⅢ-B片段的Us是按Quin等(J.Gen.Virol.68525-534，1987)的方法进行。为了获得没有载体序列的病毒插入片段，用ECORI消化Cosmid载体DNA，用HindⅢ消化质粒DNA，然后采用甘油梯度离心纯化病毒插入片段，从组建载体C-179，C-27和C-443或HindⅢB片段中得到的病毒插入片段被用于构建PRVcos NIA-3野毒型。这些病毒插入片段联合起来就代表了PRV病毒的全部遗传信息。
为了组建突变体病毒，C-179，C-27再加上下列任何一个，即用于构建△28K突变体的C-443或C-447(由于和HindB片段重叠，缺失一片8Kbp序列的组建载体)的组建载体用于构建PK突变体，最后，使用HindⅢB片段。
在图5中，将与NIA-3限制性消化谱有关的上述构建过程都很系统地表明出来。垂直箭头表示寡聚核苷酸的插入位点。
将这些片段协同转染到PK15细胞中，在这之前，应将这些片段的重叠未端进行体内同源重组具有感染性的病毒子此时就携带有一个引入的Hind Ⅲ B片段的变异片段。以这种方式得到的突变病毒应在SK6细胞上噬斑纯化三次，再从感染突变病毒的SK6细胞中分离DNA，用Bam HI和BamHI+GCORI消化，这些DNA提取物和用同样方式处理的NIA-3感染细胞的DNA用琼脂糖电泳进行分析。
6、构建NIA-3PK和△28K突变体用上述技术，通过对C-179、C-27、谩＊447和带有在旦白激酶基因S'未端转译终止寡聚核苷序列的HindⅢ B549片段，即可得到病毒突变体Mllo(PK-)，寡核苷片酸段可以早期终止PK-mRNA的转译。
Sanger和Coulson(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 74，5463-5467，1977)介绍的DNA序列分析方法可以确定这段寡核苷酸片段是否与病毒DNA侧边整合也可以确定在PK基因内寡聚核苷酸插入的确切位置。
为此，Hind Ⅲ B 549克隆的DNA可用限制性酶Sau3A+ECORI消化，插入到用BamHI+ECORI消化的M13mpll载体中。这个重组质粒的序列分析可揭示在寡聚核苷序列插入位点的两侧都没有缺失，在图2A上垂直箭头所示的PK转录体5'未端的第457和458碱基对之间正好是寡聚核苷序列的插入位点。
在第二次试验中，重复构建出PRV PK-插入突变体。试验是按上述过程进行的。这样就得到了病毒M119突变体(PK-)。
对Hind Ⅲ-B片段的寡聚核苷插入的致突变作用也产生在28K基因(Hi Ⅲ-B……351和357)两位点有插入寡聚核苷片段的两个克隆。这些可用于获得一个28K基因更大部分缺失的突变体。为此，Hind Ⅲ B351片段或357片段突变体用Bgl Ⅲ+EcoRI消化，两个酶在这两个克隆上各切一次(Bgl Ⅱ位点在gp50基因上，EcoRI在插入的寡聚核苷片段，图4B)，导致在消化后出现二个DNA片段，351克隆体的4.9kbp Bgl Ⅱ-EcoRI片段产生一个在351-357寡聚核苷序列插入位点之间大约0.5kbp缺失的Hind Ⅲ B片段突变体，这使28K基因缺失更多(图4b)。
用在5中所描述的方法，突变的病毒进一步消化株M113(△28K)就用351-357克隆中得到。
7、PK-和28K突变体在组织细胞上的生长在SK6细胞中，28K突变体PRV株与NIA-3株生长相同，PK-突变株比NI＊A-3生长慢。
致病性和免疫原性在试验1和2中，插入突变体M110(PK-)和缺失突变体M113(△28K)的致病性和免疫原性在10周龄仔猪(没有PRV抗体)体上进行的检查。105PFU通过鼻腔内接种。试验组由8-9头仔猪组成。在试验1中检测M110突变体，在试验2中检测M113突变体，在每一次试验中都设有两组对照群，也就是说，C群感染M209株(COSNIA-3)，A群不感染，接种后8周，所有动物都感染NIA-3株，以便测定免疫原性，18周龄的未感染A群用以对照。
M209(COSNIA-3)株是用C-179、C-27、C-443和NIA-3Hind Ⅲ-B片段的组建载体重新装配的强毒PRV株。
在试验了M119(PK-)致病性是以没有PRV抗体的3周龄仔猪为试验对象。PRV PK-(M120)的致病性也被测定。M120株是M119(PK-)的PK基因的缺失经配对后获得的，在SK-6细胞上，M119病毒DNA和NIA-3病毒DNA BamHI第10片段的协同转染影响了这种补救过程。BamHI 10片段与PK基因重叠，如果插入PK基因是在试验1中所描述的降低致病性的唯一原因，那么，PK基因的补救将一定会得到一株病毒，M120(PK+)，携带有对照株M209(COSNIA-3)的致病性特征。
A、B、C试验群每群由5个没有PRV抗体的SPF3周龄仔猪组成，分别用105PFU M118(PK-)，M120(PK+)和M209(COSNIA-3)鼻内感染A、B和C三群仔猪。
致病性试验1和2的结果在用M209(COSNIA-3)“免疫”后，常见的临床症状象废食或食欲极度降低，嗜睡、呕吐，分泌鼻液，发热，都可以观察到有一些动物在观察期内出现神经症状，在两组试验中6头动物有2头死亡，下面表列出毒力方面的结果。
表AN.S. 死亡率MTD 增重(kg)群 第18天-第1天A 对照 - 0/6 12.5B M110(PK+) - 0/7 12.0C M209(COSNIA-3) + 2/6 8.0 4.6试验2A 对照 - 0/6 13.8B M113(△28K) + 5/7 7.4 -4.0C M209 + 2/6 10.0 6.1神经症状(运动失调、麻痹、抖颤)
在接种M110(PK-)突变体的仔猪群中，临床症状仍限制在嗜睡，在有些动物缺乏食欲，体温增高，但很明显地低于M209感染。
M113(△28K)感染后，典型的临床症状出现，伴有神经症状，在M113群7头有5头死亡，第7天死亡3头，第8天死亡2头，其余2头，有一头呈慢性感染发病。M110(PK-)接种的群增重与未感染对照组A群相当，这与接种M110突变体出现温和型临床症状的结论相一致。
M113(△28K)感染可观察到体重降低，M113群的体重曲线测到存活2头仔猪体重曲线为终点，这两头中有1头仍慢性发病，体重还在不断的下降。另一只体重在感染后第9天开始增加。
M110(PK-)接种后可以观察到所分泌的病毒数量很低。
接种后第四天，从每一群中剖杀2头的仔猪从各种组织/器官(每头19部位)取样进行病毒分离，结果列在表B上。
因此，这些结果表明M110(PK-)株和父母代毒株相比，毒力明显降低，相反，M113(△28K)和父母代毒株对10周令仔猪的毒力相同。
表B试验1群 鼻咽区 C1N1S 肺B M110(PK-) + + +C M209(cosNIA-3) + + +试验2
B M113(△28K) + + +C M209(cosNIA-3) + + +试验3的结果C群仔猪在3周龄血清阳性对鼻内接种M209(cosNIA-3)，出现典型的特征性强毒PRV感染的症状，这些不仅包括一般症状，如发热(平均体温高于40℃持续6天)，食欲下降，嗜睡、呕吐、喷吐，分泌鼻液，而且还出现神经症状，如痉挛、震颤，共济失调、麻痹等。5头仔猪中有4头分别在第6、6、7和7天死亡(平均死亡时间6.5天)感染M120(PK-)B群仔猪出现同C群一样的症状，其中5头仔猪中有3头分别在6、7和12天死亡(平均死亡时间8.3天)，感染M119(PK-)的A群，在接种后第3和第4天看到温和性的一般症状，5头仔猪的平均体温高于40℃，在接种后第5天有1头仔猪出现嗜睡，没有看到食欲降低在第18天和第1天增重和对照群相同。
在感染后第一天一直到整个试验期内A、B、萌旱淖兄矶伎I在唾液中查到病毒。每群仔猪口咽拭子在第1和第9天之间的病毒平均数量差别不大。
免疫原性试验1的结果用M110(PK-)和M209(cosNIA-3)接种的仔猪在接种后第8周可完全抵抗NIA-3强毒攻击。没观察到生长抑制，采食减少，临床症状明显的体温增加，对照组经攻毒后出现典型的临床症状，但全部都存活下来。对照组仔猪生长受阻约15天。很明显接种M110(PK-)仔猪在攻毒后7天内分泌病毒，血中高水平中和抗体滴度(高于1000)减少了病毒排放的时间和数量，但不能完全阻止该病毒的排放。攻毒后血清中和滴度的提高断定病毒进行复制。
权利要求
1.一种人工培育的，并在蛋白激酶区或在28K基因区或两个区中有一突变的基因组的伪狂犬病毒。
2.如权利要求1所述的伪狂犬病毒，其中的突变是缺失基因，外源插入或者缺失基因和外源插入。
3.如权利要求1所述的伪狂犬病毒，其中的突变存在于蛋白激酶和28K基因中，或者存在于这两个基因中。
4.如权利要求2所述的伪狂犬病毒，其中的基因组含有一个编码能对猪典型致病的抗原多肽的插入片段。
5.如权利要求1所述的伪狂犬病毒，它不产生功能性gI蛋白，功能性胸腺嘧啶激酶或两者中的任何一种。
6.如权利要求1所述的伪狂犬病毒，它来自NIA-3毒株。
7.含有如权利要求1至6中之一所述的伪狂犬病毒，保护猪免受强毒攻击的疫苗。
8.一种保护猪免受强毒感染的疫苗生产方法，其中包括按权利要求1至6之一中所述的伪狂犬病病毒制成的一种具有免疫特性的药物组份。
全文摘要
本发明涉及人工培育的伪狂犬病毒(PRV)，它在蛋白激酶基因区和/或28K基因区含有突变的基因组。突变是指核酸替换、缺失、插入或转换或他们的组合，用基因工程技术可将突变物引入到自然的PRV病毒，最好是NIA-3基因组中，插入核酸序列可以是对猪具有典型致病的核酸序列编码。本发明还包括用涉及本发明的伪狂犬病病毒制备的疫苗及其制备该疫苗的方法。
文档编号C12N15/00GK1049519SQ90106840
公开日1991年2月27日 申请日期1990年8月17日 优先权日1989年8月17日
发明者尼尔斯·德·温德, 玛丽亚·马德琳·凡·齐尔, 阿诺德·伦纳德·乔泽夫·吉尔肯斯, 安托尼斯·齐泽夫·玛丽亚·伯恩斯 申请人:技术科学基金会