专利名称：烟草超氧化物岐化酶(sod)提取方法
超氧化物岐化酶(SOD)是一种广泛存在于需氧生物体内的极为重要的金属酶，催化超氧物阴离子自由基(O-2)或其质子化产物HO-2岐化为H2O2和O2的岐化反应。在防御生物体免受超氧自由基伤害，抗辐射，抗肿瘤及延缓机体衰老等方面具有重要作用。
到目前为止，人们知道可以从动物的血液中制取SOD，由于动物有可能带有对人体有害物质使产品带菌。人们期望开发植物中的SOD，因为植物中的SOD纯属植物天然蛋白，不含对人体有害物质。以烟草为原料提取SOD，根据我们从广东国际联机检索中心所得到的资料，国内、外是未有做过的。在国外曾有过报导，在这些报导中，只披露了烟草病毒与酶的关系，也作了关于从烟草中提取粗酶的报导，其目的为了开展烟草病毒的研究，其提取方法，以Tris-HCl为抽提液，低温高速离心，硫酸铵分部沉淀，酶活力损失大，活力回收率低，设备要求，产物不含铁离子，该方法在生产上是很难得到应用。
本发明目的提供一种从烟草中提取含铁离子的酶制剂系列产品的方法。
本工艺以烟草为原料，先用水将烟草清洁干净、凉干，以预冷的磷酸钾缓冲液为抽提液萃取烟草中蛋白，抽提液经过滤弃去滤渣，滤液在常温下离心，离心后的上清液经选择性酸碱变性处理初步除去碱性蛋白，酸性蛋白和色素，滤液中的粗酶以硫酸铵沉淀收集为粗酶制剂，粗酶制剂经重蒸馏水透析除盐，并经两次DAEA-纤维素离子交换柱进行洗脱，超滤，纯化，冻干获得系列酶制剂。
本发明的主要技术路线，如图4所示本发明是这样实施1.原料浸提新鲜烟叶洗净、凉干或用纱布吸干、切碎，加抽提液。
抽提浸为预冷4℃的0.05mol/L磷酸钾缓冲液，原料与抽提液的比例为1∶1(重量与体积比)。
称取上述烟叶500g，加入上述磷酸钾缓冲液500ml，匀浆，匀浆后用140目尼龙布过滤，弃去残渣，滤液在常温下2500rpm离心15分钟，取上层液。
2.选择性酸碱变性于上述上层液中加入2mol/L醋酸，边加边搅拌，调pH至4.0，常温下，2500rpm离心15分钟，收集上清液;于上述上清液中加入2mol/L NaOH边加边搅拌，调pH至7.5，常温下，2500rpm离心15分钟，收集上清液。
3.粗酶制备于上述上清液中加入固体硫酸铵，边加边搅拌至饱和度达80%，置冷于0～4℃下3～4小时，使至沉淀完全，常温下，5000～6000rpm离心15～20分钟，收集沉淀，冻干为粗酶制剂。
4.透析用预冷了的pH 7.5，0.05mol/L磷酸钾缓冲液溶解粗酶，常温下，5000～6000rpm离心15～20分钟，取上清液对重蒸馏水透析12小时以上。
5.离子交换柱层析DEAE-纤维素处理用0.5mol/L NaOH溶液，内含0.5mol/L NaCl浸泡3～4小时，蒸馏水洗至中性，复用0.5mol/LHCl浸泡0.5小时，用蒸馏水洗至中性，用0.5mol/L NaOH浸泡0.5小时，用蒸馏水洗至中性，最后用0.05mol/L，pH7.5磷酸钾缓冲液平衡。
将透析液加入经处理后的离子交换柱内，层析柱规格1.5×50cm用pH7.5 0.05～0.4mol/L K2HPO4-KH2PO4缓冲液离子强度线性梯度洗脱，自动部分收集器收集，恒流泵恒流，每管5ml，8分钟收集一管，检测酶活性，收集呈酶活性的洗脱液。
6.超过滤将上述洗脱液全部移入超滤器，在4℃下，3.8kg/cm2下超滤至10ml左右，冻干，即为部分纯化酶制剂。
7.离子交换柱层析将超滤后浓缩液移入经预处理后的DEAE-纤维素离子交换柱内，层析柱规格3×40cm。用pH7.5 0.05～0.4mol/L K2HPO4～KH2PO4缓冲液洗脱，自动部分收集器收集，恒流泵恒流，每管5ml，8分钟一管，收集呈酶活性的洗脱液。将洗脱液在4℃下，3.8kg/cm2超滤，冻干为纯酶制剂，或将洗脱液在4℃，3.8kg/cm2超滤至蛋白质浓度为154mg/ml，置0～4℃下，36小时使至结晶完全，并于4℃下，10500～20000g离心30分钟，收集结晶，为结晶酶制剂。
8.洗脱液测定及分析在第一次离子交换柱层析所收集的洗脱液中，经检测其中第16管到30管的洗脱液具有酶活性，如
图1所示，第二次离子交换柱层析所收集的洗脱液中，经检测其中13管到28管的洗脱液具有酶活性，图1为第一次离子交换柱洗脱曲线;
图2为第二次离子交换柱洗脱曲线;
图3为烟草SOD结晶。
图中-表示离子强度;
×-×表示蛋白质·-·表示酶蛋白。
从图1中可以明显看到，洗脱液出现5个蛋白质峰，其中第1峰为酶蛋白质峰;此峰的洗脱液再经DEAE-纤维素离子交换柱层析，洗脱液出现4个蛋白质峰，其中第1峰为酶蛋白峰，图2所示;此峰的洗脱液经超滤后冷冻，其结晶体如图3所示。
9.分离纯化结果如下表所示
从表看出酶被纯化了26倍，比活力达746V/mg蛋白，活力回收达16%，500g材料产酶28mg。
酶活性测定方法利用SOD抑制氮蓝四唑(NBT)在荧光下的还原作用，3ml反应混和液中含有1.3m mol/L核黄素，13m mol/L甲硫铵酸，63m mol/L NBT 0.05mol/L pH7.5磷酸缓冲液。加入适当酶液后在4000lux荧光下光照15分钟，并在560nm波长下测定光密度，以磷酸缓冲液代替酶作空白。以抑制NBT光化还原的50%的酶量为一个酶活性单位。
蛋白质含量测定方法按考马斯亮蓝G-250法。
本发明优点1.原料来源广，价廉，我国烟草面积很大，就广东年种面积达55～60万亩，目前向高档烟发展，只有烟草中部的叶片才能制作高质量卷烟，其顶叶、底叶、分枝叶及再生苗多造成浪费，本技术为废料找到出路。
2.本技术废水量少，生产一吨烟叶约有5m3废水，其中含有丰富的N、P、K元素。废渣约为原料的5%，两者混合，堆放一定时间是上好肥料，可返回烟田，做到以厂养田，因此无环境污染，它还清除了烟草废弃物，对病虫害防治，烟田生态平衡极有好处。
3.本技术投资少，效益大，日加工3吨烟草的工厂，仅需投资100万建厂和设备，日税率约为3万元。当年投资，除还本外，还可获得80～100万元。
4.本方法可生产各种不同纯度的酶制剂，满足不同用户，不同用途的需要。
5.本系列产品均为以Fe-SOD为主的植物天然蛋白，对人、动物体无害，无病毒，无副作用。
权利要求
1.烟草超氧岐化酶(SOD)提取方法包含除杂、凉干、抽提、粗酶制剂制备、纯化等工序，其特征在于先用水将烟草清洁干净，凉干、以预冷的磷酸钾缓冲液匀浆、抽提烟草中蛋白，浸出液经过滤弃去残渣，滤液在常温下离心，离心后的上清液经选择性酸碱变性处理初步除去碱性蛋白和酸性蛋白及色素，滤液中的粗酶以硫酸铵沉淀收集为粗酶制剂，粗酶制剂经重蒸馏水透析除盐，并经两次DEAE-纤维素离子交换柱洗脱纯化、超滤、冻干获得部分纯酶、纯酶和结晶纯酶制剂。
2.根据权利要求1所说的SOD提取方法，其特征在于抽提液在4℃下预冷。
3.根据权利要求1所说的SOD提取方法，其特征在于抽提液为0.05mol/L，pH7.5磷酸钾，原料与抽提液的比例为1∶1(重量与体积比)。
4.根据权利要求1所说的SOD提取方法，其特征在于萃取的滤液在常温下，2500rpm，离心15分钟。
5.根据权利要求1所说的SOD提取方法，其特征在于所说选择性酸碱变性处理是用2mol/L HAC将过滤后的上清液调至pH值为4.0，在常温下，2500rpm离心15分钟，取上清液加2mol/L NaoH调至pH值为7.5，在常温下，2500rpm离心15分钟。
6.根据权利要求1所说的SOD提取方法，其特征在于用固体硫酸铵使抽提液中的粗酶沉淀。
7.根据权利要求1和6所说的SOD提取方法，其特征在于固体硫酸铵的加入量是使抽提液达80%饱和度。
8.根据权利要求1所说的SOD提取方法，其特征在于所收集的粗酶在预冷的pH7.5，0.05mol/L磷酸钾缓冲液中溶解，离心后取上清液并于4℃下对重蒸馏水透析12小时以上。
9.根据权利要求1所说的SOD提取方法，其特征在于透析液在液离子层析柱内，用pH7.5，0.05～0.4mol/LK2HPO4-KH2PO4缓冲液离子强度线性梯度洗脱，收集呈酶活性的洗脱液。
10.根据权利要求1所说的SOD提取方法，其特征在于呈酶活性的洗脱液在4℃，3.8kg/cm2压力下进行超过滤，冻干为部分纯酶制剂。
11.根据权利要求1所说的SOD提取方法，其特征在于超滤液经DEAE-纤维素离子交换柱，用0.05mol/L pH7.5K2HPO4-KH2PO4缓冲液洗脱，收集呈酶活性部分，在4℃下，3.8kg/cm2超滤，冻干为纯酶制剂。
12.根据权利要求1所说的SOD提取方法，其特征在于将经DEAE-纤维素离子交换柱处理后收集的呈酶活性的洗脱液在4℃下，3.8kg/cm2超滤至蛋白质浓度为154mg/ml，置0～4℃下，36小时使至结晶完全，并于4℃下10500～20000g离心30分钟，收集结晶，为结晶酶制剂。
全文摘要
烟草超氧化物岐化酶(SOD)提取方法，以烟草为原料，经清洁、凉干切碎匀浆，以预冷的磷酸钾缓冲液抽提、过滤，滤液离心，上清液经选择性酸碱变性处理，硫酸铵沉淀酶，冻干成粗酶。用预冷的磷酸钾缓冲液溶解沉淀并对重蒸馏水透析，透析液经两次DEAE-纤维素离子交换柱层析、洗脱液超滤，浓缩，可得部分纯酶、纯酶或酶结晶。本系列产品均属以Fe-SOD为主的植物天然蛋白，不含有害物质，对人、动物体无害、无病毒，无任何副作用。
文档编号C12N9/08GK1095414SQ93103820
公开日1994年11月23日 申请日期1993年4月5日 优先权日1993年4月5日
发明者徐凤彩, 廖毅, 穆虹, 何平 申请人:华南农业大学