专利名称：治疗hiv血清阳性个体的药品的制作方法
技术领域：
本发明涉及治疗HIV血清阳性个体的药品，具体地说，涉及用于治疗HIV血清阳性个体的乳清蛋白浓缩物药品。
在本说明书的最后给出12篇参考文章，其内容都可作为本文的参考。
我们的研究表明，喂以20g乳清蛋白浓缩物/100g食物的小鼠的体液免疫应答(对绵羊红血细胞产生形成噬菌斑细胞数目)比喂以类似营养效能的含20g/100g食物的任何其它市售半纯化食物蛋白(如酪蛋白，大豆，小麦，玉米，蛋清，鱼，牛蛋白，最大螺旋藻(Spirulinamaxima)蛋白，绿藻(Scenedesmusalgae)蛋白，或Purina鼠料等)的小鼠有明显提高[1]。
我们进一步研究表明，喂食乳清蛋白的动物在淋巴细胞的需氧抗原驱动的无性增殖过程中，喂食乳清蛋白浓缩物(WPC)的免疫增强活性与脾的谷胱甘肽的较高产生有关[2]。这可能反映出食用乳清蛋白食物的小鼠的淋巴细胞有补偿潜在的氧化损伤的能力，因此，有更强的抗原抵抗能力[3，4]。事实上，细胞恢复氧化损伤的能力可以由它再生细胞内存谷胱甘肽的能力来表示[5]。
我们的研究还表明，给喂食乳清蛋白的小鼠服用S-(正丁基)高半胱氨酸磺酰亚胺(该化合物可以将脾的谷胱甘肽降低一半)将明显降低它的体液免疫应答。这进一步证实了谷胱甘肽在食用乳清蛋白的免疫增强活性中的重要作用[2]。
服用γ-谷氨酰基-半胱氨酸可以增加组织谷胱甘肽的浓度。给小鼠皮下(S.C)注射40-60分钟后，其肾赃的谷胱甘肽的浓度增加约50%，并且在2小时后又回到对照组的值[6]。服用的γ-谷氨酰基半胱氨酸以完整的分子在体内输送，并用作谷胱甘肽合成酶的底物[7]。
食物蛋白质的氨基酸序列的进展使我们可以研究在乳清蛋白中有谷氨酰基半胱氨酸基团的存在，并能研究它与谷胱甘肽促进作用的关系。事实上，从牛奶中得到的乳清蛋白浓缩物中含有大量的谷氨酰基半胱氨酸基团，与酪蛋白不同，当喂以小鼠酪蛋白并不能增如组织谷胱甘肽的量[1]。谷氨酰基半胱氨酸基团主要位于血清白蛋白部分中(每分子六个基团)。谷氨酰基半胱氨酸基团在动物和植物的可食用蛋白中含量极少。对可食用蛋白的氨基酸序列的有关资料进行广泛的研究表明，由二硫键连接的甘氨酸-半胱氨酸基团只局限于某些乳清蛋白，而蛋清的卵类粘蛋白部分中，每一个30，000分子量大小的分子中只含有2个这样的基团[8]。
我们最近的实验数据还表明[8]，小鼠在喂食高溶解度(非变性型)的食用乳清蛋白浓缩物时有最高的体液免疫应答，特别是含有较高相对浓度的不耐热的牛血清白蛋白(≥10%)和免疫球蛋白的情况下。另外，食用这种类型的乳清蛋白浓缩物的小鼠具有较高水平的组织谷胱甘肽。在血清蛋白部分中存在的谷氨酰基半胱氨酸基团(在食物蛋白中的量很少)，以及非变性分子构象中的特定分子内键是蛋白质混和物的谷胱甘肽促进活性的关键因素。
日本的最近实验表明[9]，BALB/C雄鼠喂食我们的非变性乳清蛋白浓缩物(WPC，我们称为免疫卡尔“Immunocal”)，每100/g该食物中含25gWPC，共喂4星期，其脾细胞在体外对SRBC的免疫应答比对照组鼠有增加，并且含有较多的L3T4+细胞(12.58×106±0.50)，对照组小鼠喂食等热食物25g酪蛋白/100g食物(3.69×106±0.50)。类似地，喂食非变性WPC的小鼠的脾L3T4+/LYt-2+比例为1.36±0.07，而喂食酪蛋白的对照组为0.55±0.07(P＜0.001)。
在实施例中所用的乳清蛋白浓缩物均是非变性的，它是由很不严格方法处理的牛奶制备得到的，但都能达到细菌污染的安全标准。非常高的溶解度指标表明这种蛋白质基本上是非变性的，所以超滤过程中有很好的穿透性[8]。虽然其它市售的浓缩物中所含有的蛋白质通常也大都是非变性的，比如浓缩物有较高的溶解度等，但是，这些混合物中所含的血清白蛋白和免疫球蛋白的量明显低于产生有效的生物活性所必需的量[8]。当用高的巴氏灭菌温度处理时，这些非常不耐热的蛋白质会发生变性而沉淀出来，部分从乳清中损失。相反地，我们的WPC由牛奶的低温巴氏灭菌处理制得，含有较高浓度的热敏感血清白蛋白和免疫球蛋白，它可以反映出更接近原牛奶的特性。这些数据支持这样假设即不耐热的含有甘氨酸-半胱氨酸的蛋白质(如非变性构形的血清白蛋白)是乳清蛋白浓缩物的生物活性的关键因素。
牛乳清蛋白浓缩物是用St-Hyacinthe，Quebec，Canada一书“ServicederecherchesurlesalimentsduMinisterede1′agricultureduQuebec”中所描述的方法制备，具有如下特点纯蛋白含量75%(其余的主要是乳糖，一些脂肪和水分);溶解度指数(ph4.6);99.5%。通过聚丙酰胺凝胶电泳测得的蛋白质组成(以总的乳清蛋白的%计)[8]为β-乳球蛋白59.1±4.0;α-乳清蛋白6.6±0.7;血清白蛋白9.7±1.0;免疫球蛋白24.6±2.6(平均值±标准差)。溶解度指数最好应当高于99%。
血清白蛋白的含量约是乳清蛋白总量的10%，几乎是已检测的其它市售乳清蛋白浓缩物的2倍。可以认为，血清白蛋白的量≥10%将非常有利于改进免疫系统。
血清白蛋白含有大量的谷氨酰基半胱氨酸，它是体内谷胱甘肽合成的一个基质。谷胱甘肽的作用已在“未变性食用乳清蛋白的生物活性谷胱甘肽的作用”(Clin.Invest.Med.14296-309，1991)一文中作了详细讨论，文中的全部内容都可作为本文的参考。
免疫球蛋白的含量范围在乳清蛋白总量的约25-30%时也是非常重要的。72℃进行巴氏灭菌13秒，使免疫球蛋白的含量是28±2%。我们发现将牛奶在72℃巴氏灭菌13秒可以使血清白蛋白的含量达到14±1%。
细菌学分析表明，无论是用“SevicederecherchesurlesAlimentsdueMinisterede1′agricultureduQuebec”方法制备的WPC，还是在72℃进行13秒巴氏灭菌的样品，都未检出葡萄球菌、沙门氏菌、B仙人掌或大肠杆菌等。
图1用图示法描述了制备本发明实施例中所用WPC的方法。
用30ml肝素化的血液来测定血液中单核细胞中谷胱甘肽的含量。将已计数的单核细胞悬浮在磷酸盐缓冲的盐水中，调至每管含有107个细胞。离心后加入900μl水至沉淀中，使细胞全都溶解。向每份中加入30%的磺基水杨酸至终浓度为每1ml含有3%。保温15分钟后，离心样品，上清液按照Anderson[11]的方法进行生化试验。所测值以纳摩尔(nMol)GSH(谷胱甘肽)/107细胞表示。血液淋巴细胞亚群可由流式细胞光度术测得。
血清蛋白总量，包括白蛋白和免疫球蛋白可以用Biuret方法测得。免疫球蛋白A(IgA)，免疫球蛋白G(IgG)和免疫球蛋白M(IgM)可由免疫比浊法测定。
在血液中有两个重要的淋巴细胞亚群;(1)CD4，也叫做T-助细胞，因为它们有助于免疫应答;(2)CD8，也叫做T-抑制细胞，因为它们起相反的作用，也就是它们抑制免疫应答。在HIV-血清阳性的个体中，CD4细胞数量少，也就是说，CD4/CD8的比例下降。
本发明的目的就是提高T助细胞对T抑制细胞的比例。这一目的可以通过服用未变性的乳清蛋白浓缩物来实现。
服用剂量应当在每天8-40克的范围内，最好是每天20-40克。对谷胱甘肽量特别有利的剂量是每天服用30-40克。而谷胱甘肽量的提高有利于免疫系统，这在美国专利申请号No.563，794(1990年8月3日呈递)中有更完善的描述，可作为本文的参考。
实施例1选择3个HIV-血清阳性的男性患者服用上文中所述的乳清蛋白有浓缩物，在表2中分别标记为A、B和C。该产品每天冷冲服，冲服用液体可由患者自选。另外还包括第四个患者D，但是他只是偶尔服用WPC，没有任何规律，并且在研究的最后几天没有服用。因此，他在表2中被列为对照。其它的对照体还有E和F。
WPC的日服入量是逐步增加的。在第一个三周期间每日服用8.4克，第二个三周内每日19.6克，第三个三周内每日28克，最后三周内每日服用39.2克。
观察结果列在下面表2中
表2乳清患者服用乳清能量理想体重CD4%助细胞CD4GSH血清蛋白百分率名称星期数 (千卡) 体重 (kg) (2) 绝对值 CD8 n mol-102细胞 Alb IgG IgA IgM(年龄)蛋白(g)(kg)(3)(4)(5)总量(1)-0218086102.5233680.389.75774220.81.541.1487A61800105265460.4510.34743919.41.561.16106(35)122111108244800.4113.9804220.11.611.051000187075.273.9154350.2210.22825012.34.380.7584B6203574.5195320.289.6794514.34.530.76140(32)12210076174420.2417.04725016.95.810.95138024007876246720.3910.38825212.43.590.76100C6220077.5278640.4612.55814912.93.990.58116(20)12140078266760.457.06805012.83.80.798
表2(续)对照患者能量理想体重CD4%助细胞CD4GSH血清蛋白百分率名称星期数 (千卡) 体重 (kg) (2) 绝对值 CD8 n mol-102细胞 Alb IgG IgA IgM(年龄)蛋白(g)(kg)(3)(4)(5)总量(1)0294095.5275400.4712.36754715.61.631.341076250085256500.428.597342151.51.19118025007069.51742010.3814498E6260068.521371118244130(38)12248068183599.881441080220074741626311.088043108F62100731222210.38343120(37)1223007212.5230980421101-列出的所摄入的能量及蛋白量代表前几星期的平均值2-正常范围:35-553-正常范围:580-12504-正常范围:1.42-3.565-GSH:单核血细胞中的谷胱甘肽量。相当年龄的健康的HIV血清阴性个体的正常值范围:17.05±2.40(平均值±SD)
在表2中CD4%表示CD4(助细胞)占血液中淋巴细胞总量的百分率。
助细胞绝对值表示每单位血液中CD4的实际数量[x103每微升(μl)]。
CD4/CD8表示血液中两种淋巴细胞型的比例，即T-助细胞和T-抑制细胞的比例。
总量表示血清中的蛋白总量，包括白蛋白和免疫球蛋白。
IgA表示免疫球蛋白AIgG表示免疫球蛋白GIgM表示免疫球蛋白M表2给出的数据及实验过程中得到的其它的信息具有下列含意。
三个患者每天服用未变性的WPC三个月后，未观察到任何有害的副作用。所有这些患者的体重都逐渐增加(2-7千克);并且有两个(B和C)达到了理想体重。血清蛋白(包括白蛋白)保持不变，并在正常范围之内，这说明蛋白补充本身并不是体重增加的原因。
在所有的这三个患者中，在研究中血液T-助细胞的浓度和T-助细胞/抑制细胞的比例都适中地、但一致地高于服用未变性WPC前时的值。
正象所预料的那样[10]，在研究开始时所有患者的血液单核细胞中谷胱甘肽的含量都低于正常值。但是，经过三个月后，谷胱甘肽的水平都有增加，并且有一例(B)增加70%，从而达到正常值。
在文献[10]的1297页中提出了没有症状的HIV-血清阳性个体的系统性谷胱甘肽缺乏使谷胱甘肽正常的细胞外浓度的恢复成为尚未解决的难题。因为静脉注射的谷胱甘肽的半衰期只有1-6分钟。但是，根据本发明的方法，通过服用未变性的WPC可以解决这一难题。
在所有这三个患者中，这些症状的变化都伴随着健康状况的明显改善。
值得注意的是，有一位患者过分担心体重的有益增加会妨碍其苗条外形，他在第三个研究阶段中急剧减少能量和未变性WPC的摄入量(C，表2)。在这时期内，体重的增加降低，并且谷胱甘肽和T-助细胞也不再增加。
正象早期指出的那样，患者D由于对实验方案缺乏认识，而作为对照体，他在第6周末表现出体重、T-助细胞/T-抑制细胞比例及谷胱甘肽量的下降，并且在预定的12周内没有上升趋势。其它的两个对照体(E和F)的体重下降，谷胱甘肽水平没有变化。
这些实例表明，如果患者基本上保持其能量摄入量在研究前的水平上而对上述WPC的摄入量只有少量降低，则在服用WPC期间，他的体重增加，并且特定的HIV指标(如，血细胞谷胱甘肽、T-助细胞浓度、T-助细胞/T-抑制细胞比例)都有适当的提高。
如果结合在大量动物通过服用我们的WPC后表现出细胞谷胱甘肽和免疫应答增加[1，2，8，9]的实验基础上一起考虑，则在这很有限的HIV-血清阳性患者中所观察到的未变性WPC的正疗效，是具有很大的价值的。动物研究强调的事实是未变性WPC的免疫增强效应与较大的系统性营养效能无关，因为其它几个具有相似营养效能的蛋白源都没有明显的生物活性。喂食未变性WPC的小鼠的身体生长并没有增加，血清蛋白水平也没有变化。类似地，在我们的患者中，未变性WPC在血清蛋白中没有产生任何变化，整个研究过程中血清蛋白的量保持不变。在研究过程中所观察到的患者体重的增加与能量或蛋白摄入量的增加没有关联，但与身体健康状况的改善和HIV特定的血液参数有关。通过未变性的WPC所摄入的多余蛋白通常通过降低其它来源蛋白的摄入量来抵偿。
认为在乳清蛋白浓缩物的血清蛋白组分中存在有谷氨酰基半胱氨酸基团是未变性WPC蛋白混合物的谷胱甘肽促进活性和免疫增强活性的关键因素。我们实验室的研究表明，其它来源的乳清蛋白浓缩物不能产生明显的生物活性，但具有类似的营养效能。这些产品中的血清白蛋白的百分浓度(平均值±标准差)分别是Promod(Ross实验室)，4±1;Alacen855(新西兰乳品店)，4±;Lacprodan-80(1989年由Danmark蛋白生产)4.8±;Sapra(Saputo，蒙特利尔)，4.8±0.1;Savorpro-75(GoldenCheese，CA)，4±1;Bioisolate(LesueurIsolates，明尼那波利斯)[8]，5±1;Promix(Dumex，魁北克)，4.3±1。类似地，其它的不耐热蛋白含量，免疫球蛋白，大约是本发明所用的未变性WPC中含量的一半。
这些结果表明，未变性乳清蛋白通过为在免疫细胞补充谷胱甘肽提供特定燃料，可以作为其它治疗形式的辅助剂。
在历史上，并直到现在，通过加热处理(巴氏灭菌)来降低牛奶中的细菌和芽胞。为了有效灭菌，这种方法不可避免地会产变性，从而使大部分最不耐热并推测有生物活性的血清白蛋白和免疫球蛋白以凝乳形式沉淀而损失。
我们的目的就是得到一种乳清蛋白浓缩物(W.P.C)，它尽可能地含有与原料奶相近的蛋白组成比例和构形，并且细菌含量达到允许的安全标准。为了保持不耐热的乳清蛋白，到目前为止我们已采用了最低的可允许的热处理牛奶。今后我们将采用一种基于膜微过滤的新方法达到这一目的。
选用Bactocatch(Alfa-LavalLtd.scarborough，Ontario(安大略))，我们将脱脂奶经过特殊的膜微过滤后，所得透滤液的细菌含量已降低至不足原水平的0.5%。
然后将这种透滤液用粗制凝乳酶处理，乳清上清液中的蛋白质经过浓缩后即可得到所需的未变性乳清蛋白浓缩物。我们相信膜微过滤原理取代加热方法处理牛奶在将来将提供一个合适的途径来保持不耐热的乳清蛋白，虽然在技术和设备方面可以随后改进。
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权利要求
1.一种用于治疗HIV-血清阳性个体的药品，包括未变性乳清蛋白浓缩物。
2.权利要求1的药品，包括药物上可接受的载体或赋形剂。
3.权利要求1的药品，其中该未变性乳清蛋白浓缩物的溶解度指数(pH4.6)大于99%。
4.权利要求1的药品，其中未变性乳清蛋白浓缩物的蛋白组成含有β-乳球蛋白59.1±4.0，α-乳清蛋白6.6±0.7，血清白蛋白9.7±1.0，免疫球蛋白24.6±2.6。
5.权利要求1的药品，其中未变性乳清蛋白浓缩物的日服量范围是约每天8-40克。
6.权利要求5的药品，其中日服量范围是约20-40克。
7.权利要求6的药品，其中日服量范围是约30-40克。
8.权利要求3的药品，其中未变性的乳清蛋白浓缩物中血清白蛋白的含量大于或约等于10%。
9.权利要求8的药品，其中未变性乳清蛋白浓缩物中免疫球蛋白的含量范围是约25-30%。
10.未变性乳清蛋白浓缩物在治疗HIV-血清阳性个体药品中的应用，其使用量要足以提高血液单核细胞中谷胱甘肽含量和体重，并且改善健康状况。
11.未变性乳清蛋白浓缩物在治疗HIV-血清阳性个体药品中的应用，其使用量要足以提高个体的T-助细胞浓度和个体的T-助细胞/T-抑制细胞比例。
12.权利要求11的应用，其中该未变性乳清蛋白浓缩物的溶解度指数(pH4.6)大于99%。
13.权利要求11的应用，其中未变性乳清蛋白浓缩物的蛋白组成含有β-乳球蛋白59.1±4.0，α-乳清蛋白6.6±0.7，血清白蛋白9.7±1.0，免疫球蛋白24.6±2.6.。
14.权利要求11的应用，其中未变性乳清蛋白浓缩物的日服量范围是约每天8-40克。
15.权利要求14的应用，其中日服量范围是约20-40克。
16.权利要求15的应用，其中日服量范围是约30-40克。
17.权利要求12的应用，其中未变性的乳清蛋白浓缩物中血清白蛋白的含量大于或约等于10%。
18.权利要求17的应用，其中未变性乳清蛋白浓缩物中免疫球蛋白的含量范围是约25-30%。
全文摘要
将未变性的乳清蛋白浓缩物对HIV-血清阳性个体给药，以提高他们的血液单核细胞，谷胱甘肽(GSH)水平，体重和健康状况。另外，个体的T-助细胞浓度和个体的T-助细胞/T-抑制细胞比例也有少量的提高。
文档编号A23L1/305GK1083704SQ9310408
公开日1994年3月16日 申请日期1993年4月9日 优先权日1992年4月10日
发明者菲尔·戈尔德, 古斯塔夫·邦纳斯 申请人:免疫技术研究公司