线虫诱导的调节dna序列的制作方法

专利名称：线虫诱导的调节dna序列的制作方法
技术领域：
本发明涉及可用于在植物细胞中表达DNA序列的线虫诱导的调节DNA序列。本发明还包括含有有效地连接于在植物细胞中待表达的DNA上的该调节DNA序列的嵌合DNA，以及细胞中含有这类嵌合DNA的植物。本发明进一步涉及建立抗植物寄生线虫或至少其对植物寄生线虫敏感性降低的植物以及细胞、植物及其部分的方法。
现有技术在国际专利申请WO92/17054中，公开了鉴定及随后从拟南芥(Arabidopsis thaliana)中分离应答线虫调节DNA序列的方法。
在WO92/21757中，公开了几种从番茄(Lycopersicon esculentum)中分离到的调节DNA序列，这些序列对南方根结线虫(Meloidogyneincognita)具有应激性。这些调节序列中有些是经线虫刺激的(LEMMI’S，番茄与南方根结线虫)，而其它似乎为线虫所抑制。是否任何可诱导调节序列可被更大范围的线虫所刺激尚不清楚。
另一种为南方根结线虫所诱导的调节序列公开在WO93/06710中。这种调节序列TobRb7不利的一面是它不能为众多种类的胞囊线虫(其中包括胞囊线虫属(Heterodera)和球形胞囊线虫属(Globodera)的种)所激活，这就使得TobRb7序列不适合用于旨在抗线虫(如马铃著中抗胞囊线虫)的嵌合构建体。
本发明的目的是提供既能为胞囊线虫，又为根结线虫所诱导的调节DNA序列，以及在这些DNA控制下在线虫取食结构中表达异源DNA序列的应用，优选但不必须的是基本上以取食位点特异的方式。
发明概述本发明提供了一种从拟南芥中获得的DNA片段，当其重新导入植物体时，该DNA片段能提高根结线虫和胞囊线虫所诱导的相关DNA序列的转录。根据本发明，在SEQ ID NO1中1～3484的核苷酸序列是优选的。同时，也构思了当其重新导入植物体时能提高根结线虫和胞囊线虫所诱导的相关DNA序列的转录之本发明的DNA片段的部分或变异体。本发明更进一步优选的方面包括基本上特异于线虫取食位点的调节DNA片段。
本发明进一步的实施方案包括含沿转录方向的本发明的调节DNA片段以及在其转录控制下待表达的DNA序列之嵌合DNA序列，而且在该DNA片段的转录控制下的表达并不自然发生。本发明的嵌合DNA序列中优选的DNA序列是那些其表达引起植物细胞破坏物产生的DNA序列，如芽孢杆菌RNA酶。在一种不同的实施方案中，细胞破坏物包括互补对细胞存活所必需的RNA的RNA。而在另一种实施方案中，待表达的DNA序列引起对诱导线虫有毒物质的产生。
发现本发明的进一步应用包括含本发明的DNA片段或嵌合DNA序列的复制子、含有这类复制子的微生物、以及基因组已整合了本发明嵌合DNA序列的植物细胞。进一步的应用实施方案是基本上由本发明的细胞组成的植物根系，以及基本上由本发明的细胞组成的长成植物，优选的是双子叶植物，更优选的是马铃薯植物。还构思了嫁接于本发明的根系上的植物，以及选自种子、花、块茎、根、叶、果实、花粉中的植物部分和包括这类植物的木材和作物。
本发明也包括本发明的DNA片段应用于鉴定在植物体中能提高相关DNA序列转录的亚片段。也构思了应用本发明的嵌合DNA序列转化植物。本发明进一步提供了本发明的调节DNA序列的片段、部分或变异体用于建立杂合调节DNA序列的用途。
下面的图示进一步描述了本发明。
附图简介

图1 双元载体pMOG23质粒图谱。图2 双元载体pMOG800质粒图谱。图3 双元载体pMOG553质粒图谱。图4 双元载体pMOG819质粒图谱。图5 双元载体pMOG821质粒图谱。图6 几种pMOG821转化拟南芥品系的线虫取食位点(NFS)之外的表达模式。图7 用于构建抗线虫植物的双元系统中的NFS破坏 基因(disrupter gene)及中和基因(neutraliser gene)图谱。图8 双元载体pMOG944质粒图谱。
本发明的数种实施方法及各种短语的含义详述如下。
发明详述本发明提供了可从拟南芥中获得的调节DNA序列，该序列能为根结线虫和胞囊线虫所诱导，且对植物根中特殊的线虫取食结构中任何相关DNA所编码的化合物的表达表现出高度偏爱。在先申请WO92/17054中，一种分离调节DNA序列的方法已公开并要求专利保护，在此导入作为参考。
原则上，本发明的调节DNA序列可用于在任何所选植物中表达任何异源DNA，方法是将所述的DNA置于该调节DNA序列的控制之下，用公知方法将获得的嵌合DNA序列转化植物。各种根结线虫(如南方根结线虫)和胞囊线虫(如甜菜胞囊线虫(Heterodera schachtii)和马铃薯白线虫(Globodera pallida))(表2列出的线虫比较全面，但绝不仅限于此)一旦对根感染就表达异源DNA。有利地，为建立对植物寄生线虫的敏感性降低的植物，异源DNA可用编码对植物寄生线虫有毒或有抑制作用的物质的基因组成。这类有毒物质的例子众多，如苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis)的内毒素(如EP 0 352 052)、凝集素等等。
建立对植物寄生线虫敏感性降低的植物是本发明的更优选目标，敏感性降低在于植物根的特化的取食结构的破坏，这是通过在本发明的调节DNA序列控制下表达毒害植物的物质而实现的。此方法总的原则已在国际专利申请WO92/21757、WO93/10251和WO94/10320中公开并要求专利保护，在此导入作为参考。出于一致性的缘故，这种毒害植物的物质称为线虫取食位点(NFS)破坏物。
虽然本发明的调节DNA序列对线虫取食结构基本上特异，但是，由于它在非靶标(即非NFS)组织中的表达，在其控制下的NFS破坏物的表达可能对植物的活力和/或产量有不利影响。此外，发现本发明的调节DNA序列在转化方法中的组织培养阶段是有活性的，从而使此阶段必须利用中和物。为了减少或消除(可能是潜在的)不利影响，特别优选本发明的嵌合NFS破坏构建体与中和基因构建体的结合使用。有关构建抗线虫植物的这种所谓的双元方法的详细资料示于WO93/10251中。根据这种方法，将NFS破坏基因(基因A)置于一种至少在NFS中有活性的启动子的控制之下，优选地是在NFS外没有或几乎没有活力的启动子，而在NFS外所不希望的毒害植物的作用通过中和基因(基因B)的表达而中和，其中的中和基因至少在破坏物产生的组织(NFS除外)中表达。
根据双元方法，适合的启动子A定义为驱使编码NFS内破坏物的下游基因表达的启动子，使破坏物的表达水平达到足以对NFS的代谢和/或功能和/或存活造成损害的程度；虽然在NFS外的组织中启动子优选的是无活性的，但并不是必须如此；至少启动子在NFS外具有的活性水平不应使基因A编码的破坏物不能完全为基因B之产物中和。
本发明的调节DNA序列的特性如mnemonic#25.1所示，就象此处实施例所描述的一样，它们在双元方法中很有应用价值。很明显，本发明的调节DNA序列中可能存在众多突变，只要这些突变体没有根本改变其意图使用的特性，这类突变体也不偏离本发明。
此外，如本领域中的技术人员所熟知的，植物基因的调节区域是由种类不同的亚区域所组成，就基因表达而言不同亚区域带有不同的目的特性。如此处所指的亚区域的例子即是转录的增强子，但也是转录的沉默子。这些元件可能是以通用(组成型)方式或组织特异性方式发生作用的。本发明的调节DNA序列中可在几处进行删除，而且检测亚片段相关DNA的表达模式。多种如此获得的亚片段，甚至其组合可用在构建线虫抗性的方法中或包括在植物中异源DNA的表达的其它应用之中。功能亚区域及其在促进或抑制基因在植物中表达的应用也包括在本发明中。
在本发明的内容中，术语NFS破坏物和中和物包括一系列经选择的化合物，它们为基因产物(蛋白质，或RNA或反义RNA)对NFS或其中的细胞器之代谢和/或功能和/或存活有损害作用的DNA所编码。其中中和物当在同一细胞中与破坏物同时表达时，抑制破坏物的活性。优选的破坏物和中和物的组合是，如从解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)中获得的芽孢杆菌RNA酶/芽孢杆菌RNA酶抑制剂(Hartley，1988，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)，202，913-915)，限制性内切酶核酸/相应的甲基化酶，如从大肠杆菌(E. coli)获得的EcoRI(Green等，1981，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)，256，2143-2153)与EcoRI甲基化酶，或相似的组合，如在II型限制性修饰系统评述中所描述的(Wilson，1991，核酸研究(Nucl.Acid Res.)，19，2539-2566)，细菌素与相应的免疫蛋白质，如大肠杆菌素与从大肠杆菌中所获得的免疫蛋白质(Lau等，1985，核酸研究，12，8733-8745)，或任何破坏物编码基因，其可通过在启动子-B控制下同时产生的反义RNA被中和，如编码Diptheria毒素链A的DNA序列(Czako和An，1991，植物生理(Plant Physiol.)，95，687-692)，RNA酶如RNA酶T1，核糖核酸酶或蛋白酶。更进一步的可能是获得一种编码针对一种mRNA有核酶活性的基因，其中该mRNA编码对植物有毒的蛋白质。
本发明的另一方面是破坏物和中和物的组合，其分别包括对编码细胞存活所必需的蛋白质或多肽产物的内源基因有抑制作用的基因及中和基因，中和基因是一种编码能够取代内源蛋白质或多肽产物的功能的蛋白质或多肽产物的基因。这类破坏基因可选自下列(a)编码针对内源RNA转录物的核酶基因，(b)转录时所产生的RNA转录物与细胞存活所必需的内源基因之RNA转录物互补或至少部分互补的基因，这种方法称为基因表达反义抑制(公开于EP-A240 208)，和(c)转录时产生的RNA转录物与细胞存活所必需的内源基因转录物完全一样或至少非常相似的基因，这种仍然未知的基因表达抑制方式称为共抑制(Napoli C.等公开于1990，植物细胞(The Plant Cell)，2279-289)。
本发明的一个优选实施方案是，应用反义基因抑制细胞存活所必需的内源基因的表达，由于本发明的调节DNA序列融合于该反义基因上游，从而使这些基因在线虫取食结构中表达。
如所述，反义基因对存活所必需的内源基因的抑制所导致的破坏作用为启动子B控制下的中和基因B的表达所中和，当基因B表达时产生的蛋白质或多肽产物与内源存活基因编码的蛋白质或多肽完全一样或很相似，从而能够替代内源基因产物在宿主植物中的功能。优选的，中和基因所编码的RNA转录物的核苷酸序列与内源存活基因RNA转录物间存在差异，以避免可能的共抑制作用。因此，优选的，中和基因编码的蛋白质或多肽与内源存活基因编码的蛋白质功能基本相同，但介导的RNA转录物却不同；适合于这种描述的中和基因能通过从不同的植物种或甚至不同的非植物种如酵母、真核动物和原核生物的基因数据库筛选而获得。优选地，破坏性反义转基因与中和性有义转基因编码的转录物的核苷酸序列一致性低于90％，更优选地低于80％；甚至更优选地，所述中和性有义转基因编码在氨基酸序列上与破坏基因产物不一致的蛋白质或多肽基因产物，而且其中中和转基因编码的转录物之核苷酸序列的一致性低于75％。
反义破坏基因的靶基因选自编码细胞存活所必需的酶的基因，这些酶也称为看家酶，但优选地应为细胞核所编码的单拷贝基因，虽然小型的基因家族也适合于本发明的目的。更进一步地说，该基因的反义表达作用必须不能由于从这类酶正常合成酶产物的其它细胞或细胞器中的转移或扩散而变得无效。优选地，选择编码膜转移酶的基因，因为它们参与建立细胞器跨膜化学梯度。从定义上说，通过反义表达对这类蛋白质的抑制，并不能通过底物在这些蛋白质所在膜的跨膜扩散而消除。被转移的化合物并不局限于有机分子，它可以是无机性质的，如P、H、OH或电子。
优选地，这些膜转移酶应处于在寄生期间数量增加的细胞器，因此，显示了在含有NFS的细胞中这类细胞器的关键作用。这类细胞器的特定例子是线粒体、内质网和胞间连丝(Hussey等，1992，原生质(Protoplasma)，167，55-65；Magnusson和Golinowski 1991，加拿大植物学杂志(Can.J.Botany)，69，44-52)。表1以举例的方式列出了一些目标酶，但本发明并不局限于本表中所提及的酶。更详细的资料可从植物生物化学丛书(编者，Stumpf和Conn，1988-1991，1-16卷，学术出版社)或植物生理学百科全书(New Series，1976，Springer-Verlag，Berlin)中获得。
虽然仅仅在一些情况下分离到了编码这些酶的基因，因此，一般来说基因的拷贝数并不知，进行这些工作的必要标准也在本发明中进行了描述。表1 在NFS中反义表达的目标酶举例
合适的启动子B定义为在基因A表达的基本上所有细胞中都能驱动表达的启动子，前提是在线虫取食结构中并不驱动或并不有效驱动表达。(其中‘基本上所有细胞’的含义是指至少那些必须存活的以使正常植物生长或这类植物的商业应用的发育所需求的细胞)。如所示植物，其中破坏作用在宿主植物所有细胞中并未完全中和，虽然如此，这些植物还是存活且适合于商业应用。可提及的是在雄蕊细胞中表达本发明的破坏基因的植物，这可能产生雄性不育植物，这一点在有些作物中被看作是有商业吸引力的特征。启动子B类型中适合的例子可从植物或植物病毒中获得，或者用化学合成。调节DNA序列也可以包括增强子序列，如在CaMV的35S启动子中发现的增强子序列(Kay等，1987，科学(Science)，236，1299-1302)，和mRNA稳定序列，如苜蓿花叶病毒RNA4的先导序列(Brederode等，1980，核酸研究，8，2213-2223)，或者以相似方式起作用的其它任何序列。
另外，为在所有或实际上所有植物组织中实现表达，可用第二启动子-B’/基因-B互补启动子-B/基因-B，其表达模式在既没有启动子-B又没有启动子-B’驱动表达的NFS中，第二启动子-B’/基因-B的表达能部分覆盖或完全互补启动子-B/基因-B。同样，包括(或部分包括)不同启动子的组合以实现属于以上所述所需的表达模式的杂合启动子，也在本发明的范围之内。
优选的，启动子-B是花椰菜花叶病毒35S启动子或其衍生启动子，它们通常被认为是植物组织中组成型的强启动子(Odell等，1985，自然(Nature)，313，810-812)。另一种优选的启动子-B例子是强根启动子roID(Leach和Aoyagi，1991，植物科学(Plant Sci.)，7969-76)，其获自发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)的质粒pRiA4；ORF15的5’侧翼区(Slightom等，1986，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)，261108-121)。其它组成型的启动子，如胭脂碱合成酶启动子(Bevan，1984，核酸研究，128711-8721)或玄参花叶病毒启动子(EP-A 426 641)，用作启动子-B时的适用性，可通过与标记基因如GUS的融合、这些构建体对植物的转移及用植物寄生线虫(PPN)感染这些转基因植物后的组织化学分析而进行检测(Jefferson，1987，植物分子生物学报告(Plant Mol.Biol.Reporter)，5387-405)。
其它调节序列如终止子序列和多腺苷酸化信号包括在植物中起这种作用的任何序列，其选择属于本领域普通技术人员的知识水平内。这类序列的一个例子是根癌农杆菌的胭脂碱合成酶(nos)基因的3’侧翼区域(Bevan，1984，核酸研究，128711-8721)。
这种双元方法更详细的资料可见于WO93/10251(在此引入作为参考)。
植物种类的选择主要决定于农业上发生植物寄生线虫感染造成损害总量的估计和植物种类对转化的适应性。在农业实践中为植物寄生线虫所侵害的且可通过本发明的方法使其对植物寄生线虫的敏感性显著降低的植物属，现列于表2，但并不局限于表中所列的属。
本发明说明书中所指的线虫种类包括改变宿主细胞为特殊适用的取食结构的所有植物寄生线虫，且范围包括从迁移性的表寄生种(如导管线虫属的种(Xiphinema spp.))到更进化的固定性内寄生种(如胞囊线虫、根结线虫和旋绕线虫(Rotylenchulinae))。表2列出了一些寄生线虫，但本发明并不局限于此表所列的种。更详细的种类见Zuckerman等(编者，植物寄生线虫(Plant Parasitic Nematodes)，卷I，1971，纽约，139-162)。表2 植物寄生线虫举例及其主要宿主植物
<p>在本发明中，与对照植物相比，如果在植物根表发育的成熟雌线虫总数在统计学上有显著性降低，则说该植物显示出了对植物寄生线虫敏感性降低的特性。根据成熟雌线虫的总数将植物分类为对胞囊线虫和根结线虫的敏感性/抗性是常规技术(如LaMondia，1991，植物病害(Plant Disease)，75453-454；Omwega等，1990，植物病理学报(Phytopathol.)，80745-748)。
根据本发明，NFS应包括起始取食细胞，其指在线虫侵入的诱导下该细胞或数目非常有限的细胞注定变为线虫取食结构。
根据本发明，NFS破坏物并不局限于仅仅对NFS有不利作用的物质；而且另外构思了通过直接的相互作用对线虫的发育有不利影响的破坏作用。
含有如本发明所述DNA序列的重组DNA导入宿主植物可采用数种技术。这些技术包括但并不局限于应用钙/聚乙二醇介导的原生质体转化法、电穿孔法、显微注射法及(包被的)粒子轰击法(Potrykus，1990，生物技术(Bio/Technol.)8535-542)。
除这些所谓的直接DNA转化方法外，运用载体的转化系统也广泛应用，如病毒载体(如CaMV)和细菌载体(如从农杆菌属获得的载体)(Potrykus，1990，生物技术，8535-542)。应用本领域所知方法挑选或筛选后，经转化的原生质体、细胞和植物部分可再生成整个植株(Horsch等，1985，科学，2251229-1231)。转化和再生技术的选择对本发明来说并不关键。
依本发明优选实施方案，利用所谓的双元载体系统(公开于EP-A 120 516)，在该系统中应用含带毒性基因的辅助质粒和一种相容性质粒的农杆菌菌株、含有需转移的基因构建体的双元载体。这种载体既能在大肠杆菌中又能在农杆菌中复制；此处所用的一个质粒衍生自双元载体Bin19(Bevan，1984，核酸研究，128711-8721)。此实施例中应用的双元载体含T-DNA左边界和右边界间的序列、编码卡那霉素抗性的NPTII基因(Bevan，1984，核酸研究，128711-8721)和一个克隆所需基因构建体的多克隆位点。
最新科学进展表明，原则上单子叶植物能够转化，并且能从经转化的细胞再生成可育的转基因植物。对这些作物的再生性组织培养系统的开发及遗传物质导入植物细胞的有力方法为转化提供了方便。现在，单子叶植物转化的优选方法是外植体或悬浮细胞的微粒轰击法、直接DNA吸收或电穿孔法(Shimamoto等，1989，自然，338274-276)。通过导入吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)的bar基因获得了转基因玉米，该基因编码膦丝菌素乙酰转移酶(一种使除草剂膦丝菌素失活的酶)，通过微粒轰击法导入玉米悬浮培养液的胚胎发生细胞(Gordon-Kamm，1990，植物细胞(Plant Cell)，2603-618)。遗传物质导入其它单子叶植物如小麦、大麦的糊粉原生质体中已有报道(Lee，1989，植物分子生物学(Plant Mol.Biol.)，13；21-30)。通过选择成熟、致密且节状的胚胎发生愈伤组织用于建立胚发生悬浮培养物，从中再生出小麦植株(Vasil，1990，生物技术，8429-434)。用于这些作物的转化系统的结合使本发明能应用于单子叶植物，这些方法也可应用于双子叶植物的转化和再生。
以下实施例仅为描述之用，并不意在限制本发明的范围。
实验部分DNA方法所有DNA方法都按Maniantis描述的标准方法进行(分子克隆(Molecular Cloning)，实验手册第二版，冷泉港实验室，1990)。拟南芥的转化转化采用Valvekens等人所述的方法，即拟南芥(生态型C24)的根段与含有合适双元载体的农杆菌菌株MOG101共培养的方法(1998，美国国家科学院院报(Proc.Nat.Acad.Sci.USA)855536-5540)。具体步骤如下拟南芥的种子发芽前在4℃下春化7天。于70％乙醇中种子表面消毒2分钟，再用5％次氯酸钠/0.5％NaDodSO4处理15分钟，用无菌蒸馏水冲洗5次，然后置于装有萌发培养基(GM)(表3)的150×25毫米的培养皿中进行萌发。培养皿用透气性的医用胶带(Urgopore，Chenove France)密封。植株于22℃，16小时光照/8小时黑暗的周期条件下培养。组织培养过程的培养室条件同上。所有的植物培养基用0.5克/升(1M KOH调至pH5.7)2-(N-吗啉)乙磺酸缓冲，固体培养基加0.8％Difco Bacto琼脂，121℃蒸气灭菌15分钟。激素和抗生素分别溶解于二甲亚砜和水中，然后加入灭菌后降温至65℃的培养基中。
完整的根在0.5/0.05固体培养基(表3)上培养3天。然后把根切成约0.5厘米长的小段(此处称为外植体)，转移至10毫升0.5/0.05液体培养基中；加入0.5-1.0毫升培养过夜的农杆菌培养物。轻轻振荡2分钟，使根外植体与细菌混合。
然后，将根外植体放于无菌滤纸上以移除大部分液体培养基，再在0.5/0.05琼脂上共培养48小时。然后外植体用含万古霉素1000毫克/升(Sigma)的0.5/0.05液体培养基清洗。将其吸干培养于补加万古霉素750毫克/升和卡那霉素50毫克/升的0.15/5琼脂(表3)培养基。用含嵌合neo基因的农杆菌感染3周后，在黄色根外植体背景上形成了绿色卡那霉素抗性(KmR)的愈伤组织。这时，将根外植体移至仅含万古霉素500毫克/升和卡那霉素50毫克/升的新鲜0.15/5琼脂培养基。3周后，多数绿色愈伤组织形成了芽。将转化的芽转移至含GM的150×25毫米的培养皿中以生根或形成种子或两者都形成。在这些培养皿中，许多再生体未生根就形成种子。生根的植株也可移至土壤中以结籽。为获得具初始根的材料，对上述方法进行如下修改，6毫克无菌的拟南芥C24种子于50毫升GM(250毫升三角烧瓶)中进行萌发，条件为在弱光下，于培养室中旋转振荡(100转/分)培养9天。转基因植株再生于选择性培养基(卡那霉素50毫克/升)上形成的芽，生根后转移至萌发培养基或土壤。表3 植物培养基
L升；IAA，吲哚-3-乙酸；Kin激动素；2ipAdeN6-(2-异戊烯基)腺嘌呤；CIM愈伤组织诱导培养基；SIM芽诱导培养基；MSMurashige和Skoog培养基；B5Gamborg B5培养基。马铃薯转化应用Hoekema等人(1989，生物技术7273-278)所描述的方法，稍作修改后用于马铃薯(Solanum tuberosum var.Kardal)的转化。
去皮后表面消毒的马铃薯块茎切成2毫米厚的薄片，然后沿薄片边沿切出直径1厘米的小片。将这些小片放于WM培养基中(Murashige和Skoog培养基，含有1毫克/升盐酸硫胺素，0.5毫克/升盐酸吡哆醇VB6，0.5毫克/升烟酸，100毫克/升肌醇，30克/升蔗糖，0.5克/升MES，pH5.8)。用根癌农杆菌菌株EHA105接种，方法是用100ml新鲜WM替换WM培养基，新鲜的WM培养基中含有在LB(加上合适抗生素)中生长至OD600为0.5-0.7的10ml新鲜农杆菌培养物的重悬浮沉淀。(Hood等，1993，转基因研究(Transgenic Research)2208-218)。这些块茎小片在农杆菌悬浮液中培养20分钟后，移至CM固体培养基(在WM培养基中补加入8克/升琼脂，3.5毫克/升核苷玉米素，0.03毫克/升吲哚乙酸)，密度为每皿放置20片外植体。2天后，小片转移至PM培养基中(在CM培养基中补加200毫克/升头孢氨噻和100毫克/升的万古霉素)，选择抗农杆菌转化体。3天后，小片再转移至SIM平板(在CM培养基中补加250毫克/升羧苄青霉素和100毫克/升卡那霉素)，密度为每皿10片外植体，用于转化芽的再生选择。2周后，这些组织小片再转移至新鲜的SIM培养基中，再过3周后，转移至SEM培养基(激素浓度低10倍的SIM培养基)。经过约8-9周共培养后，芽长至能从愈伤组织上切下的大小，然后将其移至含10毫升RM培养基的玻璃管(Sigma，目录号c5916)(含0.5x MS盐类，0.5x维生素，10克/升蔗糖，100毫克/升头孢氨噻，50毫克/升万古霉素和50毫克/升卡那霉素的WM培养基)，进行体外生根和营养繁殖。线虫处理、植物根的生长和感染拟南芥种子经表面消毒后，种于含B5培养基的培养皿中，B5培养基含20克/升葡萄糖和20毫克/升卡那霉素。平板于4℃培养3天后，于22℃、16小时光照/8小时黑暗周期的培养室中培养2周。然后将卡那霉素抗性植株转移至装土的半透明塑料试管中(30×15×120毫米，Kelderplastibox b.v.，荷兰)。将试管倾斜放置(与垂轴成60度)，使根生长于试管的靠下一侧。这样就能通过肉眼观察感染过程和且便于从土壤中移出根系进行GUS分析。感染是通过注射含2期线虫的悬浮液到土壤中，接种量为每一根系500头(悬浮于3毫升水中)甜菜胞囊线虫或300头南方根结线虫。
相类似地，将在含卡那霉素的RM培养基上生根的马铃薯转化苗转移至装土的半透明塑料试管中(30×15×120毫米，Kelder plastiboxb.v.，荷兰)，将试管倾斜放置，在22℃、16小时光照/8小时黑暗的周期下培养2周。感染是通过注射含2期线虫的悬浮液于土壤中而完成的，接种量为每一根系500头(悬浮于3毫升水中)马铃薯白线虫。GUS检测感染过程中不同时期GUS活性的检测通过如下方式彻底清洗根系，除去根上大部分粘着的土壤，然后将根培养于X-Gluc溶液中(1毫克/毫升X-Gluc，50mM NaPO4(pH7)，1mM K4Fe(CN)6，1mMKK3Fe(CN)6，10mM EDTA，0.1％Triton X100)，37℃过夜。用70％乙醇温育组织几小时，从组织中除去叶绿素后，在显微镜下观察GUS染色。DNA序列测定测序是通过本领域中技术人员所熟知的标准技术完成的。
实施例1双元载体pMOG800的构建双元载体pMOG800由pMOG23衍生而来(图1，于1990年1月29日保藏于真菌菌种保藏中心，Oosterstraat 1，Baarn，荷兰，保藏号CBS102.90)，在其上于EcoRI和SmaI间导入了一个额外的KpnI限制性酶切位点至多位点接头上。该质粒包含有在T-DNA左和右边界间的卡那霉素抗性基因，用于转基因植物细胞的选择(图2)。带有pMOG800的大肠杆菌DH5α，于1993年8月12日保藏于真菌菌种保藏中心，Oosterstraat 1，Baarn，荷兰，保藏号CBS414.93。
实施例2无启动子GUS构建体pMOG553的构建该载体的构建记述于Goddijn等人，1993，植物杂志，4863-873。这篇文献中有一个错误，其构建体中包含位于β-葡糖苷酸酶基因后的CaMV35S RNA终止子而不是所示的nos终止子。该双元载体在T-DNA边界间的序列可得自EMBL数据库，保藏号X84105。pMOG553携带用于植物转化的HygR标记(图3)。
实施例3拟南芥中限定的NFS偏好启动子片段的鉴定和分离双元载体pMOG553通过三亲交配转移至农杆菌菌株MOG101，该菌株的情况详细记述于WO93/10251。将所得菌株用于拟南芥根的转化。用这种方法获得了1100多株转基因拟南芥植物品系。转基因植株生长至成熟、自花授粉且收获所得的种子(S1)，并进行春化。然后将S1种子放于含10毫克/升潮霉素和0.6％琼脂固化的营养液(Goddijn等，1993，植物杂志，4863-873)上萌发，在4℃下经过4天的吸涨期。第5天将这些平板移至室温和适宜光照(1000lux，16小时光照/8小时黑暗)条件下萌发。14天龄的小苗转移至装土斜放的半透明塑料试管(30×15×120毫米)，5000lux，20℃下继续培养。用这种方法培养的植物根系的大部分长于试管下侧的土壤和试管的交界面上。2周后，按实验部分所描述的方法用线虫对根进行感染。接种后于不同时间(从2天到14天)按实验部分所描述的方法分析根系的GUS活性。品系pMOG553#25被鉴定为一种在分别为甜菜胞囊线虫和南方根结线虫所诱导的合胞体和巨大细胞中有相当强GUS表达活性的品系。该品系未感染的对照植株(以及感染的植株)中的基部维管柱、嫩侧根的根尖和植株的多种绿色部分中检测到的GUS表达很弱。
品系pMOG553#25以1∶3的比例进行分离，说明GUS构建体处于基因组的一个位点上。通过Southern分析，鉴定出了4种不同的可能连锁的T-DNA拷贝。为了确定这4种处于右T-DNA边界侧翼的植物序列中哪种使GUS在合胞体中表达，构建了品系pMOG553#25的基因组DNA文库。用SauIIIa部分降解DNA且用核苷酸T和G部分补齐降解片段的悬垂位点后，该片段被连接到XhoI降解的λGEM11臂上，而在其上的限制性酶切位点已被核苷酸G和A部分补齐。此部分补齐使SauIIIa酶切位点与XhoI酶切位点相匹配，从而阻止在λ载体上多点插入克隆。
用gusA探针筛选了大约300,000个重组噬菌体。通过限制性酶切分析和阳性克隆的部分序列测定，分离到代表所有4个T-DNA插入位点的克隆tag1-tag4。下列RB侧翼的亚片段克隆于pMOG819中的gusA前，插入tag1的一个4.0kb SamI片段得到pMOG821，插入tag2的一个1.2kb的BamHI片段得到pMOG820，插入tag3的一个1.6kb的SamI片段得到pMOG847和插入tag4一个2.7kb BamHI片段得到pMOG848。在pMOG820、pMOG821、pMOG847和pMOG848的构建体中，基因gusA和侧翼植物序列之间的实际序列仍保留着，因为BamHI和SamI在起始标记载体pMOG553的右侧T-DNA边界与gusA编码区间切开。
实施例4无启动子GUS构建体pMOG819的构建该载体的构建是通过克隆pMOG553的GUS内含子编码区(Vancanneyt等，1990，分子基因遗传学(Mol.Gen.Genet.)，220245-250)作为于pMOG800的多位点接头上的BamHI-EcoRI片段而形成的。双元载体pMOG819(图4)用来导入克隆的启动子片段以用于植物转化后的进一步表达分析。
实施例5重新导入拟南芥后的启动子片段分析为了确定克隆的启动子片段的组织特异性活性，将所获得的pMOG820、pMOG821、pMOG847和pMOG848克隆转移至根癌农杆菌，然后将相应的菌株转化野生型的拟南芥植物。每种构建体产生19-31个转化子。从初级转化子中收获种子，然后种植用于按实验部分的描述进行甜菜胞囊线虫感染的分析。线虫感染后GUS分析表明，只有用pMOG821(tag1)转化的植株在合胞体中表达了报告基因。
这个结果证明处于tag1右边界侧翼的植物序列(以下简称为#25.1)使GUS在合胞体中得以表达。这种表达见于经检测的29株pMOG821品系中的21株中。在部分侧根的维管组织和一些暴露于空气中的植物组织中也有微弱表达。合胞体外的GUS表达在品系与品系之间显示出很大的变化(见图6)。
即使此侧GUS活性一般比在合胞体内要弱得多，也没有一种合胞体阳性品系对取食位点是完全特异的。
发现在甜菜胞囊线虫诱导形成的合胞体中表达GUS的相同品系，用南方根结线虫感染诱导所产生的巨大细胞中也发现有GUS的表达。这说明#25.1序列可以作为一种近似取食位点特异的启动子，用于构建其对南方根结线虫和甜菜胞囊线虫的敏感性降低的植物。
在组织培养阶段，观察到#25.1调节序列作为一种启动子仍然有活性，如果#25.1启动子片段转移至拟南芥，而拟南芥含有在其控制之下的植物细胞破坏基因(如芽孢杆菌RNA酶，见实施例7和8)，这就必须应用中和基因。
实施例6品系pMOG553#25中的启动子tag1-4的序列确定位于tag2-4右侧T-DNA边界侧翼的植物序列已部分确定。tag1的4kb SamI片段已完全测序。该序列显示出该序列的最远端(5’)的0.5kb来源于λ载体，其余3448bp为植物启动子序列。测序是用CsCl纯化的DNA，采用引物步行(walking)策略进行，应用Pharmacia自动测序仪ALF完成的。应用荧光dATP与自动读出测序试剂盒结合。此方法已为Voss等人所描述(1992，分子细胞生物学(Mol.Cell Biol.)，3153-155)。该序列已在SEQ ID NO4描述。
实施例7芽孢杆菌RNA酶前#25.1的克隆从pMT416(Hartley 1988，分子生物学杂志，202913-915)中由PCR扩增包含有芽孢杆菌RNA酶编码区的片段，所用的引物为5’CGGACTCTGGATCCGGAAAGTG 3’和 5’CTGCTCGAGCCTAGGCACAGGTTATCAACACGTTTG 3’。这些引物导入在BamHI和XhoI限制性酶切位点侧翼，利于该片段的克隆。将该片段克隆于胭脂碱终止子序列的上游，终止子序列在含有一个Taq启动子控制下的额外的芽孢杆菌RNA酶抑制剂基因的载体上(在细菌中克服芽孢杆菌RNA酶的毒性所必需)。为消除芽孢杆菌RNA酶表达所产生的毒害作用，在随后克隆步骤中，在芽孢杆菌RNA酶的StyI位点插入了一个ST-LS1内含子。在芽孢杆菌RNA酶的翻译起始密码子处通过重组PCR创建了一个NcoI位点，所用引物为5’CGGACTCTGGATCCGGAAAGTG3’和 5’CTTACTCGAGCCATGGTAAGTTTCTGC3’，从而构建了pOG16.1。然后，芽孢杆菌RNA酶编码区侧翼的BamHI位点通过用BamHI切开pOG16.1而被破坏，用Klenow聚合酶去除悬垂末端并重新连接，形成pFL17。芽孢杆菌RNA酶的5’非翻译序列经进一步修饰与起始品系pMOG553#1164中相应序列的类似，方法是经下列寡核苷酸5’GATCTAGACTCGAGAAGCTTGGATCCCCGGGTAGGTCAGTCCCC 3’与 5’CATGGGGGACTGACCTACCCGGGGATCCAAGCTTCTCGAGTCTA3’的退火，将pOG16.1的BgIII位点与NcoI位点间形成的接头连接起来，形成了克隆pFL18。品系25tag1的4kb启动子作为一个BamHI片段从pMOG821克隆出来，并插于克隆pFL18的单一BamHI位点上，紧邻芽孢杆菌RNA酶编码区的5’端，恢复品系25的初始序列内容至芽孢杆菌RNA酶翻译起始密码子，形成了pFL38。
实施例8rolD-B*的构建pFL11构建体于双元载体中含有一个嵌合芽孢杆菌RNA酶抑制剂基因。该构建体是依下列方法克隆的。芽孢杆菌RNA酶抑制剂编码区位于构建体pMT316(Hartley，1988，分子生物学杂志，202913-915)的HindIII/BamHI片段上。通过该位点的接头5’AGCTCGGATCCG 3’(SEQ ID NO18)自身退火连接而使HindIII位点变为BamHI位点。然后，形成的BamHI片段克隆到pMOG180表达盒中双增强CaMV 35S启动子与nos终止子之间(描述于WO93/10251)，形成了pOG30。应用接头5’GGCTGCTCGAGC3’(SEQ ID NO19)，nos终止子3’端的HindIII位点变成了XhoI位点，应用接头5’AATTGACGAAGCTTCGTC 3’(SEQ ID NO20)，启动子5’端的EcoRI位点变成了HindIII位点。然后用发根农杆菌RoID基因的启动子替代35S启动子。这个启动子作为HindIII/BamHI片段而被从获自F.Leach(Leach和Aoyagi，1991，植物科学(Plant Sci.)，7969-76)的pDO2构建体中切除。包含有启动子和终止子的芽孢杆菌RNA酶抑制剂基因通过HindIII和XhoI的酶解被从所获得的克隆pOG38中切除，插入pMOG800的多位点接头的各自位点，形成了pFL11。
实施例9用pMOG944转化马铃薯植株及其对马铃著白线虫抗性增加的检测双元载体pMOG944转移到根癌农杆菌，所得菌株用于马铃薯栽培品种Kardal块茎小片的转化，如实验部分所述。总共获得了80个转基因品系。这些品系通过小苗切段(每段至少含一个节)进行无性繁殖，体外生根。如实验部分描述，每品系15株进行抗马铃薯白线虫抗性增加检测。预期用含有芽孢杆菌RNA酶/芽孢杆菌RNA酶抑制剂构建体的pMOG944转化马铃著植株，显示出对马铃薯白线虫敏感性降低，因为在线虫取食结构里(或发育过程中)线虫诱导的芽孢杆菌RNA酶表达。
以上实施例仅仅作为本发明的描述，并不意味本发明仅限于此。对于本领域的技术人员来说，很容易进行众多的修改，但这些都落在本发明的范围之内。
序列表(1)一般信息(i)申请人(A)姓名MOGEN International nv(B)街道Einsteinweg 97(C)城市Leiden(D)州Zuid-Holland(E)国家荷兰(F)邮政编码(ZIP)NL-2333 CB(G)电话31-71 5258282(H)传真31-71 5221471(ii)发明名称线虫诱导的调节DNA序列(iii)序列数目8(iv)计算机可读信息(A)介质类型软盘(B)计算机IBM PC兼容机(C)操作系统PC-DOS/MS-DOS(D)软件PatentIn Release#1.0，Version#1.25(EPO)(2)SEQ ID NO1的信息(i)序列特征(A)长度3484个碱基对(B)类型核酸(C)链型双链(D)拓扑类型线性(ii) 分子类型DNA(基因组)(iii)假设非(iii)反义非(vi)初始来源(A)生物拟南芥(B)菌株C24(ix)特征(A)名称/关键词CDS(B)位置3481..3484(D)其它信息/密码子起始＝3482(xi)SEQ ID NO1的序列描述AAGCTAGATC TAGACTCGAG AAGCTTGGAT CCCCGGGTAT ATGAAAGAGA CGACCACTGC60CAGGGACGAA AGTGCAATGC GCATACCTCA GTGGCGTGGA GTGCAGGTAT ACAGATTAAT120CCGGCAGCGT CCGTCGTTGT TGATATTGCT TATGAAGGCT CCGGCAGTGG CGACTGGCGT180ACTGACGGAT TCATCGTTGG GGTCGGTTAT AAATTCTGAT TAGCCAGGTA ACACAGTGTT240ATGACAGCCC GCCGGAACCG GTGCGGTTTT TTGTGGGGTG AATATGCAGT AAAGATTTCA300GGAGTCCTGA AAGACGGCAC AGGAAAACCG GTACAGAACT GCACCATTCA GCTGAAAGCC360AGACGTAACA GCACCACGGT GGTGGTGAAC ACGGTGGGCT CAGAGAATCC GGATGAAGCC420TGCTTTTTTA TACTAAGTTG GCATTATAAA AAAGCATTGC TTATCAATTT GTTGCAACGA480ACAGGTCACT ATCAGTCAAA ATAAAATCAT TATTTGATTT CAATTTTGTC CCACTCCCTG540CCTCTGTCAT CACGATACTG TGATGCCATG GTGTCCGACT TATGCCCGAG AAGATGTTGA600GCAAACTTAT CGCTTATCTG CTTCTCATAG AGTCTGCAGA CAAACTGCGC AACTCGTGAA660AGGTAGGCGG ATCTGGGTCG ACTCTAGGCC TCACTGGCTA ATACGACTCA CTATAGGGAG720CTCGACTTCC CTCAACATAC TCATGTACGT AAGATTCACT CTACATGTTG ACCCATGCAC780GTACCAAGTT CTTCATATAC AAGAATGAGA TTTAAGTGAA CTTCTAGATG AGTTAAAACT840GAATATTACA GAAACAACGA CAGGAGTTTT CTCTCCAAAT CTATGAATTC TCCGAAGAAA900AGATTGAGCT GACATTTGCT ACAGCTTTTT GGTAATTTTG TGGAATTGAC ATGTGATACA960TGAATATATC TATGTAGAGT GAAAGAAAAT TAATGATGGT TAGCATAACT TTTCAGGACA1020TTACTAAATG CTGATAGAGA AAATGATAGA TACGGCCGAG AAGAGTGGAA TCGAAGGAAG1080AATCATTAAC CTTTCCTCTG TGATTCACAG TTGGGTCAAG CCTGATTGTT TCTCCTTCCC1140TAACTTACTC CATCCATTAG GTAATCTACA TTCGTTTCAT TTTTTACGCG TGAAAGTATC1200TAAGAAAAAA GGTATCTCAA AAATATATTT ATCATTAGGT TTATGTAATT AAGTTTAATT1260TGTAATTGTG TTTTGTAATC GTCTAGTAGG TATACGGGAC AAGGGCATAT GCTCAGTCAA1320AGTTGGCCAC AATTTTACAT GCCAAAGCCT TGAGCAAGCA ATTAAAGGTA TATTTCAAAA1380TTAATAATTA CATCTTTCTT TTTTGTTTAA TTTTTTTCAC GTAAACTAAT AATCAGAAAT1440ATTTATCACT GAATGTGCTT ACAGGACAGA AATGCAAACG TGACGATAAA TGCAGTCCAT1500CCAGGAACTG TTAAACTGGA ATTATCAGAG CACACAAGGG TCTTTTTACA GGTAAAACAA1560AACTTTTTTT TCCATACATA TATATAGAAA TGCAAAAGGA ATCTAATAAG TAAGAAAAAA1620AAAATCCTAA AACCATTGAT GTGGTTTTCA ATGATATGCA TATGCAGATT CTCTGCTTTT1680TTGCAATAGC TTCGAAAATG CCTGCTAAAA TCTATAAAAG CCAGGAGGTG TGAATAATAT1740ATAGCCTTAC CTTTTAAGCT CTAAATAGTA CAATAAAGGC CTAACAGTCA TTCTCTTTAG1800CCTGACACTA GATTCCTTTT TGTTTCGTTT TTTGTATCCC AAATCAAGGT TTTGTCATCA1860TCAATATTCA TGCATAGACT CATATACATA CATGCCACTA AGAATCAAAA TTTACGTTGA1920ATGATTGTAC ACTTTAGATG ATTTTAATCG CCTCTTCTTG CAATTTCTGT TTCTTCACTT1980CTTTTAGCTC CTTCTTGCTC TATTTGCTTT CCAAATTCCA TGTTCCACTC CAGATCCCTA2040GAAGTGAGAA ATGCAATGCA AACATGCACC TAAGCCTAAA CATGAATGCA AATGATGAAA2100CTAAAAGAGC GAAGCTAAAA ACCAAACAAA AACACAGATA TCAGCAAACT AGACAAAATA2160ATAAATAGTT TGTTTTTTTT GTTGTTGTTG AAATAGTGGA TATATTTTTG TGTTTCTAAT2220ATTAATTACT ATATCATTTA ATCTTATAAG TTTTTTTGGG TTAATTTAAG TGTAATTTAA2280TATTTCACAT GTAACAAGAA CTCCATTTTA TTCTTGTCCG GTTCTTGAAT AAGATGTGAA2340AGTATTGTAT CAATTGATGA TGATGAATGC ATGTGTGCTA ACCATTTACG TTATCTTTTT2400TTCACGATAA ATAAACGAAA GTTGTTTGGT ATGTGAACAA AGAAATCAAT TTCAAAATTA2460TTTTCAAAAA GTACAATTTC TTCCATTGTT TTCACAATAA GAGAACTAAA GTTATTTGGT2520ATGTGATCTT CTATATATAA AAAAAAAATC CATCGTCGAA ACTAAGATTT TGTTTTTCTA2580TATATCTTTT AAAATGTAAT AAATATTAGG TAATATTATG TTTTTCTATT GTATTTTTTT2640TTTCAATAAC CTTTACTATT TTAAATCTAT CTGCAAATAT TATTTTATTT GAAAGGTAAA2700AAATTTTGGA TTTAGTATTT GTCATATGAT ATCTGATTAT GGTTTTCAGG AGCCGATTAG2760ATGTCACTTT TTAGTCATTG GTTTTAGCTT TCATCAACGC TTTTGAAAAT TGAACTCAAA2820TTATTTTGGC CTAACTTATG TCATTCAACT AAAAGACATT ACAATAACTG TTGTCTAAAG2880ACTAAAGAAA GATCTTAAAT TTAAGAAAGA AGATACTATT TGTCAAAAGA GGACTAAAAT2940GCTAAATTTC AGAAAGAAAA TGAAGGAAGG TGGTGGGAAG TGTGTGTGAT TTAACTTGAT3000ATTGGGAAAA GCACGTAATA ACAACTAAGT TAGGAGAAAA GTAAGCAAAA AAAAAAAAAG3060ATAAACGCGG ACACACACAG CTAACACGCA CATCACATCA CTACAAAGAG GATGCAGTGT3120CATGAATTGC GTTTGCTTCT AAAATCTGTA ACCGATAATC CATCTTGTTT CAGAAAAATA3180AATGTATTCG TTCGCCGGCT TGAATTCGAC GCGATAAGGC CGAGGAAAGA CATCTTGCTA3240GACGCTCTTT GTTTACTATA TAGTCTTAAT TTTGGTGGAG TAGGTCGGTG TGAATAAGGA3300AATATAAAAG CCTATTGGGT CAAGTAAGGC CCAATAATAG ATTACTGTTT ATATAAAATA3360TTACTGTTTA TATAAGATAT TAGACTAAAC TTTAGTCTAA TCAGATTATA ACATTTTTTT3420TATTTTTATC TCACTCTTCT TCCTCTTCCA AAGCTTGGAT CCCCGGGTAG GTCAGTCCCT3480T ATG3484Met1(2)SEQ ID NO2的信息(i)序列特征(A)长度1个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑类型线性(ii)分子类型蛋白质(xi)SEQ ID NO2的序列描述Met1(2)SEQ ID NO3的信息(i)序列特征(A)长度22个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑类型线性(ii)分子类型cDNA(iii)假设非(xi)SEQ ID NO3的序列描述CGGACTCTGG ATCCGGAAAG TG22(2)SEQ ID NO4的信息(i)序列特征(A)长度36个碱基对(B)类型核酸
(C)链型单链(D)拓扑类型线性(ii)分子类型cDNA(iii)假设非(xi)SEQ ID NO4的序列描述CTGCTCGAGC CTAGGCACAG GTTATCAACA CGTTTG36(2)SEQ ID NO5的信息(i)序列特征(A)长度27个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑类型线性(ii)分子类型cDNA(iii)假设非(xi)SEQ ID NO5的序列描述CTTACTCGAG CCATGGTAAG TTTCTGC27(2)SEQ ID NO6的信息(i)序列特征(A)长度44个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑类型线性(ii)分子类型cDNA(iii)假设非(xi)SEQ ID NO6的序列描述GATCTAGACT CGAGAAGCTT GGATCCCCGG GTAGGTCAGT CCCC44(2)SEQ ID NO7的信息(i)序列特征(A)长度44个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑类型线性(ii) 分子类型cDNA(iii)假设非(xi)SEQ ID NO7的序列描述CATGGGGGAC TGACCTACCC GGGGATCCAA GCTTCTCGAG TCTA44(2)SEQ ID NO8的信息(i)序列特征(A)长度12个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑类型线性(ii) 分子类型cDNA(iii)假设非(xi)SEQ ID NO8的序列描述AGCTCGGATC CG1权利要求
1.一种可从拟南芥中获得的DNA片段，当其重新导入植物时，能够提高根结线虫和胞囊线虫所诱导的相关DNA序列，优选地包括在SEQ ID NO1中所示的核苷酸序列的转录。
2.权利要求1的DNA片段的变异体或部分，当其重新导入植物时，能够提高根结线虫和胞囊线虫所诱导的相关DNA序列的转录。
3.权利要求1或2中任一项的DNA片段，其基本上是线虫取食位点特异的。
4.一种嵌合DNA序列，其包括含沿转录方向的权利要求1至3中任一项的DNA片段，和在其转录控制下的待表达的DNA序列，而该DNA片段转录控制下的表达并不是自然发生的，优选地其中待表达的DNA序列的表达引起植物细胞破坏物，优选的为芽孢杆菌RNA酶的产生。
5.权利要求4的嵌合DNA序列，其中所说的细胞破坏物包括互补细胞存活所必需的RNA的RNA。
6.权利要求4的嵌合DNA序列，其中待表达的DNA序列引起对诱导的线虫有毒的物质产生。
7.一种包含权利要求4至6中任一项的嵌合DNA序列的复制子。
8.一种复制子，其包含沿转录方向的权利要求1至3中任一项的DNA片段和至少一个限制性内切核酸酶识别位点，该位点用于在该DNA片段控制下的待表达的DNA序列插入。
9.一种包含权利要求7或8中任一项的复制子的微生物。
10.一种基因组中掺入了权利要求4至6中任一项的嵌合DNA序列的植物细胞。
11.一种基本上由权利要求10的细胞组成的植物根系。
12.一种基本上由权利要求10的细胞组成的植物，优选地是双子叶植物，更优选地是马铃薯植株。
13.一种嫁接于权利要求11的根系上的植物。
14.一种从权利要求12或13的植物的种子、花、块茎、根、叶、果实、花粉和木材中所选出的植物部分。
15.一种基本上由权利要求12至13的植物组成的作物。
16.权利要求1至3中任一项的DNA片段的用途，其用于鉴定能够促进相关DNA序列在植物中转录的亚片段。
17.权利要求4或5的嵌合DNA用于转化植物的用途。
18.权利要求2的DNA片段部分或变异体用于建立杂合调节DNA序列的用途。
全文摘要
本发明提供了一种获自拟南芥的DNA片段,当其重新导入植物后能够促进根结线虫和胞囊线虫诱导的相关DNA的转录,以及所述DNA片段的用途。
文档编号C12N15/31GK1240483SQ97180770
公开日2000年1月5日 申请日期1997年11月18日 优先权日1996年11月18日
发明者S·A·奥尔, F·M·范德利, O·J·M·格迪恩, J·克拉普, P·C·希蒙斯 申请人:莫根国际股份有限公司