糖类结合结构域在淀粉加工中的用途的制作方法

专利名称：糖类结合结构域在淀粉加工中的用途的制作方法
技术领域：
本发明特别是涉及糖类结合结构域(“CBD”)和用于工业淀粉加工(值得一提的是用于生产增甜剂，特别是含有葡萄糖和/或果糖之糖浆(参见下文)的淀粉加工)的一类酶的组合应用，所述的这类酶具体是淀粉分解酶，例如用于所谓的“淀粉液化作用”加工(参见下文)的α-淀粉酶，其中将淀粉降解(常称为“糊精化”)成较小的寡糖和/或多糖片段，或者是与所谓的“糖化作用”加工(参见下文)有关的用于对支链淀粉衍生的淀粉片段进行脱支的脱支酶(例如异淀粉酶或支链淀粉酶)，“糖化作用”加工过程通常是在液化阶段之后进行的。
背景技术：
如上所述，本发明在淀粉加工(淀粉转变)领域特别有价值。常规的淀粉转变工艺和液化和/或糖化作用工艺的条件描述于例如美国专利3,912,590和EP 0252730和EP 063909。
从淀粉生产增甜剂从淀粉生产含有葡萄糖和/或果糖之糖浆的“传统”工艺通常由三个连续的酶促过程组成，即液化过程，随后是糖化作用过程和(用于生产含有果糖的糖浆时)异构化过程。在液化过程期间，通常在pH5.5-6.2之间和在95-160℃的温度下，由α-淀粉酶[EC 3.2.1.1；例如TermanylTM(地衣芽孢杆菌α-淀粉酶)，可从Novo Nordisk A/S，Bagsvaerd，丹麦获得]作用约2小时而将淀粉(从含水介质中的淀粉悬浮液形式开始)降解为糊精(淀粉的寡糖和多糖片段)。为了确保在这些条件下有最佳酶稳定性，通常将约1mM的钙(约40ppm的游离钙离子)加入到淀粉悬浮液中。
在液化过程之后，通过加入葡糖淀粉酶(淀粉葡糖苷酶，EC 3.2.1.3；例如AMGTM，从Novo Nordisk A/S获得)，并且通常加入脱支酶，例如异淀粉酶(EC 3.2.1.68)或支链淀粉酶(EC 3.2.1.41；例如PromozymeTM，从Novo Nordisk A/S获得)将糊精转变为右旋糖(D-葡萄糖)。在该步骤之前，通常将介质的pH降低到低于4.6(例如pH4.3)，并维持高温(95℃以上)，从而使液化作用的α-淀粉酶活性变性。然后通常将温度调低到60℃，并加入葡糖淀粉酶和脱支酶。通常使液化过程进行24-72小时。
在糖化作用阶段完成之后，将介质的pH升高到6-8的范围内，优选的是pH7.5，并通过离子交换层析去除钙离子。然后可利用诸如固定化的“葡萄糖异构酶”(木糖异构酶，EC 5.3.1.5；例如SweetzymeTM，从Novo Nordisk A/S获得)将获得的糖浆(右旋糖糖浆)转变为高果糖糖浆。
在本说明书和权利要求书中所提到的酶分类号(EC号)是与国际化学与分子生物学学会命名委员会推荐命名(1992)(高等学术出版公司，1992)一致的。
鉴于要达到比“传统”(和现行)有所改进的淀粉加工结果，对目前用于淀粉转化加工的酶的特性进行一些改进可能是必要的。就淀粉液化而言，对液化作用的α-淀粉酶可以进行至少3种改进，概括于下文中；各种改进被视为单方面有益，虽然将它们结合使用(例如1+2，1+3，2+3，或1+2+3)有可能得到更好的效果。
改进1降低液化性α-淀粉酶对Ca2+的依赖性为了确保目前用于淀粉液化的α-淀粉酶具有合适的高稳定性，需要加入游离钙(钙离子)，但是异构阶段的介质中存在钙离子会导致对其中使用的葡萄糖异构酶的活性产生强烈抑制。因此有必要借助于昂贵的装置操作(例如离子交换)，将介质中的钙离子含量降低到低于约3-5ppm的游离钙水平，或者以其它的方式将钙的抑制作用降低到最小，例如通过在糖化作用阶段之后将量足以适当地“竞争性取消”钙离子与葡萄糖异构酶结合的镁离子加入到介质中。如果不加入钙离子也可以进行液化过程，从而不需要随后的昂贵补救装置操作来去除钙离子或将其抑制作用降低到最小，则可以显著地节约资金。
为此，就需要一种在低浓度的游离钙(＜40ppm)中稳定的和有高活性的α-淀粉分解酶。优选地，这样的酶的最适pH值在pH4.5-6.5范围内，更优选是在pH4.5-5.5范围内。
改进2使无用Maillard产物的形成降低在液化过程期间无用Maillard产物的形成程度取决于pH。低pH有利于降低Maillard产物的形成。因此希望能够将该过程的pH从约pH6.0降低到约pH4.5；不幸的是，公众已知的所有耐热液化性α-淀粉酶在低pH值(即pH＜6.0)时不太稳定，并且其比活性通常较低。
为达到上述目的，需要获得在pH4.5-6.5范围内比较稳定、并且优选地维持高比活性的α-淀粉分解酶。
改进3液化性α-淀粉酶对糖化作用过程的影响降低以前已经有人报道(美国专利5234823)，当黑曲霉葡糖淀粉酶和B.acidopullulyticus支链淀粉酶进行糖化作用时，如果在糖化作用阶段之前α-淀粉酶没有失活，那么在液化过程之后保留的残余α-淀粉酶活性会导致右旋糖产率较低。如上所述(参见上文)，通常通过在温度降低到60℃以进行糖化作用之前，在95℃将pH调节到pH4.5以下而进行这一失活过程。
对右旋糖产量的这一负面影响的原因目前没有完全搞清楚，但是有假设说，这是由于所使用的液化性α-淀粉酶制剂(例如TermamylTM产物，例如TermamylTM120L)通过水解支链淀粉分支点附近和两侧的1，4-α-葡糖苷键而产生“极限糊精”(它是B.acidopullulyticus支链淀粉酶的较差底物)所导致的。葡糖淀粉酶对这些极限糊精的水解导致产生三糖4-α-葡糖基麦芽糖，该糖仅缓慢地被葡糖淀粉酶水解。
为了避免该工艺流程在现行操作中的这些缺点，有必要开发一种不需要独立失活步骤的耐热α-淀粉分解酶。
本发明的一个目的是开发所研究CBD的结合性质，从而例如修饰淀粉底物对该酶的亲和力，和/或修饰淀粉底物的构象或几何构型，使酶催化的反应过程受到适当方式的修饰，进而使已知(目前所应用的)α-淀粉分解酶相对于淀粉液化过程的性能有所改善。
发明简述本发明一方面涉及用于液化淀粉的一种改进的酶促方法，该方法中组合应用糖类结合结构域(CBD；参见下文)和至少一种液化性淀粉分解酶，如α-淀粉酶。
在本发明一个实施方案中，所述淀粉分解酶是D-酶(EC 2.4.1.25)或Q-酶(EC 2.4.1.18)和/或脱支酶，它包括异淀粉酶(EC 3.2.1.68)和支链淀粉酶(或脱支酶)(EC 3.2.1.41)。
类似地，并且也在本发明范围内的是，使用CBD和脱支酶(例如异淀粉酶或支链淀粉酶)，使支链淀粉衍生的淀粉片段(例如与上文概述的淀粉转变过程的糖化作用步骤有关)脱支，估计将会强化脱支性能，从而可提高糖化过程中的右旋糖产量。
在本发明的一个实施方案中(实施例1和2举例说明)，所用的CBD可以是例如纯CBD形式，或者是含有CBD的酶的形式。在实施例1中，用脱支酶(可从Novo Nordisk获得的PromozymeTM)和市售纤维素酶(可从Novo Nordisk获得的CarezymeTM)形式的CBD对支链淀粉进行脱支。此外，在实施例2中，将来自粪堆梭菌(NCIMB11754)XynA(GenBank和Swiss-PROT登录号No.13325)的纯化CBD二体与脱支酶(PromozymeTM)结合用于使支链淀粉脱支。纯CBD可以通过本领域熟知技术，例如Ong E.等(1993)，生物技术和生物工程，42401-409，或Linder M.等(1996)，生物化学杂志，27121268-21272，或PCT/DK97/00477(Novo Nordisk)中所述技术制得。
本发明方法中所用的CBD可以包含在纤维素酶、木聚糖酶、甘露聚糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、乙酰酯酶、壳多糖酶、葡糖淀粉酶或CGT酶中(即作为其中一部分)。浸渍本发明另一方面涉及从含淀粉的玉米种子中回收淀粉的方法，这是通过在有CBD和半纤维素分解活性和纤维素分解活性的情况下对种子浸渍而进行的。
在一个实施方案中，该半纤维素分解活性是木聚糖酶活性(EC3.2.1.8，EC 3.2.1.32，EC 3.2.1.136)，该纤维素分解活性是纤维素酶活性(EC 3.2.1.4)。
在另一个实施方案中，将含淀粉的玉米种子在有果胶分解活性，如果胶酶(EC 3.2.1.15)的情况下进一步浸渍。包含这些活性的合适市售产品是Novo Nordisk的SteepzymeTM。
浸渍通常是作为玉米湿磨法中的预处理而进行的，目的在于将玉米种子分离成淀粉、蛋白质(主要是麸质)、胚芽和纤维素各种组分[参见如D.Ling和D.S.Jackson，谷物化学，68(1991)，205-206页]。在传统工艺(其中常使用含二氧化硫的浸渍介质)中，不可能回收到种子的全部(分析测定)淀粉成分，显然这是由于部分淀粉仍以某种方式与种子的纤维和蛋白质成分相结合所导致的。
没有任何理论支持，似乎在本发明中使用含有适当量CBD和木聚糖酶的浸渍介质，能够从玉米种子中回收到显著增多量的淀粉。而且，就此而论，似乎浸渍操作时间也可以缩短。因此，借助这种方法，在淀粉的回收/分离方面(例如用于上述液化过程(等)的淀粉)就有可能大大节约费用。
所加入CBD的量通常是0.01-1克蛋白质/克干固体(DS)，优选0.1-0.5克蛋白质/克干固体。每克干固体通常加入1-50 FXU木聚糖酶。
分离植物材料的方法本发明另一方面涉及分离植物材料的方法，其中用糖类结合结构域(CBD)和木聚糖酶处理所述植物材料。
虽然根据本发明，含有木聚糖的任何植物材料(如软木和硬木)都可以用CBD和木聚糖酶处理，但最好该植物材料是来自Poaceae(与Graminaceae同物异名)科，特别是由谷物如小麦、黑麦、大麦、高粱、豆或水果外壳制得。该植物材料也可以由上面提到的诸植物的任意组合制得，并且还可以含有非植物材料。
欲按照本发明方法处理的植物材料可以是任何合适的形式。正如下面将详细说明的那样，该植物材料可以是可泵抽的分散体或溶液形式，使得能够连续进行加工。通常通过将磨碎的干材料，特别是平均颗粒大小为50-100mm的小麦与水混合，制得这种分散体。
目前优选的、欲根据本发明加工的植物材料是小麦。通过本发明工艺，小麦被分离成麸质、淀粉和纤维组分。可以将如此产生的麸质加入面粉中以改善其烘烤性质，或者可以用来改善诸如肉类、早餐谷物和宠物食品等产品的营养价值。淀粉可以用于例如生产糖浆，在造纸工业中，例如可用于纸张涂覆，以及用于纺织工业中。纤维成分例如可以用于动物饲料中。
下面将参照小麦分离，描述用于分离植物材料的本发明方法。然而，应当明确，上面提到的其它任何植物材料均可按类似类型的工艺进行分离，并且，本领域技术人员应该清楚选择哪一类型的工艺对给定的植物材料进行分离，参见例如名为《淀粉生产技术》(J.A.Radley编)一书。图2中给出了图解说明小麦分离工艺的流程图。
可以通过本领域现有的小麦工业分离工艺进行本发明方法。然而，目前优选使用的是所谓的粉碎工艺(或湿磨工艺)，其中起始材料是待分离小麦的可泵抽的稀释分散体。通常由小麦粉和水制成这种分散体。分散体中干物质含量通常为35-50％。已知有两种主要类型的粉碎工艺水力旋流器工艺和滗析器工艺。这些工艺的优点在于耗水量非常少。
在水力旋流器工艺中，首先将面粉与水混合，制成生面团，然后对其进一步稀释，并传送到搅拌的附聚罐内，在其中麸质被附聚。将含有麸质小附聚物和淀粉的分散体泵入一套水力旋流器中，在此处进行离心分离。麸质和“B”-淀粉是最轻的组分，它们一起处于水力旋流器的上层，通过筛子可将麸质与“B”淀粉分离。水力旋流器的底流主要由“A”淀粉组成，而两种组分中均有戊聚糖(或纤维)。通过一系列洗涤/浓缩步骤，对各组分进一步清理。
滗析器工艺与水力旋流器工艺的至少一个主要不同点在于何时附聚成麸质。在滗析器工艺中，保持粉末的低浓度是非常重要的，这样可以避免麸质在进行两相或三相滗析器分离之前形成较大的块。分离前，将面粉/水混合分散体泵入均浆器-具有高剪切力的特殊栓磨，使麸质开始附聚，在分离之前，对分散体再作一次稀释。在两相滗析器情况下，底流含有相当干净的“A”淀粉，而溢流含有麸质、“B”淀粉和戊聚糖。至于三相滗析器，两相中除含有“A”淀粉外，还含有麸质及一些“B”淀粉，一相中含有“B”淀粉和戊聚糖。
当使用CBD和木聚糖酶分离小麦时，有可能提供生面团混合和匀浆容量，提高分离容量，降低戊聚糖组分的粘度(这样在蒸发和干燥时可以降低能量消耗)，并且降低滗析器上的安瓿耗费。此外，还可以提高终产物的纯度，并且，由于粘度降低使得流速提高，因而可以缩短加工时间。
植物材料分离工艺通常是在pH3-8，如pH4-7，特别是pH5.5-6.5下进行的。通常，温度为15-50℃，如35-45℃。在小麦分离工艺中，通常在40℃的温度下进行1-5分钟，完成本发明的分离。
CBD的加入量通常是0.01-1克蛋白质/克干固体(DS)，优选0.1-0.5g蛋白质/克干固体。
通常，每克干固体(DS)加入1-50 FXU木聚糖酶。
为达到一些目的，最好与另一种酶一起使用木聚糖酶。例如，已经发现，结合使用此处所述的木聚糖酶与纤维素酶，会产生协同效果。纤维素酶的使用量可以是相当于0-30,000EGU/千克面粉，优选是相当于200-5000EGU/千克面粉。
植物材料的粘度降低也可以将木聚糖酶与CBD结合使用，达到降低植物材料粘度的目的。
本发明也涉及一种降低植物材料粘度的方法，其中用糖类结合结构域(CBD)和木聚糖酶处理所述植物材料。比如在连续小麦分离工艺中，粘度降低的重要性可能在于可以提高小麦面粉流速。此外，在食品或饲料的制备和酿酒中，粘度降低也是很重要的，参见Visser等，木聚糖和木聚糖酶，(1991)。
酿酒此外，本发明也涉及通过用CBD和木聚糖酶处理大麦或高粱，而从大麦或高粱制备用于酿酒的谷汁(wort)的方法。这样降低了酿酒工艺中谷汁的粘度。可以将CBD和木聚糖酶用于由大麦和高粱制得的谷汁中，使用方式可以与常规用于酿酒的戊聚糖酶相同。
附图简述

图1显示在有CarezymeTM存在的情况下，支链淀粉酶对支链淀粉的脱支程度。
图2比较了在有纯化CBD和Carezyme(一种含CBD的纤维素酶)存在的情况下，支链淀粉酶对支链淀粉的脱支程度。
图3显示实验室建立的用于评估酶浸渍效果的简化流程图。
本发明的详细公开因此，第一方面，本发明涉及一种液化淀粉的方法，其中，在含水介质中，用有效量糖类结合结构域(CBD)和至少一种淀粉分解酶(如α-淀粉酶)的组合物处理淀粉底物。
在本发明的一个实施方案中，所用的淀粉分解酶是D-酶(EC 2.4.1.25)或Q-酶(EC 2.4.1.18)和/或脱支酶，如支链淀粉酶或异淀粉酶。
本发明另一方面涉及一种用于糖化已经过液化加工的淀粉的方法，其中，在液化后，用有效量的糖类结合结构域(CBD)和支链淀粉脱支酶(如异淀粉酶(EC 3.2.1.68)或支链淀粉酶(EC 3.2.1.41))的组合处理反应混合物。
应理解，在本发明中描述的淀粉液化加工不包括诸如纺织品的脱浆处理，在所述的脱浆处理中，通过酶促加工，从织物或纺织品中去除存在于织物或纺织品(通常是纤维素的或含有纤维素的织物或纺织品)中的淀粉(“浆”)。然而，在纺织品的脱浆过程中，结合使用适当量的CBD和α-淀粉酶，估计比在无CBD时使用α-淀粉酶，会得到更强的淀粉清除性能。
本发明另一方面还涉及从含淀粉的玉米种子中回收淀粉的一种方法，其中，将种子浸渍在含CBD和木聚糖酶的介质(通常是水性的)中。
糖类结合结构域糖类结合结构域(CBD)是优先与多糖(糖类)结合的多肽氨基酸序列，它常常、但并非绝对只能与多糖的水不溶性形式(包括晶体)结合。
虽然在专利和科学文献中已经描述了许多类型的CBD，但是其中大部分-它们中许多来源于纤维素分解酶(纤维素酶)-通常被称为“纤维素结合结构域”；因此典型的纤维素结合结构域是出现在纤维素酶中的CBD。类似地，CBD的其它亚类应包括例如壳多糖结合结构域(通常出现在壳多糖酶中的CBD)，木聚糖结合结构域(通常出现在木聚糖酶中的CBD)，甘露聚糖结构域(通常出现在甘露聚糖酶中的CBD)和其它。
CBD是由2个或多个多肽氨基酸序列区组成的大多肽或蛋白质的内部部分，尤其是存在于水解酶中，所述水解酶通常包含一个含有用于底物水解的活性位点的催化结构域和一个用于与目的糖类底物结合的糖类结合结构域(CBD)。这样的酶可以包含一个以上的催化结构域和一个、两个或三个CBD，还可包含将CBD与所述催化结构域连接起来的一个或多个多肽氨基酸序列区，后一类型的区域通常被称为“接头”。包含CBD的水解酶的例子有纤维素酶，木聚糖酶，甘露聚糖酶，阿拉伯呋喃糖苷酶，乙酰酯酶和壳多糖酶，其中一些已在上文中提及。也已经在藻类中，例如在红藻Porphyra purpurea中发现了非水解性多糖结合蛋白质形式的CBD(参见P.Tommer等人，纤维素结合结构域-分类和在不可溶性糖类的酶促降解中的特性，John N.Saddler和Michael H.Penner(Eds)，ACS年会系列，No.618(1996))。但是，大多数已知的CBD(由P.Tommer等人(出处同前)分类和命名为“纤维素结合结构域”)来源于纤维素酶和木聚糖酶。
在本发明中，术语“纤维素结合结构域”与后一参考文献(P.Tomme等人(出处同前))中的含义相同，因此本文使用的简写“CBD”经常可以理解为广义(糖类结合结构域)或原则上狭义地理解(纤维素结合结构域)。P.Tomme等人的参考文献将120种以上的“纤维素结合结构域”划分为10个家族(I-X)，它们可能在底物结合机理方面具有不同的功能或作用。然而，估计在将来还会出现新的家族代表和其它CBD家族。
对于其中存在CBD的蛋白质/多肽(例如酶，通常是水解酶)，CBD可能位于N或C末端，或位于内部位置。
其本身构成CBD的多肽或蛋白质(例如水解酶)的那一部分通常由约30个以上且约250个以下的氨基酸残基组成。例如根据P.Tomme等人(出处同前)描述，在家族I中列出和分类的那些CBD由33-37个氨基酸残基组成，在家族IIa中列出和分类的CBD由95-108个氨基酸残基组成，在家族VI中列出和分类的CBD由85-92个氨基酸残基组成，而在家族VII中列出和分类的一种CBD(来源于热纤维梭菌纤维素酶)由240个氨基酸残基组成。因此，本身构成CBD的氨基酸序列的分子量通常是在约4kD到约40kD的范围内，并且通常低于约35kD。
虽然如上所述的CBD本身通常与本发明内容有关，但是，本说明书和权利要求书中所用的术语“糖类结合结构域”(CBD)也应理解为包括不超过和包含一种含CBD之酶(如多糖水解酶)整个氨基酸序列的整体或不包括该酶的催化性结构域、但仍具有该酶之CBD作用的酶部分。
因此，尽管包含酶[如纤维素分解酶(纤维素酶)或含有一个或多个CBD的其它酶]催化作用的整个氨基酸序列在某些方面可能具有与本文所述CBD相同的作用-至少在性质上是如此，但在本发明内容中，通常并不将这种完整氨基酸序列视为CBD。此中一个例外是，当含CBD之酶的氨基酸序列中构成糖类结构结构域本身的那一部分包含该酶的整个催化性结构域(或反过来)或者与其相同之时。
在本

发明内容
中具有吸引力的市售CBD包括由Goldstein等[细菌学杂志，175(1993)，5762页]所述的和公开于US 5496934中的CBD。该CBD可得自Sigmal Chemical Company，St.Louis，USA，目录号为No.C1332。
可用于制备CBD的纤维素酶(纤维素酶基因)适用于分离纤维素酶基因的技术是本领域内技术人员熟知的。在本发明中，术语“纤维素酶”是指可催化纤维素降解为葡萄糖、纤维素二糖，纤维素三糖和/或其它纤维素寡糖的酶。
本发明优选的纤维素酶(即包含优选的CBD的纤维素酶)是微生物纤维素酶，特别是细菌或真菌纤维素酶。内切葡聚糖酶(EC 3.2.1.4)，特别是单成分(重组)内切葡聚糖酶是优选的一类纤维素酶。
有用的细菌纤维素酶的例子是来源于下列组的细菌或可由它们所产生的纤维素酶；假单孢菌，芽孢杆菌，纤维单胞菌，梭菌，Microspora，栖热袍菌，Caldocellum和放线菌例如链霉菌，Termomonospora和Acidothemus，特别是来自于下列组Pseudomonas cellulolyticus，灿烂芽孢杆菌，粪肥纤维单胞菌，热纤维梭菌，特别是粪堆梭菌，Microsporabispora，Termomonospora fusca，Termomonospora cellulolyticum和Acidothemus cellulolyticus。
纤维素酶可以是酸性、中性或碱性纤维素酶，即分别在酸性、中性或碱性范围内显示纤维素分解最大活性的酶。
有用的纤维素酶是酸性纤维素酶，优选的是真菌酸性纤维素酶，它是来源于下列各属之组的真菌或可由它们所产生的纤维素酶木霉属，漆斑菌属，曲霉属，Phanaerochaete，脉孢霉属，Neocallimastix和葡萄孢属。
优选的有用酸性纤维酶是来源于下列各种真菌或可由它们所产生的酸性纤维素酶绿色木霉，Trichoderma reesei，Trichodermalongibrachiatum，疣孢漆斑菌，黑曲霉，米曲霉，Phanaerochaetechrysosporium，粗糙脉孢霉，Neocallimastix partriciarum和灰葡萄孢。
另一种有用的纤维素酶是中性或碱性纤维素酶，优选的是真菌中性或碱性纤维素酶，它来源于下列组的各属内真菌或可由它们产生曲霉属，青霉属，毁丝霉属，腐质霉属，耙菌属，镰孢属，葡萄穗酶属，帚酶属，毛壳属，疣孢霉属，轮枝孢属，漆斑菌属，丝葚霉属，粘帚霉属、头孢属和支顶孢属。
优选的碱性纤维素酶是来源于下列组的各种真菌或可由它们所产生的碱性纤维素酶Humicola insolens，尖镰孢，嗜热毁丝霉，微紫青霉和头孢霉，优选来自于下列组或可由它们产生的碱性纤维素酶Humicola insolens DSM 1800，尖镰孢DSM2672，嗜热毁丝霉CBS117.65和头孢霉RYM-202。
优选的纤维素酶是一种碱性内切葡聚糖酶，它与针对高度纯化的、来源于Humicola insolens DSM1800的～43kD内切葡聚糖酶而产生的抗体具有免疫反应性，或者它是该～43kD内切葡聚糖酶的衍生物并且显示纤维素酶活性(如CarezymeTM)。
有用的纤维素酶的其它例子是真菌或细菌来源的亲本纤维素酶的变体，例如来源于真菌腐质霉属，木霉属或镰孢属之一内菌种的菌株的亲本纤维素酶之变体。
可用于制备CBD的其它蛋白质(蛋白质基因)如已经提到的，包含CBD的其它类型水解酶例如有木聚糖酶(如分类为EC 3.2.1.8或EC 3.2.1.32的木聚糖酶)，甘露聚糖酶，阿拉伯呋喃糖苷酶，乙酰酯酶和壳多糖酶。以前也已经提到，例如在一些藻类(如红藻Porphyra purpurea)中也发现了非水解性多糖结合性蛋白质形式的CBD。可参考P.Tomme等人(出处同前)的文献进一步详细了解有关这种CBD的来源(生物体属和种)的具体细节。与本发明相关的其它CBD包括来源于葡糖淀粉酶(EC 3.2.1.3)或来源于CGT酶(EC 2.4.1.19)的CBD。
衍生自这种来源的CBD通常也适用于本发明的一个或多个方面。就此而言，适用于分离例如木聚糖酶基因、甘露聚糖基因、阿拉伯呋喃糖苷酶基因、乙酰酯酶基因、壳多糖酶基因(和其它相关基因)的技术在本领域内是熟知的。
CBD的分离为了分离例如纤维素结合结构域，可以使用几条基因工程途径。一种方法是使用限制性酶以除去基因的一部分，然后将留下的基因-载体片段读框一致地融合，以获得编码对于特定基因片段有所截短的蛋白质的突变基因。另一种方法涉及使用外切核酸酶，例如Bal31，从DNA的5′和3′末端外部地，或从基因内的限制性缺口内部地系统性缺失核苷酸。这些基因缺失方法导致产生编码缩短的基因分子的突变基因，然后可以评价该突变基因表达产物的底物结合(例如纤维素酶结合)能力。用于评价结合能力的合适底物包括纤维素物质，例如AvicelTM和棉纤维。
其它方法包括使用能够从目的蛋白质的多肽链剩余部分切割CBD(例如末端CBD)的选择性或特异性蛋白酶。
淀粉分解酶至少是在本发明中，术语“淀粉分解酶”包括归为EC 3.2.1(如支链淀粉酶)和EC 2.4.1(如D-酶和Q-酶)酶组内的那些酶。
适于在本发明中与CBD结合使用的淀粉酶(特别是α-淀粉酶)包括细菌和真菌来源的酶。在这一方面，也包括这些淀粉酶的经化学或基因工程修饰过的突变体。相关的α-淀粉酶包括例如可得自芽孢杆菌的α-淀粉酶，特别是可得自GB1296839中详细描述的地衣芽孢杆菌一个特殊菌株的α-淀粉酶。相关的市售淀粉酶包括DuramylTM，TermamylTM，FungamylTM和BANTM(均可得自Novo Nordisk A/S，Bagsvaerd，丹麦)，以及RapidaseTM和MaxamylpTM(可得自Gist-Brocades，Holland)。
淀粉或淀粉片段脱支酶异淀粉酶适于在本发明中与CBD结合使用的异淀粉酶(EC3.2.1.68)包括细菌来源的那些。这样也包括这些异淀粉酶的经化学或基因工程修饰的突变体。相关的异淀粉酶包括例如可从假单孢菌(例如假单孢菌SMP1或淀粉皮假单孢菌SB15)，芽孢杆菌(例如解淀粉芽孢杆菌)，黄杆菌或噬纤维菌(溶杆菌)获得的异淀粉酶。
支链淀粉酶适于在本发明中与CBD结合使用的支链淀粉酶(EC3.2.1.41)包括细菌来源的那些。这样也包括这些支链淀粉酶的经化学或基因工程修饰的突变体。相关的支链淀粉酶包括例如可从芽孢杆菌(例如B.acidopullulyticus；如PromozymeTM，可从Novo Nordisk A/S获得)获得的支链淀粉酶。
其它多糖水解酶在本发明中[特别是在玉米浸渍加工(参见上文)中提高由玉米回收淀粉的量的过程中]可与CBD结合使用的特别相关的其它酶包括木聚糖酶，如归类为EC3.2.1.8或EC3.2.1.32的那些酶。这样也包括木聚糖酶的经化学或基因工程修饰的突变体。相关木聚糖酶的例子有可得自NovoNordisk A/S的ShearzymeTM，或可得自Genencor，USA的SpezymeCP；一种H.insolens木聚糖酶(按WO92/17573中实施例2所述制备)，木聚糖酶I粉末(利用木聚糖酶I(WO94/21785中所述)作为起始物质，按照标准方法，通过固体-液体分离、浓缩和冰冻干燥制备)，木聚糖酶II(按WO94/21785中所述制备)，按WO92/03540所述从短小芽孢杆菌菌株DSM6124制得的木聚糖酶。
Q-酶可以例如来源于芽孢杆菌菌株，如巨大芽孢杆菌或嗜热脂肪芽孢杆菌，或者是EP418,945中述及的其它脱支酶。
D-酶可以例如来源于嗜热栖热菌、Thermococcus lithoralis、丁酸梭菌、肺炎链球菌、大肠杆菌或来自马铃薯。
适当时，可以将一个以上的CBD(如选自本文所述的那些CBD类型)与一种以上的酶(如选自本文所述的那些酶类型的两种或多种酶)结合使用。
欲用于本发明中的酶和CBD可以是适于目的用途的任何形式，如干粉或颗粒形式，特别是无粉尘颗粒，液体，特别是稳定化液体，或者是受到保护的酶。受到保护的酶类可以按照EP238,216中公开的方法制备。颗粒可以按照例如US 4,106,991和US4,661,452(均为NovoIndustri A/S的专利)公开的方法制备，并且任选地可通过本领域已知方法进行包覆。
欲在本发明中使用的酶活性理想水平和CBD量相应地取决于该酶、CBD和酶/CBD组合将作用的底物(如液化加工中的淀粉)的特性。依据本领域已知方法，本领域技术人员能够确定酶活性和CBD的合适剂量。
材料和方法支链淀粉酶来自Bacillus acidopullulyticus的Promozyme(可从Novo Nordisk获得)(描述于EP63,909中)。
木聚糖酶Shearzyme(可从Novo Nordisk获得)。
纤维素酶Carezyme(Novo Nordisk A/S)SteepzymeTM是Novo Nordisk的一种实验用多活性酶复合物，它是从曲霉属的一个筛选菌株中制得的。SteepzymeTM含有下述多种活性的酶制剂果胶分解活性，纤维素分解活性和半纤维素分解活性。
CBD来自粪堆梭菌(NCIMB 11754)XynA(GenBank和SWISSPORT登录号为13325或Sakka等(1993)，生物科学、生物技术与生物化学，57(2)，273-277页。“编码木聚糖酶A的粪堆梭菌XynA基因的核苷酸序列催化性结构域和纤维素结合结构域的鉴定”，或Sakka等(1996)，Ann.N.Y.Acad.Sci.782，241-251页，“粪堆梭菌木聚糖酶A中纤维素结合结构域的鉴定和表征”)的纤维素结合结构域二聚体。
支链淀粉(含蜡玉米淀粉，Cerestar)面粉下述实施例中所用面粉具有以下组分

<p>Fakta面粉普通类型的市售面粉(“Luksus hvedemel”，Dagligvaregruppen，DK-7100 Vejle生产)。
α-淀粉分解酶活性(KNU)的测定利用马铃薯淀粉作为底物，可以测定一种酶的α-淀粉分解活性。该方法是基于改性的马铃薯淀粉的裂解(水解)，反应后将淀粉/酶或淀粉/杂合体酶溶液的样品与碘溶液混合。起初，形成稍黑的蓝颜色，但是在淀粉的裂解期间，蓝颜色变得越来越弱，并逐渐转变为稍红的棕色。将形成的颜色与带色的玻璃校正标准比较。
1千Novo α-淀粉酶单位(KNU)定义为在标准条件下(即在37±0.05℃，0.0003M钙离子，pH5.6)下，使5.26克淀粉干物质(可溶性的MerckAmylum)糊精化的酶(活性)量。
支链淀粉酶活性(PUN)的测定1 Pullulanase Unit Novo(PUN)活性定义为使用水解支链淀粉(pullulan)的酶，在下述标准条件下，每分钟释放相当于1μmol葡萄糖的还原能的还原性糖类所需的酶量底物0.2％支链淀粉温度40℃pH5.0反应时间30分钟可索要得到该分析方法的详细说明书(AF190)。
木聚糖酶活性(FXU)的测定通过一项试验确定内切木聚糖酶活性，其中，将木聚糖酶样品与一种雷玛唑-木聚糖底物(用雷玛唑亮蓝R染色的4-O-甲基-D-葡糖醛酸-D-木聚糖(4-O-methyl-D-glucurono-D-xylan))(pH6.0)一起温育。在50℃温育30分钟。用乙醇沉淀未被降解的染色底物背景。在585nm，经分光光度计测定上清液中的残留蓝颜色，它与内切木聚糖酶活性成正比。
样品中的内切木聚糖酶活性测定为酶标准的相对量。
可索要得到该Novo Nordisk分析方法的详细说明书。
内切葡聚糖酶活性(EGU)的测定通过振动粘度计测量术，在pH6.0对CMC分析发酵液。具体地说，制备于0.1M磷酸盐缓冲液(pH6.0)中的含34.0g/l CMC(Blanose Aqualon)的底物溶液。将待分析的酶样品溶解于相同缓冲液中。混合14ml底物溶液和0.5ml酶溶液，转移至恒温于40℃的振动粘度计(如可得自Sofraser，France的MIVZ3000)中。内切葡聚糖酶单位(EGU)测定为样品粘度和标准酶溶液粘度之间的比率。
适于评估含有CBD+酶组合在淀粉加工中的效能的测试条件适于测试如上所述的CBD+α淀粉酶、CBD+异淀粉酶或CBD+支链淀粉酶组合的测试条件(例如pH，温度，钙浓度等等条件)可以是上面就工业淀粉转化加工而描述的那些条件。适于测定多种类型的酶在各种条件下(例如pH，温度，钙浓度等等，取决于酶杂合体的特性)的酶活性的测定方法是本领域熟知的，所述酶适于与本文所述的CBD结合使用，本领域的普通技术人员能够容易地选择适于评估在本文中应用的这种组合酶促效能的测试方法。
浸渍方法按照如下所示和图3进行浸渍。
1.浸渍。
在浸渍前测量玉米干物质和淀粉含量。
浸渍期间，测定pH、干物质和干物质量。
2.除胚芽温和混和浸渍过的玉米种子。
3.浮选在玻璃杯中，另加入350g NaCl溶液并混合，从而将胚芽与玉米的其它部分分开。除去胚芽后的体积大约为600ml。
4.洗涤胚芽在振动筛(45μm)上，用水洗涤胚芽，直至洗涤水经碘溶液染色成黄色时止。然后回收水。测量胚芽干物质、量以及淀粉含量。
5.研磨5a.用家用混和器进行混和。
总混和时间是15分钟。每混和1分钟后即浸入冰水中1分钟。不需要额外的水。
5b.使用FRYMA MZ-110研磨机。碾磨时间是1分钟。使用1.5升浆液(slurry)。
6.洗涤纤维在振动筛(45μm)上洗涤，直至洗涤水经碘溶液染色成黄色时止。测量纤维干物质、量和淀粉含量。
7.分离淀粉/麸质在置于抽真空的真空瓶上面的Büchner漏斗上洗涤纤维，收集滤过的浆液。测量淀粉/麸质干物质、量和淀粉含量。测量洗涤水的量和干物质。基于材料干物质进行物料衡算。基于淀粉进行物料衡算。
实施例实施例1用脱支酶和Carezyme对支链淀粉进行脱支通过搅拌20分钟，将支链淀粉(含蜡玉米淀粉，Cerestar)悬浮于去离子水中成7％DS浆液。将20g浆液等分样品加入带螺丝帽的玻璃管中。在油浴中加热玻璃管内的淀粉浆液至140℃9分钟。胶凝作用后，将淀粉溶液在空气中晾凉至60℃(约10分钟后)。冷却后，充分晃动淀粉溶液，再将其移入加热至60℃的水浴中。除2支玻璃管(对照管)外，向所有管中加入基本剂量为2PUN/g DS的脱支酶(PromozymeTM600L，批号AGN2008；相当于5ml/玻璃管)。按下述方案，向淀粉溶液中加入明胶和纤维素酶(CarezymeTM)

*)纯化的纤维素酶，批号car-wt-9509，9.8mg酶蛋白/ml(e.p.＝酶蛋白)#)明胶，Merck 4078，稀释至10mg/ml。
加入酶和明胶后，充分晃动各玻璃管，置于60℃温育24小时。
温育后，在50℃的烤箱中，将玻璃管内成分在小锡箔盘内干燥过夜。在研缸内匀浆得到的干物质样品。
在水浴中，通过加热至70℃过夜，使20mg每份干燥样品溶于8mlDMSO(二甲基亚砜)中。通过1mm滤膜(Gelman AcrodiscTMCR PFTE)过滤诸溶液。利用Polymer Labs.(UK)的一套3PLGeel 20mm MIXED A300×7.5mm，在Waters设备(泵，自动取样品和RI检测器)上进行GPC分析。用99.9％(V/V)DMSO和0.1％0.01M NaNO3，流速为0.5ml/min，洗脱样品。加热柱至40℃。分析100ml样品。
利用具有GPC选项的Milleniuma2010色谱处理器(Waters)，基于Polymer Labs的支链淀粉标准(MW180-1,600,000)，计算分子量分布范围。
实验结果显示，剂量为约2PUN/g DS的脱支酶达到的脱支程度为约40-50％。选用脱支酶的这一剂量是为了能达到合理脱支程度，并且脱支效果仍能够进一步增强。
如上述，通过GPC评估脱支程度，用材料中分子量在20,000道尔顿以下的部分所占重量分数表示。若40％的材料的分子量低于20,000道尔顿，则脱支程度为40％。
将不同剂量的明胶(0.25，0.5和0.75mg/g DS)与脱支酶(2PUN/g DS)一起温育，目的在于观察蛋白质的可能影响。表1列出了有各种不同剂量的明胶时的脱支程度。
表1

<p>有不同剂量的明胶时，脱支酶基础剂量为2PUN/g DS的脱支程度。
由表1所示结果，似乎可以看出，在用脱支酶对支链淀粉进行脱支期间，加入明胶没有任何影响。明胶剂量不超过0.5mg/g DS时，脱支程度约为52％，剂量为0.75mg/g DS时，脱支程度约为47％。如果明胶对脱支效率有什么影响的话，那么，看来在高剂量时这种影响是负面的。
表2显示用2PUN/g DS的脱支酶与不同剂量的纤维素酶(含有CBD)一起脱支时的结果。
表2

>表2中的结果依据的是4次重复实验。
图1中，以图表形式给出了各实验结果。
表2和图1显示，加入纤维素酶，有明显的剂量-反应效果。无纤维素酶存在时，脱支程度约为40％。随着纤维素酶用量的增加，脱支程度也得到提高。使用0.8mg纤维素酶/g DS时，脱支程度已增至约55％，提高水平相当于脱支效率的38％。
所用的纤维素酶，即含有CBD的Carezyme，它能提高脱支酶的脱支效率。等同剂量的明胶(一种不含CBD的蛋白质)对脱支效率没有或仅有微弱的负面影响。
实施例2用脱支酶和纯CBD对支链淀粉进行脱支通过搅拌20分钟，将支链淀粉(含蜡玉米淀粉，Cerestar)悬浮于去离子水中成7％DS浆液。将20g浆液等分样品加入带螺丝帽的玻璃管中。在油浴中加热玻璃管内的淀粉浆液至140℃9分钟。胶凝作用后，将淀粉溶液在空气中晾凉至60℃(约10分钟后)。冷却后，充分晃动淀粉溶液，再将其移入加热至60℃的水浴中。
按下述方案，向各淀粉溶液中加入脱支酶(Promozyme 600L，批号AGN 2008；稀释至60PUN/ml)和CBD(粪堆梭菌，批号opr 051195，MB206#9644，4mg/ml

加入脱支酶和CBD后，充分晃动各玻璃管，置于60℃温育24小时。
温育后，在50℃的烤箱中，将每一玻璃管内的2g等分样品在小锡箔盘内干燥过夜。在研缸内匀浆得到的干物质样品。
在水浴中，通过加热至70℃过夜，使20mg每份干燥样品溶于8mlDMSO(二甲基亚砜)中。通过1mm滤膜(Gelman AcrodiscTMCR PFTE)过滤诸溶液。利用Polymer Labs.(UK)的一套3PLGeel 20mm MIXED A300×7.5mm，在Waters设备(泵，自动取样品和RI检测器)上进行GPC分析。用99.9％(V/V)DMSO和0.1％0.01M NaNO3，流速为0.5ml/min，洗脱样品。加热柱至40℃。分析100ml样品。
利用具有GPC选项的Milleniuma2010色谱处理器(Waters)，基于Polymer Labs的支链淀粉标准(MW180-1,600,000)，计算分子量分布范围。
如同评估纤维素酶(Carezyme)效果一样(实施例1)。通过GPC(凝胶渗透色谱)评估脱支程度，用材料中分子量在20,000道尔顿以下的部分所占重量分数表示。
表3列出了用不同剂量的脱支酶达到的脱支程度。
表3

由表3可以看出，剂量由2PUN/g DS增加到5PUN/g DS时，脱支程度由37％提高到44％。
表4中列出了用不同剂量CBD与2PUN/g DS固定剂量的脱支酶时达到的脱支程度。
表4

由表4可以看出，CBD用量增加可以稍微提高脱支酶效率。
虽然用0.5和0.7mg/g DS得到的结果之间有些差异，但是，与剂量为相同毫克水平的Carezyme(含有CBD)相比，纯CBD的效率没有如此显著。图2中图解说明了这一结果，其中给出了纯CBD和含有CBD的纤维素酶(即Carezyme)(实施例1的结果)的剂量-反应曲线。
图中未使用0.5mg/g DS时的值53％。可以看出，来自粪堆梭菌的CBD能提高脱支酶的脱支效率。
实施例3用CBD和木聚糖酶降低粘度用下述方法，测量CBD和木聚糖酶结合使用时引起的粘度降低准确称量100g Fakta面粉。向保温在35℃的120ml去离子水中加入CBD和木聚糖酶。CBD和木聚糖酶的剂量如下木聚糖酶7.5FXU；CBD0.1毫克蛋白质/克干固体。
对仅含有7.5FXU木聚糖酶的样品和用作对照的空白样品(未加入CBD和木聚糖酶)也进行了测试。
手动搅拌面粉与水30秒钟，然后，在混和器(Warring，市售实验室混和器，Struers，调节档1-7，转片(四块刀片)位于底部)中，于第7档(最大速)混和恰好30秒钟。费时30秒将液体倾入粘度计(程控流变仪，DV-111型，Brookfield，25号转子，测量管恒温在38℃)中的测量管内。每15秒测量40rpm时的粘度，共测4分钟。比粘度用样品平均粘度/空白平均粘度的百分比表示，用它来衡量粘度降低情况。平均粘度是60秒后直至测量结束时测得的各粘度水平的平均值。
实施例4分离小麦通过离心测试评估CBD和木聚糖酶的小麦分离能力按照实施例3所述的操作，混合Fakta面粉和水。混和后，在4332g离心10ml该混合物5分钟。离心后，淀粉位于底层，上面是麸质，淤渣，顶层是流出物层。分离效果用流出物百分比表示。百分比越高，分离效果就越好。
实施例5玉米种子的浸渍含淀粉的玉米种子的浸渍方法描述于上述的“浸渍方法”部分，还进一步描述于图3中。
在有和没有CBD的情况下，向浸渍液中加入0.2％SteepzymeTM(根据玉米干物质)。
与仅加入SteepzymeTM的浸渍实验相比，同时加入SteepzymeTM和CBD使得淀粉产率更高，胚芽和纤维内的淀粉更少，浸渍液中粘度更低，淤渣更少，下游操作中的纤维更少，浸渍所耗时间也缩短了。
权利要求
1.一种液化淀粉的方法，其中，在含水介质中，用糖类结合结构域(CBD)和至少一种淀粉分解酶处理淀粉底物。
2.根据权利要求1的方法，其中，在含水介质中，用糖类结合结构域(CBD)和α-淀粉酶处理淀粉底物。
3.根据权利要求1的方法，其中，在含水介质中，用糖类结合结构域(CBD)和D-酶或Q-酶和/或脱支酶组合处理淀粉底物。
4.根据权利要求3的方法，其中所述脱支酶是支链淀粉酶或异淀粉酶。
5.一种对已经过液化加工的淀粉进行糖化的方法，其中，在液化后，用糖类结合结构域(CBD)和支链淀粉脱支酶处理反应混合物。
6.根据权利要求5的方法，其中所述支链淀粉脱支酶是异淀粉酶或支链淀粉酶。
7.根据权利要求5的方法，其中所用CBD是含有一或多个CBD的酶形式。
8.根据权利要求7的方法，其中所述含有CBD的酶是纤维素酶、木聚糖酶、甘露聚糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、乙酰酯酶、壳多糖酶、葡糖淀粉酶或CGT酶。
9.一种对已经过液化加工的淀粉进行糖化的方法，其中，在液化后，用糖类结合结构域(CBD)和葡糖淀粉酶组合处理反应混合物。
10.根据权利要求5-9中任何一项的方法，其中所述淀粉底物已经过α-淀粉酶的处理进行液化。
11.根据权利要求5-9中任何一项的方法，其中所述淀粉底物的液化加工是按照权利要求1-4的方法进行的。
12.一种从含淀粉的玉米种子中回收淀粉的方法，其中，在含有CBD和半纤维素分解活性和纤维素分解活性的含水介质中，对所述种子进行浸渍。
13.根据权利要求12的方法，其中所述半纤维素分解活性是木聚糖酶活性。
14.根据权利要求12的方法，其中所述纤维素分解活性是纤维素酶活性。
15.根据权利要求12-14中任一项的方法，其中，在有果胶分解活性存在的情况下，对该含淀粉的玉米种子进一步浸渍。
16.根据权利要求15的方法，其中所述果胶分解活性是果胶酶活性。
17.一种降低植物材料粘度的方法，其中用糖类结合结构域(CBD)和木聚糖酶对所述植物材料进行处理。
18.一种分离植物材料的方法，其中用糖类结合结构域(CBD)和木聚糖酶对所述植物材料进行处理。
19.根据权利要求15-17中任何一项的方法，其中所述植物材料是小麦、黑麦、大麦或燕麦。
20.一种从大麦或高粱制备酿酒用谷汁的方法，其中用CBD和木聚糖酶对大麦或高粱进行处理。
21.根据前述权利要求中任何一项的方法，其中所述CBD是来源于纤维素酶、木聚糖酶、甘露聚糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、乙酰酯酶、壳多糖酶、葡糖淀粉酶或CGT酶的CBD。
全文摘要
本发明涉及一种液化淀粉的方法,其中,在含水介质中,用糖类结合结构域(CBD)和至少一种淀粉分解酶对淀粉底物进行处理。
文档编号C12P19/00GK1241217SQ97180864
公开日2000年1月12日 申请日期1997年11月21日 优先权日1997年11月21日
发明者S·佩德森, C·克里斯托弗森 申请人:诺沃挪第克公司