专利名称：整合素调节/信号传递的细胞质调节剂的制作方法
技术领域：
本发明总体涉及整合素信号传递途径所包括的蛋白质。更确切地，本发明涉及一个蛋白家族，在本发明中称为整合素调节蛋白(IRPs)，可调节整合素的活性，本发明涉及这一蛋白家族中称为IRP-1和IRP-2的两个成员。
背景技术：
整合素分子是异二聚体表面分子，包括以非共价键形式结合的α和β亚单位。整合素均为跨膜蛋白，其细胞外的区域具有与反受体结合活性。整合素还有相对短的胞浆区，参与跨膜信号传递过程。整合素能与其他结合到细胞上的反受体和细胞外基质成分相互作用，也能与可溶性因子相互作用。细胞外配体的结合导致整合素发生交联和在局部形成簇[Miyamoto，等《科学》1995；267833]以及形成局部粘附，其中整合素胞浆区形成簇状物与细胞骨架成分，包括，例如肌动蛋白纤维相连。[Pavalko and Otey，《社会及实验生物医学进展》205卷，32767页(1994)和Gumbiner《神经元》，11卷，551页(1993)]。大多有关整合素生理活性的研究都集中在鉴定特定的细胞外反受体上，而对整合素与胞浆成分的特定相互作用知之甚少。然而，突变研究已经提示，胞浆成分的序列对于整合素与局部接触物相连是必须的[LaFlamme，等《细胞生物学杂志》117卷，437页(1992)]。
大量的整合素已被鉴定，其中一些亚型是白细胞特有的，每一个亚型成员都具有特定的细胞特异性表达和反受体结合特点。至于白细胞特异性整合素，已知至少有三种β2整合素，每种包含一个特有的α亚单位和一个β2亚单位(命名为CD18)相连[Kishimoto等，《细胞》48卷681-690页，(1987)]。有关β2整合素有一篇详尽的综述，参见Springer，《细胞》76卷301-314(1994)。CD11a/CD18，也被称为αLβ2或LFA-1，在所有白细胞均有表达，并且能与ICAM-1，ICAM-2，ICAM-3结合。CD11b/CD18，也被称为αMβ2或Mac-1，表达于多形核中性粒细胞，单核细胞和嗜酸性粒细胞，并且显示能与ICAM-1，补体因子iC3b，X因子和纤维蛋白原结合。CD11c/CD18，也被称为αXβ2或p150/95，表达于单核细胞，多形核中性粒细胞和嗜酸性粒细胞，并且显示能与补体因子iC3b和纤维蛋白原结合。另外，第四种人β2整合素，称为αdβ2，最近已被鉴定[Van der Vieren等，《免疫》第3卷，第683-690页(1995)]。
与α4亚单位相关的β7整合素亚单位主要表达于白细胞。这种细胞表面的异二聚体识别一种称为粘膜选址素细胞粘附分子(MadCAM)的肠归巢反受体，在淋巴细胞与肠道组织结合过程中似乎发挥核心作用[参见Berlin等，《细胞》74卷185-195页(1993)]。α4β7也显示可与VCAM结合[参见Chan等，《生物与化学杂志》弟267卷，8366-8370页，(1992)]。α4β7除以往所认为的只与选择素表面分子作用外，还以相似的方式参与在流体状态下淋巴细胞贴附于炎性静脉内皮的过程，这种贴附为选择素非依赖性的[Berlin等，《细胞》第80卷413-422页(1995)]。应用针对α4亚单位的免疫特异性抗体进行的动物模型实验提示，α4β7，或α4与β1整合素亚单位相连，可能在多种疾病状态下发挥作用，这些疾病包括，例如，实验性过敏性脑脊髓炎[Yednock等《自然》，356卷，63-66页(1992)；Baron等，《实验医学杂志》第177卷，57-68页(1993)]；接触过敏症[Ferguson和Kupper，《免疫学杂志》第150卷，1172-1182页，(1993)；Chisholm等《欧洲免疫学杂志》第23卷，682-688页(1993)]和非肥胖性糖尿病[Yang等，《美国国家科学院进展》第90卷，10494-10498(1993)；Burkly等《糖尿病》第43卷，529-534页(1994)；Baron等，《临床研究杂志》93卷，1700-1708页(1994)]。
整合素是参与白细胞在机体内转运的主要蛋白类型之一。白细胞在淋巴样器官和其它组织之间进行不断地再循环，它们穿过血管系统的内皮细胞层从淋巴液或血液中到达其下方的组织。炎症及自身免疫性疾病的一个特点即白细胞流入炎性病灶。这些部位的炎症可以用整合素的免疫特异性单克隆抗体阻断或抑制白细胞功能来解决。有关综述，参见Lobb和Hemler，《临床研究杂志》，94卷，1722-1728(1994)。调节整合素的功能是一种可能控制炎症的方法，但对参与整合素调节和信号传递过程的特异性胞浆成分知之甚少。
Liu和Pohajdak，《生物化学和生物物理学报》第1132卷75-58页(1992)报道了一个人cDNA克隆，命名为B2-1，其编码一种与酵母SEC7蛋白、乌贼驱动蛋白、血小板-白细胞C激酶底物蛋白和发动蛋白有区域同源性的蛋白。该文章提出，因为B2-1只有一小部分与酵母SEC7蛋白同源，尚无确凿证据证明它就是这种酵母蛋白的人同源物，也未说明SEC7基序以外的不同。该文章提出，B2-1可能参与了裂解靶细胞过程中NK细胞内高尔基/分泌颗粒的再定向。Schiller和Kolanus[参见，“人Sec7 PH区域对β2整合素介导的与ICAM-1结合的优势负性作用”，第三届德国免疫协会粘附会议，Regensburg，德国，1995年3月14-15日]描述了一种具有相似基序且能与β2整合素胞浆内区域相互作用的蛋白质，并且报道这种蛋白PH域的过度表达导致对Jurkat细胞中β2整合素的激活依赖性亲合力产生较强的优势负性作用。然而，Schiller和Kolanus并未发现(i)优先与整合素相互作用和/或调节其活性的整合素调节蛋白(IRPs)的存在，(ii)整合素调节蛋白(IRPs)当与整合素编码DNA共转染至COS细胞时，调节共转染的整合素从头表达，或(iii)在流体状态下能调节JY细胞贴附和滚动的IRPs。
因此在本领域中有必要鉴定能结合和/或调节整合素结合和/或信号传递活性的分子，并探索鉴定这些分子的方法。这些方法以及由此鉴定的分子将提供实用的方法，用于整合素介导的免疫反应和炎症反应的治疗。
发明概述本发明提供了新的人整合素调节蛋白(IRPs)，这些蛋白是β2和/或β7整合素调节和/或信号传递途径中的胞浆成分。
一方面，本发明提供了编码IRP-1和IRP-2的纯化和分离的多核苷酸(如，脱氧核糖核酸和核糖核酸，其编码链和非编码链)。本发明所考虑的多核苷酸包括基因组DNAs，RNAs和互补DNAs以及全部或部分化学合成的DNAs。本发明优选的多核苷酸包括SEQ ID NO1中列出的IRP-1DNA序列；SEQ ID NO2中列出的IRP-2 DNA序列；和严紧条件下可与其非编码链杂交的DNA序列或与遗传密码的非丰余部分杂交的DNA序列。严紧杂交条件举例如下在5X SSPE，45％甲酰胺中42℃进行杂交，65℃，用0.2XSSC或50℃用1XSSC漂洗。本领域的技术人员知道，根据杂交的序列中GC核苷酸碱基含量及序列长度不同，这些条件需要有所变化。本领域中用一标准公式来决定精确的杂交条件。参见Sambrook等，9.47-9.51，分子克隆，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约(1989)。
本发明提供的DNA序列信息使鉴定分离编码相关分子的DNAs成为可能，DNA的获得采用众所周知的技术，比如DNA/DNA杂交技术已如前述，以及聚合酶链反应(PCR)克隆。另举一例，了解编码IRP的cDNA序列，就可能用DNA/DNA杂交的方法分离出编码IRP的基因组DNA序列和表达调控序列比如，启动子、操纵子及其它元件。用本发明中的DNA序列在严紧条件下进行DNA/DNA杂交同样也可望分离编码IRPs等位变体的DNA、与IRPs同源的非人种属蛋白质的DNA、以及其它在结构上相关蛋白的DNA，这些结构相关蛋白质具有一种或多种与整合素调节蛋白参与的β2和/或β7整合素调节途径中成分或调节剂相互作用的能力。本发明的多核苷酸经可被检测地标记后也用于杂交检测细胞合成IRPs的能力。本发明提供的DNA序列信息还有可能通过同源重组或“敲除”策略[见Capecchi《科学》244卷1288-1292(1989)]产生不能表达功能性的IRPs或表达IRPs变体的啮齿类动物。这些啮齿类作为模型用于研究体内IRPs活性和IRPs调节剂十分有用。本发明中的多核苷酸还可以作为用于鉴定IRP基因座遗传改变的诊断方法的基础，这种改变暗示一种或多种疾病状态。通过本发明还可以由通常表达IRPs的细胞获得调节IRPs表达的反义多核苷酸。
本发明还提供可自主复制的构建物，比如，包含本发明中的多核苷酸的质粒和病毒载体，特别是在其中该多核苷酸功能性地与内源性或异源性的DNA表达控制序列及转录终止子相连接的载体。
根据本发明的另一方面，宿主细胞，特别是单细胞宿主细胞，比如原核细胞和真核细胞均为用本发明的DNAs稳定转化或转染，并使其表达本说明书所指的IRPs。本发明中的宿主细胞在大规模制备IRPs时显著有效。细胞培养于适当的培养基中，从细胞中或从细胞所生长的培养基中可分离出所需的蛋白。
本发明包括具有SEQ ID NO2(IRP-1)和SEQ ID NO4(IRP-2)列出的部分或全部氨基酸序列的IRP多肽产物。期望应用哺乳动物细胞提供翻译后修饰(如，豆蔻酰化、糖基化、截短、Lapidation、及酪氨酸、丝氨酸或苏氨酸磷酸化)，这可能是本发明的重组表达产物达到理想的生物活性所需要的。也提供了融合多肽，其中IRP表达的氨基酸序列与其他来源的多肽氨基酸序列相邻近。与天然多肽相比，本发明的融合多肽其生物学、生化和/或免疫学特性均有所改变。本发明也包括IRPs的多体形式。本发明中的多肽产物可以是全长多肽、片段或变体。变体包括IRP产物，其中一个或多个特异性的(即、正常编码的)氨基酸缺失或被置换，或其中有一个或多个非特异生氨基酸加入，而(1)未失去与β2或/和β7信号传递途径中成分或调节剂相互作用的能力，或(2)失去与β2或/和β7信号传递途径中成分或调节剂相互作用的能力。与IRPs相互作用的蛋白质可用不同的方法进行鉴定。
本发明考虑的第一种鉴别方法是双杂合筛选。双杂合系统是在酵母中建立的[Chien等，美国国立科学院进展，第88卷，9578-9582页(1991)]，其基于激活报告基因的转录因子的体内功能重建。具体而言，可通过以下方法来分离与IRP相互作用的蛋白质的编码多核苷酸用包含报告基因的DNA构建物转化或转染适当的宿主细胞，该报告基因受一个启动子的控制，启动子由具有DNA结合区域和激活区域的转录因子调节；在宿主细胞中表达第一杂合DNA序列，该序列编码的第一融合蛋白包括部分或全部IRP以及转录因子的DNA结合区域或激活区域；在宿主细胞中表达第二杂合DNA序列文库，其编码的第二融合蛋白包括部分或全部推测的IRP结合蛋白以及第一融合蛋白中不存在的转录因子的DNA结合区域或激活区域；通过检测特定的宿主细胞内报告基因产物的量来检测宿主细胞内IRP相互作用蛋白与IRP的结合；从该特定的宿主细胞中分离编码这种相互作用蛋白的第二杂合DNA序列。本发明中该方法优选使用一种驱动LacZ报告基因表达的GAL4上游激活序列，一种包括GAL4 DNA结合区域和GAL4反式激活区域的转录因子以及酵母宿主细胞。
其他用于鉴定与IRPs相互作用的蛋白的方法包括固定IRPs或一种检测蛋白，用非固定结合的配偶体可检测地标记，将结合的配偶体一起孵育并检测结合上的标记物量。结合上的标记物表明检测蛋白与IRPs相互作用。
另一类鉴定IRP相互作用蛋白的方法包括固定IRPs或其片断于荧光物质包被(或浸渗)的固相支持物上，检测蛋白用一种能激发荧光物质的化合物标记，将固定的IRPs与标记的检测蛋白接触，测定荧光物质的光发射，根据检测蛋白引起荧光物质的光发射即可将其鉴定为相互作用蛋白。或者，本方法中推测的相互作用蛋白可以为固定的，而IRPs可以被标记。
本发明还包含了抗体产物和其他结合蛋白(比如那些用上述方法鉴定的蛋白)，这些蛋白都是本发明中的IRP特异性的。本发明的抗体产物包括单克隆、多克隆、抗独特型、和重组的(即人源化的、嵌合的、等)抗体及其片段。本发明包括制备本发明的抗体产物的细胞系(例如，杂交瘤细胞系)。可以用分离的天然或重组IRP多肽产物得到结合蛋白。反过来，结合蛋白可用于纯化重组的或自然产生的IRP多肽产物及鉴定产生这些产物的细胞。用于细胞中或体液中蛋白检测和定量的方法可以包括一种抗体物质或多种抗体物质，并且采取一种“三明治”的检测形式。结合蛋白在调节(即阻断，抑制或刺激)IRP与β2和/或β7整合素信号传递途径中成分相互作用中有明显的作用。
本发明要特别描述的单克隆抗体是由杂交瘤细胞系200A、200B和233G产生的单克隆抗体。这些细胞系1997年4月2日保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC)，12301 Parklawn Drive，Rockville，MD.20852。200A的保藏号为HB-12331，200B为HB-12332，233G为HB-12333。
调节IRPs与其他蛋白或脂质相互作用的化合物鉴定方法可包括用包含报告基因的DNA构建物转化或转染适当的宿主细胞，报告基因处于一个启动子控制之下，启动子由具有DNA结合区域和激活区域的转录因子调节；在宿主细胞内表达第一杂合DNA序列，该序列编码第一融合蛋白，后者包括IRP的部分或全部及转录因子的DNA结合区域或激活区域；在宿主细胞内表达第二杂合DNA序列，该序列编码的融合蛋白包括与IRP相互作用的蛋白的全部或部分及第一融合蛋白中不存在的转录因子的DNA结合区域或DNA激活区域。在检测化合物存在或缺失的情况下，通过检测宿主细胞中报告基因产物的量，来测定特定宿主细胞中相互作用蛋白与IRPs的结合，并以此估计检测化合物对IRP与相互作用蛋白间相互作用的效果；与没有调节化合物的情况下报告基因产物的量相比，检测化合物改变报告基因产物的量，则其可被鉴定为调节化合物。本发明的方法优选使用驱动LacZ报告基因表达的GAL4上游激活序列；包含GAL4 DNA结合区域和GAL4反式激活区域的转录因子和酵母宿主细胞。
鉴定调节IRPs与相互作用蛋白或脂质间相互作用的化合物的另一类方法是固定IRPs或一天然的IRP相互作用蛋白，可检测地标记非固定的结合配偶体，将结合配偶体一起孵育，确定检测化合物对结合上的标记物量的影响，其中，在有检测化合物的情况下所结合的标记物量较没有检测化合物的情况下结合的标记物量减少就提示检测物质是一种IRP与相应蛋白相互作用的抑制剂。相反，有检测化合物的情况下所结合的标记物量较没有检测化合物的情况下结合的标记物量增加提示该推测的调节剂是IRP与相应蛋白相互作用的激活剂。
本发明还考虑了另一种方法鉴定调节IRPs与一种相互作用蛋白或脂类之间相互结合的化合物，包括固定IRPs或其片段于一固相支持物上，后者包被(或浸渗)一种荧光物质，将相互作用蛋白用能激发荧光物质的化合物标记，将固定的IRPs与标记的蛋白在检测化合物存在或不存在的情况下接触，检测荧光物质的光发射，与不存在检测化合物时的光发射相比，影响荧光物质光发射的检测化合物被鉴定为调节化合物。或者，该方法中IRP相互作用蛋白可以被固定，而IRPs可以被标记。
IRPs的调节剂可能影响ARF，PI、β1、β2、β3和/或β7整合素调节和信导传递活性，IRP在细胞上定位和/或IRP与ARF、PI、β1、β2、β3和/或β7整合素信号传递途径中成员的相互作用。采用上述方法，可以从组合文库、肽和肽模拟物、合成化学物质、寡核苷酸以及天然产物文库中筛选调节剂。选择性的调节剂可以包括，例如，特异地与IRPs或IRP核酸结合的多肽或肽；特异性地与IRPs或IRP核酸结合的寡核苷酸，和/或特异性地与IRPs或IRP核酸作用的其他非肽化合物(例如，分离或合成的有机分子)。本发明也提到了影响野生型IRPs细胞定位或结合活性的突变形式的IRPs。用本发明的方法鉴定的ARF、PI、β1、β2、β3或β7/IRP之间相互作用的调节剂可以体内或体外使用在白细胞参与的炎症过程中起作用。另外，与ARF、PI、β1、β2、β3和/或β7整合素或IRPs结合的调节化合物可用于监测生物样品包括体液或活检组织中的ARF、PI、β1、β2、β3和/或β7水平。
IRP调节剂可配制成包含药用载体的组合物。所用剂量应足以调节体内的IRP/β1、β2、β3或β7整合素信号传递或调控过程。
本发明其他优势和方面由以下详述将显而易见。
附图简述
图1显示表达所指多肽的JY细胞结合VCAM-1的能力。
图2显示表达所指多肽的JY细胞结合ICAM-1的能力。
图3显示IRP-1，IRP-2，B2-1和C.elegans的B2-1同源物的氨基酸序列对比。
发明详述本发明用以下实例说明，其中实例1描述了编码IRP-1和IRP-2的cDNA的分离；实例2提供了由上述cDNA编码的IRP-1和IRP-2蛋白的区域结构分析。实例3描述了含有IRP全长cDNA以及编码IRP区域和IRP突变体cDNA的重组表达构建物。实例4显示的检测结果分析了IRPs的重组表达对宿主细胞粘附的影响，包括IRPs对细胞粘附于ICAM-1和VCAM-1的作用、IRPs对细胞表面表达整合素的影响，以及IRP的亚细胞定位。实例5描述了能稳定表达白细胞介素-8受体的稳定转化JY细胞系(JY-8)，及其在检测IRPs对细胞粘附于ICAM-1和VCAM-1中的应用，这里的细胞粘附为白细胞介素-8依赖的并受美洲商陆刺激产生。实例5还描述了编码绿色荧光蛋白(GFP)IRP融合蛋白的表达载体的制备。实例6描述了转染了IRPs的JY细胞在流体状态下的粘附。实例7描述了针对IRPs的单克隆抗体的制备过程及其特性。实例8阐述了IRPs的趋化特性。实例9所描述的实验显示IRPs在不同的人体组织中的分布。实例10描述了与IRPs相互作用的蛋白质的鉴定方法，实例11和12所描述的是鉴定IRP相互作用中调节剂的方法。
实例1用聚合酶链反应(PCR)和DNA/DNA杂交的方法分离了两个人IRP cDNA克隆。
用BLAST程序找到几个cDNA部分序列与B2-1蛋白有相似性。根据ESTs(表达序列标签)H02055，R82669，R43994，H39073，R45477，T07442和T32215设计了共有序列寡核苷酸引物，其序列与代表血小板-白细胞C激酶底物同源区域的5′及3′末端相符合。所设计的5′端(TS3.5)和3′端(TS3.3)引物的序列为
TS3.5 ATATACGCGTACCTTCTTCAACCCGGACC(SEQ ID NO5)TS3.3 ATATGTCGACTCAGGGCTGCTCCTGCTTC(SEQ ID NO6)将引物加入含有人脾cDNA模板2mg质粒cDNA的pcDNA-1Amp(Invitrogen，San Diego，CA)]PCR反应体系中，反应体系为100μl。样品在94℃变性5分钟，然后进行30个循环的PCR扩增94℃1分钟；50℃1分钟；72℃2分钟。约450bp的PCR产物用MluI和SalI酶切。将酶切片段纯化并克隆至pC1-neo载体(Promega，Madison，WI)，该载体中有一编码血凝素标志的序列，其位置在所插入的PCR消化产物的5′端并紧靠该片段。插入片段的序列经证实后，该载体被命名为5′HATS53/pC1#3。
经MluI/SalI酶切的PCR产物标记后作为探针，以在人脾cDNA文库中筛选大于3kb的插入片段。脾文库的构建方法是，将用OligdT为引物所获得的cDNA克隆至pcDNA-1Amp，并筛选约大于7.8kb的载体/插入DNA。将文库载体转化至超感受态细胞XL1 Blue中(StratageneLa Jolla，CA)，并铺至15个150mm2有Hybond N+滤膜的主平板上，使每板上克隆的密度为约20000个。由每个平板得到两个影印物用于杂交。酶切的PCR产物(400ng)用120μCi32PdCTP和dTTP进行标记，标记试剂盒为Boehringer Mannheim随机引物标记试剂盒，操作按厂商说明。未掺入的核苷酸通过Centri-sep柱(Princeton Separations，Adelphia，NJ)除去。将探针加至含(5X SSPE，45％甲酰胺，5XDenhardts，1％SDS)的杂交液中42℃过夜杂交。用0.2X SSC在65℃洗膜并放入暗盒进行曝光。挑取两张膜上均有阳性杂交结果的克隆，经稀释后再铺于有Hybond N+滤膜的LBM平板上。每板菌落再制两张Hybond N+膜，并用第一次筛选时保留的杂交液再次杂交。挑取第二次阳性的克隆，扩增、提取质粒并进行片段的双向测序。
其中一个鉴定的克隆包含一个全长基因，称为克隆S3，其编码的蛋白在本发明中命名为IRP-1。该克隆的核苷酸序列及推测的氨基酸序列在SEQ ID NO1和SEQ ID NO2中列出。该克隆在其起始甲硫氨酸附近有理想的Kozak共有序列，框架的甲硫氨酸的5′端有一终止密码。该克隆大约长1.6kb，具有399个氨基酸的开放阅读框。克隆S3与ESTR82724最为相似，其中469个核苷酸的同源性大于93％。
另一个克隆长约3.4kb，命名为S12，编码一种蛋白，在本发明中称为IRP-2，虽与IRP-1有同源性，但的确为一新基因。IRP-2克隆不是全长基因，因为把IRP-2与IRP-1序列排列在一起作比较时，发现其5′端位于IRP-1编码区内约50个氨基酸。
为获取IRP-2的全长序列，用下述两种IRP-2探针对(上述的)脾脏cDNA文库进行了再次筛选。截短的IRP-2克隆分别用XbaI和XhoI进行酶切。所得的2kb XbaI酶切片段和1kb XhoI酶切片段用上述方法进行标记，仍用Boehringer Mannheim随机引物标记试剂盒。用Centri-sep柱除去未掺入的核苷酸，探针加入上述杂交液与滤膜在42℃过夜杂交。最终洗膜用1XSSC/0.1％SDS在50℃进行。挑取第一次阳性的克隆，稀释，重新铺LBM平板。每板制备两张相同的膜，用第一次杂交后保留的液体进行杂交。挑取两张膜上均呈现阳性的克隆，扩增，提取质粒并对插入片段进行测序。两个克隆，S12-41和S12-47使IRP-2的编码区向5′方向延伸了约50个氨基酸。该克隆的5′端有一个甲硫氨酸，与IRP-1中所见的氨基酸组成一致，并且甲硫氨酸附近结构高度符合Kozak共同序列。对S12-47克隆进行了全长序列测定，IRP-2 DNA的核苷酸序列及推测的氨基酸序列在SEQ ID NO3和SEQ ID NO4中列出。
实例2通过比较IRP-1，IRP-2，B2-1(Liu等，上文)基因及推测的氨基酸序列，发现它们有3个共同区域或基序一个氨基末端驱动蛋白/肌球蛋白区域，一个SEC7区域和一个羧基末端血小板-白细胞C激酶底物同源(PH)区域。驱动蛋白和肌球蛋白是与微管有关的转运蛋白[Navone等，《生物与化学杂志)》第117卷1263-1275页(1992)]。Altschul等在《分子生物学杂志》第215卷，403-410页(1990)描述的酵母蛋白SEC7有2008个氨基酸，能够调节高尔基体分泌糖蛋白。尽管SEC7在酵母中的更确切的功能还未搞清，Arabidopsis中一个SEC7基因突变引起了发育相关的细胞分裂及细胞粘附的改变[Shevell等《(细胞》771051-1062(1994)]。信号传导过程中大量的蛋白质都有PH区域。在一些蛋白中，该区域使其能与G蛋白βγ亚单位，肌醇三磷酸(IP3)或磷脂酰肌醇二磷酸(PIP2)结合。参见Ingley和Hemmings《细胞生化杂志》56卷436-443(1994)。在IRP-1和IRP-2的氨基酸序列中，驱动蛋白/肌球蛋白区域大约从第9氨基酸残基延伸至第60位残基，SEC7区域位于约71至245残基，PH区域从大约260残基延伸到羧基末端。B2-1中，驱动蛋白/肌球蛋白区域、SEC7区域和PH区域分别位于10～61位残基，72～245位残基和266位残基至羧基端左右。IRP与B2-1不同区域氨基酸的一致性列于以下表1。
表1B2-1驱动蛋白/肌球蛋白 SEC7区域 PH区域IRP-1 59％ 88％ 90％IRP-2 34％ 79％ 72％根据这三种蛋白质中驱动蛋白/肌球蛋白、SEC7和PH区域的保守性，IRP-1和IRP-2蛋白似乎能够代表与B2-1相关的人蛋白质家族成员。图3显示IRP-1，IRP-2及B2-1克隆与C.elegans同源物的对比[Wilson等， 《自然》368卷32-38(1994)]。尽管C.elegans蛋白与其它三种人类蛋白一致性百分比不高，也可以很清楚地发现在这四种蛋白中总的区域结构是保守的。
大多数在三种人蛋白与C.elegans蛋白之间保守的残基，在含同源SEC7区域的Arabidopsis蛋白[Shevell等，同上]中也是保守的，并且在酵母SEC7蛋白中更加保守。这就提示这些残基在SEC7区域发挥功能中的重要性。实际上，Shevell等(同上)曾报道，在Arabidopsis克隆(EMB30)中由于突变造成一个保守的残基(相当于图3对比中的第157位)改变，使细胞分裂、延伸和粘附受到影响。
IRP中PH区域的保守残基可能也有重要功能。Tsukada等《美国国立科学院进展)》第91卷11256-11260页(1994)报道，在许多PH区域中保守的精氨酸(相应于图3中的第289位)突变为半胱氨酸，当这种突变发生于小鼠btk酪氨酸激酶的PH区域时，就会导致X染色体连锁的免疫缺陷表型，尽管酶仍然保持全部的btk激酶活性。作者提出，既然推测这一残基在分子的表面，这种氨基酸的替换不大可能造成对结构的影响，而更可能的是干扰了其与其它蛋白的特定相互作用。这一残基在人IRP蛋白与C.elegans蛋白间也相当保守。
最后，当与其它的PH区域比较时，所有三种人蛋白以及C.elegans蛋白在第5和第6亚区域之间另外还有16个至18个残基。如果以Macias等《自然》369卷，675页(1994)提出的三维结构的角度来估计PH区域的话，该区域将会形成一个由区域核伸出的环状结构，可能因此在与其他一种或多种蛋白的相互作用中起重要作用。这16至18个残基在这4种蛋白间呈73％的一致性。
实例3为研究IRP蛋白在整合素发挥功能中的作用，将IRP-1，IRP-2及B2-1或其PH区域与β2整合素亚单位CD11a和CD18一起在COS细胞和JY细胞中表达。IRP和B2-1表达载体的构建如下。用这些载体表达蛋白在实例4中加以描述。
对一经过长度筛选的2.5～4kb Ramos文库进行PCR扩增，克隆了编码人B2-1蛋白的互补DNA。针对编码区5′和3′端的引物根据以前(Liu等，同上)发表的序列设计。设计引物对以便使扩增的序列插入到合适的载体中。B2-1cDNA最初用5′Sc7.Nde和3′Sc7.Xho引物进行扩增并克隆至pET15b载体中(Novagen，Madison，WI)，引物序列为Sc7.Nde ATATCATATGGAGGAGGACGACAGCTAC(SEQ ID NO7)Sc7.Xho ATATCTCGAGTCAGTGTCGCTTCGTGGAG(SEQ ID NO8)该引物对用于在100μl PCR反应体系中扩增。样品在94℃保持5分钟，然后进行30个循环94℃30秒；55℃30秒；72℃1分钟。最终PCR产物经凝胶电泳纯化，用NdeI和XhoI酶切并克隆至pET15b。挑选克隆进行测序，其中Sc7/PET#5和Sc7/pET#6克隆包含一个与发表的B2-1序列一致的序列。
用PCR的方法在B2-1cDNA的5′端加上一个HA标志，然后加有标志的基因被克隆至pC1-neo载体中。上述的3′Sc7.Xho引物在此与5′Sc.7.HAS引物一起应用
Sc7.HAS ATATGCTAGCCACCATGGGGTACCCATACGATGTTCCTGACTATGCGACGCGTATGGAGGAGGACGACAGC(SEQ ID NO9)该引物中下划线的核苷酸编码HA标志。在100μl反应体系中加入上述引物对，Sc7/PET#6 DNA作为模板，按下列条件进行扩增。样品在94℃保持5分钟，然后进行30个循环扩增94℃1分钟；55℃1分钟；72℃2分钟。PCR产物经凝胶电泳纯化、NdeI和XhoI酶解并克隆至预先经过NdeI/XhoI酶解的pC1-neo载体。所得克隆命名为5′HASc7/pC1#29。其插入片段编码一种HA融合蛋白在此称为5′HAB2-1。
用PCR的方法在B2-1 cDNA的3′端加入一个HA标志，带有标志的cDNA随后克隆至pC1-neo。所用引物为Sc7.HA3和T7Sc7.HA3 ATATGTCGACTCACGCATAGTACAGGAACATCGTATGGGTACATACGCGTGTGTCGCTTCGTGGAGGA(SEQ ID NO10)T7 TAATACGACTCACTATAGGG(SEQ ID NO11)采用上述引物，并用SEC7/pC1#9 DNA作为模板，在100μl体系中进行PCR反应。样品在94℃保持5分钟，然后按顺序进行30个循环的扩增94℃1分钟；55℃1分钟；72℃2分钟。PCR产物经凝胶电泳纯化，XhoI和SalI酶解，克隆至预先经过XhoI和SalI酶切的pC1-neo载体。构建物命名为3′HA B2-1PC1#29，其编码的蛋白命名为3′HA B2-1。
B2-1 PH区域用PCR的方法进行亚克隆，所用引物为5′Tsc7.S和3′Sc7.XbaTsc7.5 ATATACGCGTACTTTCTTCAATCCAGACCG(SEQ ID NO12)Sc7.Xba ATATTCTAGATCAGTGTCGCTTCGTGGAG(SEQ ID NO13)使用该引物对，以SEC7/pET#5 DNA为模板，在100λ体系中按下列条件进行PCR扩增。样品在94℃保持5分钟，然后进行30个循环扩增94℃1分钟；50℃1分钟；72℃2分钟。PCR产物经凝胶电泳纯化、MluI和XbaI酶解，并克隆至预先经过MluI/xbaI酶切的5′HApC1-neo载体中(通过用MluI和XbaI酶切5′HA B2-1/pC1#29克隆制备)。该克隆的插入片段编码一种HA融合蛋白，在此命名为5′HA B2-1 PH。
先在IRP-1 cDNA的5′端用PCR的方法加入一Mlu位点，在其3′端加入一SalI位点；然后将其亚克隆至5′HA pC1载体。所用引物为S3.5′HA ATATACGCGTATGGAGGACGGCGTCTATG(SEQ ID NO14)TS3.3(SEQ ID NO6)用上述引物以S3.3 DNA为模板在100μl体系中按下列条件进行PCR反应。样品于94℃保持5分钟、随后进行30个循环94℃45秒；50℃45秒；72℃1分钟。PCR产物经凝胶电泳纯化、MluI和SalI酶解，连接至预先用Mlu和SalI酶切过的5′HA pC1载体。产生的克隆命名为5′HA IRP-1/pC1#15，其编码的蛋白命名为5′HA IRP-1。
克隆5′HA TS3/pC1#3(实例1)被用于表达IRP-1PH区域。
IRP-2最初用PCR的方法克隆至pC1-neo载体时不带有HA标志。PCR所用的引物为S12/SR1 ATATGAATTCCACCATGGACCTGTGCCACCCAG(SEQ ID NO15)TS12.3 ATATGTCGACTCACTGCTTGCTGGCAATC(SEQ ID NO16)用上述引物以克隆5′HAS12/pC1为模板在100μl体系中按下列条件进行30个循环的PCR反应94℃1分钟；50℃1分钟；72℃1分钟。产生的PCR扩增产物经纯化、EcoRI和SalI酶解，连接至预先用相同的限制性内切酶酶切后的pC1-neo载体中。对所得的克隆#11全部测序，发现其与最初的克隆序列一致。
另外，将IRP-2和IRP-2 PH区域用PCR的方法分别克隆至带有5′HA标志的pC1-neo，所用引物为TS12.5(SEQ ID NO17)，TS12.3(SEQ ID NO18)和S12.5(SEQ ID NO19)。
TS12.5 ATATACGCGTACCTTCTTCAATCCAGAC(SEQ ID NO17)ST12.3 ATATGTCGACTCACTGCTTGCTGGCAATC(SEQ ID NO18)S12.5 ATATACGCGTATGGACCTGTGCCACCCAG(SEQ ID NO19)用作扩增反应模板的DNA是克隆S12。样品在94℃保持4分钟，随后进行30个循环的扩增94℃1分钟；52℃2分钟；72℃2分钟。两个PCR扩增反应体系的产物分别用MluI和SalI酶解，纯化，分别连接到预先用MluI和SalI酶切过的pC1-neo HA载体。对克隆pC1-neoIRP-2 PH#5测序，发现它们与所用相应模板的序列一致。
实例4测定了IRPs的过度表达对β2依赖性细胞粘附(通过转染的COS细胞或JY细胞结合至ICAM-1检测)和β7依赖性细胞粘附(通过转染的JY细胞结合至VCAM-1检测)的影响。
COS细胞用编码CD11a/CD18的载体和含有编码5′HA B2-1，3′HAB2-1，5′HA B2-1PH，5′HA IRP-1，5′HA IRP-1PH，5′HA IRP-2，5HAIRP-2 PH其中任一插入片段的载体(实例3)或pC1-neo对照载体进行共转染。转染前24小时将COS细胞按每板(10cm2)1.2×106均匀铺至培养板上。次日制备转染混合物，每板所需的混合物包括5mlDMEM，2μl氯喹(0.25M)，30μl DEAE Dextran(50mg/ml溶于CMF-PBS)及将要转染至细胞的载体每种10μg。当COS细胞达将近80％满底时移去培养基，加入转染混合物，37℃孵育2.5小时。吸除转染混合物，并加入含10％DMSO的DMEM，(室温)保持1分钟。随后吸除DMSO溶液，加入10ml完全培养基。
用不同的抗体证明转染的COS细胞表达IRPs和LFA-1。所有转染细胞CD18检测呈阳性染色。用一种HA标志特异性单克隆抗体150B OR12CA5检测HA表位，IRP转染的细胞均呈阳性染色。
被转染的细胞在转染后48小时和72小时检测其与ICAM-1结合的能力。为制备粘附试验的细胞，吸除培养液，加入5ml维尔烯、3分钟后收集细胞。加入5ml DMEM完全培养基，1000转/分离心5分钟。用DMEM完全培养基重悬细胞并计数。对不同的转染细胞进行下面描述的粘附试验。
事先对96孔板用ICAM-1/Fc或VCAM-1/Fc进行包被，每孔加入pH 9.6，含5μg/ml蛋白的碳酸盐缓冲液50μl，4℃孵育过夜。培养板用150μl/孔的PBS洗两遍，然后每孔内加入以PBS溶解的1％的BSA150μl室温封闭1小时。随后每孔加入100μl粘附缓冲液(含10％胎牛血清的RPMI培养基)以及100μl悬浮于粘附缓冲液的转染JY细胞。转染细胞按下列方法制备。
试验前一天，将转染细胞用含青霉素/链霉素、L-谷氨酰胺、丙酮酸钠和10％胎牛血清的RPMI培养基调至密度为3×105细胞/ml。使细胞倍增，一般需24小时孵育。倍增后，收获细胞并将其重悬于粘附缓冲液中使其密度达1×106细胞/ml。每孔中约加入100μl，相当于1×105个细胞，培养板加盖后室温孵育30分钟。
孵育后，每孔加入溶于CMF-PBS的14％的戊二醛50μl并在室温孵育30分钟以固定细胞。孵育后，用去离子水洗孔三次。最后一次洗涤后吸去水，加入含0.125％结晶紫(用10％乙醇/90％去离子水制备成1％的贮存液，用去离子水稀释成0.125％的浓度并用0.22μm滤膜过滤)的染液50μl，孵育2分钟。孵育后，按上述方法用去离子水洗三次，每孔加200μl乙醇溶液(两份95％乙醇与一份去离子水混合)，孵育1小时，在酶标仪上以570到590nm波长读板。
转染后48小时，与对照转染细胞相比，转染B2-1 PH区域的细胞，其LFA-1依赖性粘附呈中度下降。相对于转染pC1-neo的细胞，转染了IRP-2 PH区域的细胞结合能力显著降低，而转染全长IRP的细胞克隆的粘附无明显改变。转染后72小时，四种转染细胞(3′HA B2-1，5HA B2-1B2-1 PH，IRP-1 PH)的ICAM-1粘附与对照相比降低了50％。
JY细胞本身即表达内生性α4β7和LFA-1。将编码IRP-1，IRP-2，B2-1，IRP-1 PH，IRP-2 PH或B2-1 PH的载体分别转染JY细胞。细胞用电转化的方法按标准程序进行。简而言之，每次转化需将107个细胞离心并放置冰上。细胞用DPBS洗涤然后再离心。用0.5ml DPBS重悬并移至电转槽中，加入30ug DNA(1mg/ml溶于DPBS)于转化混合物中。将转化混合物轻轻混匀、置冰上10分钟。按以下参数使用BioRad GenePulser对细胞进行电转化打开电容扩大开关，设置电压250V、电容至960μf。电转化后，转染混合物置冰上10分钟，然后将细胞置于T25摇瓶，加入5ml RPMI完全培养基。转染后3天，向培养液中加入潮霉素达浓度0.5mg/ml。转染14天后进行粘附试验。
转染IRP的JY细胞也被证实，其与ICAM-1的LFA-1依赖性粘附及VCAM-1的α4β7粘附能力降低。LFA-1和α4水平在不同的转染细胞之间无明显不同，因此不能解释粘附能力的降低。
由此似乎可以证明IRP在调节β2或β7整合素依赖性粘附中具有一定的特异性。JY细胞表达的IRP-1似乎显示优先降低β2依赖性粘附，而IRP-2似乎显示优先下调β7依赖性粘附。B2-1转染细胞已被证实既能降低β2也能降低β7依赖性粘附。表达含有IRP-1，IRP-2或B2-1 PH区域的截短物显示可以普遍降低β2和β7依赖性粘附。参见如下表2，其中“+”表示粘附性增高，“-”表示粘附降低，“NS”表示粘附性无显著变化。
表2宿主细胞JY COS表达的蛋白 β2β7β25′HA IRP-1- NS/+ -5′HA IRP-2NS- NS5′HA B2-1 - NS/+ -5′HA IRP-1 PH - NS/- -5′HA IRP-2 PH - NS/- NS这些结果可能与IRP的氨基末端部分直接或间接地以不同亲合力与β2或β7整合素相互作用而导致优先调节一种或其它类型的整合素相一致。与之相反，PH区域的功能及其相互作用可能是调节不同整合素的途径中共同的信号传递元件。这种元件可以是异三聚体GTP结合蛋白(例如Gαβγ)PIPn。蛋白激酶C(PKC)或一些尚未被鉴定的PH区域配体。推测一种破坏IRP PH区域结合于这种共同信号传递元件的拮抗剂可以广泛调节β2、β7及可能其他的象β1和β3整合素的粘附。与之相反，一种干扰IRPs的氨基末端与整合素相互作用的拮抗剂，推测可能以更加特异的方式参与调节整合素依赖性粘附。
未被最大程度激活以参与整合素依赖性细胞粘附的白细胞和白细胞的细胞系可被象佛波酯PMA这样的PKC激动剂所激活。PKC活性导致细胞粘附的机制还不清楚。PKC对亲合力或亲合性有一定的上调作用，对细胞伸展过程中所需的细胞骨架重新组织也有一定作用。然而，PKC激活对IRP下调整合素依赖性粘附的作用可以说明PKC是否作用于IRP的下游或上游。上述经佛波酯刺激后的JY转染细胞其LFA-1或α4β7依赖性粘附常常不能恢复至对照水平。因此，要么调节性PKC底物作用于IRPs调节的途径上游，要么PKC调节整合素依赖性粘附的其他途径或方面。另外一种可能是，IRPs调节整合素依赖性粘附过程的多个方面，而PKC刺激只影响其中的某一方面。IRPs可能通过影响整合素的亲合性或亲合力(成簇)(实例4)或膜的再循环来调节整合素依赖性粘附。LFA-1水平在表达IRPs的COS细胞降低，但在表达IRPPH区域的COS细胞上不降低，提示其在整合素的再循环起一定作用。
为验证是否IRPs对细胞表面表达整合素有作用，对COS细胞用编码全长IRP-1，IRP-2或B2-1的DNA(或用对照DNA载体pC1-neo或编码14-3-3θ的DNA)其中之一和编码αLβ2、α4β7或ICAM-2其中之一的DNA、进行共转染。用单克隆抗体ICA4.1(针对α4具有免疫特异性)TS1/22(针对αL有免疫特异性)，3S3(针对β1有免疫特异性)，或92C12F(针对ICAM-2具有免疫特异性)对细胞染色观察表面表达情况(荧光密度和阳性细胞百分比)。COS细胞本身即表达β1，故无须转染编码β1的DNA。
下面图3所示的结果提示IRP-1可能通过下调整合素的从头生物合成或除去或置换位于细胞表面的整合素的再循环过程来降低细胞表面表达αLβ2整合素。
表3IRP对细胞表面整合素表达的作用αLβ1α4β1ICAM-2 β1pCI-neo 760 396 317 309 509 36359％*62％ 30％ 74％ 59％ 72％IRP-1533 364 266 405 469 36151％ 66％ 32％ 74％ 59％ 77％IRP-2711 367 294 384 522 35960％ 69％ 38％ 75％ 55％ 76％B2-1 666 375 304 418 489 32959％ 70％ 36％ 72％ 54％ 73％14-3-3θ690 361 336 368 543 38660％ 72％ 43％ 74％ 60％ 75％+平均荧光强度*阳性百分数正如以上讨论过的，一个家族的不同成员对整合素依赖性粘附可能具有相反的作用。这些相反的作用同IRPs与信号传递途径中调节整合素结合(下面讨论)的不同效应物之间相互作用相一致。这些相反的作用过多可以部分解释这些途径中为什么IRPs的过度表达只能造成对IL-8诱导的粘附的部分阻断。另外，IRP-1过度表达而粘附性下降可能是由于IRP-1拮抗了另外的IRP的促粘附活性。B2-1(细胞粘着素-1)的促粘附活性不是JY-8细胞特有的(实例5)，在Jurkat T淋巴样细胞也观察到有过度表达[Kolanus等，《细胞》86卷233-242(1996)]。然而，与JY-8细胞相对照，在Jurkat细胞的表达诱导了αLβ2结合。因此B2-1可以诱导细胞类型特异性的与α4β7或αLβ2的结合。这并不奇怪，因为一种特定的整合素其结合能力依细胞类型不同而异[Chan等《细胞生物学杂志》120卷，第537-543页(1993)，Kassner等《实验医学杂志》178卷649-660页(1993)]。
下一步对与ICAM-1粘附的JY-8转染细胞(实例5)内IRP/GFP融合蛋白的亚细胞定位进行检测。载玻片用溶于50mM碳酸氢盐缓冲液(βH9.6)的ICAM-1/Fc(10μg/ml)在4℃包被18小时，然后用含10％胎牛血清的RPMI培养基洗涤；使表达GFP/IRP融合蛋白的JY-8转染细胞粘附于ICAM-1包被过的载玻片上。
为检定IRP/GFP融合蛋白的亚细胞分布以及鉴定在细胞内定位中哪个区域能发现IRP-1，对JY-8转染细胞进行了荧光共聚焦显微镜观察。IRP-1，IRP-2，B2-1主要分布于靠ICAM-1贴附于玻片的细胞细胞骨架皮层的前缘(参见实例8)。IRP-1的PH区域位于质膜区，Sec7区域在细胞浆内呈更为弥散的分布。表达GFP的转染细胞呈现胞浆内弥漫的荧光。这些结果提出，有助于定位于质膜的PH区域，与其它区域一同发挥作用，使野生型IRPs定位于前缘。
为检测板层体形成过程中IRPs的分布，用定时成像技术分析了靠ICAM-1贴附于玻片的JY-8 IRP-2/GFP转染细胞。选择IRP-2过度表达的JY-8细胞来进行能够对IL-8的应答发生移动的细胞内定位，因为表达IRP-2融合蛋白的转染细胞相对于表达IRP-1或B2-1的转染细胞具有更大的趋化移动性。发现在板层体形成部位及板层体形成之前，IRP-2沿着JY-8细胞的一个边缘浓集。定时成像分析结果表明，伴随着其发育，IRP-2再分布到板层体中。因此IRP-2出现非常早且在片状伪足伸展的过程中一直存在。
IRPs可能有助于整合素在迁移细胞前缘发挥功能。细胞内定位显示依赖于Sec7和PH区域的相互作用，因为当单独表达时，Sec7区域在细胞内弥散分布，而PH区域特异分布于细胞膜。PH区域相互作用可能有助于一种包括IRP和ADP核糖基化因子(ARF)的复合物在胞膜的功能性分布。在该部位，ARF可变为活化状态，因为ARNO(一种蛋白质，在优先权申请提交后才见叙述，可能是IRP-1)GTP交换因子(GEF)活性在磷脂酰肌醇结合至PH区域后被刺激增强[Chardin等，《自然》第384卷481-484页(1996)]。ARFs在膜转运中的作用提示，它们可以介导整合素分布到迁移细胞的前缘，并从该部位离开。这与前缘的极化胞吐作用在细胞运动中起关键作用的见解相一致[Bretscher等，《细胞》87601-606(1996)]。
另外，一种ARF GTP交换的抑制剂，布雷菲尔德菌素A，可抑制伤口愈合模型中成纤维细胞的迁移和板状伪足形成[Bershadsky，等，《美国国立科学院进展》第91卷，5686-5689页(1994)]。有报道B2-1直接与β2的胞质区结合[Kolanus，等，《细胞》86卷233-242(1996)]。因此，IRPs可以将整合素与ras超家族的成员联系起来并使其活化，后者在趋化作用的一个或几个步骤中起作用。
整合素亲合力中的一个角色也被提及。ARF和ras超家族的另外一个成员RhoA协同作用激活磷脂酶D(PLD)[Kuribara等，《生物与化学杂志》270卷，25667-25671(1995)]。PLD可被不同细胞类型的多种激活剂活化并除去磷脂酰胆碱，产生胆碱和磷脂酸[Boman等《生物学化学科学进展》20卷，147-150(1995)]。已经证实，磷脂酸，而非其它不同种类发生不良改变的脂类，可增强纯化的整合素GPllbllla与纤维蛋白原的结合[Smyth等，《生物与化学杂志》第267卷，15568-15577(1992)]。IRPs可以作为信号传递途径中调节因子，改变整合素的膜分布或亲合力。最近，据报道ARNO可诱导GDP/GTP交换，因而活化了ras超家族的一个成员，ARF-1[Chardin等，《自然》，384卷481-488页(1996)]。已知的6个ARF和另外4个ARF样蛋白质其氨基酸有45-60％相同[Boman等《生物学化学科学进展》20卷，147-150(1995)]。ARFs位于高尔基体，小泡和质膜，且发现在膜转运、胞吞、胞吐中起作用[D’Souza-Schorey等，《科学》267卷，1175-1178(1995)]，Peters等《细胞生物学杂志》128卷1003-1017(1995)，Boman等《生物学科学进展》20卷147-150(1995)]。因此IRPs可以调节局部磷脂酸增多，磷脂酸则上调整合素结合，这种结合是直接或间接地通过转变成PKC的激活剂二酰甘油(DAG)引起的。
实例5建立了一个含有N-末端单克隆抗体表位标志并能稳定表达IL-8功能性受体的JY细胞系。这里将该细胞系定名为“JY-8”。为证实其在αLβ2依赖性粘附中的作用，使JY-8细胞系过度表达IRP。JY-8正常即表达一种β2整合素，αLβ2和一种α4整合素，α4β7[Chan等《生物与化学杂志》267卷8366-8370(1992)]。将绿色荧光蛋白(GFP)融合于IRP-1，IRP-2和B2-1野生型序列的氨基末端以产生IRP表达构建物，下一段落描述构建表达构建物的过程。
绿色荧光蛋白(GFP)IRP融合蛋白表达构建物按下面的方法制备。用NheI和BamHI酶切表达载体，pCEP4(Invitrogen，San Diego，CA)。将从pEGFP(Clontech，Palo Alto，CA)上用NheI和BamHI酶切下的编码GFP的DNA片段连接至Nhe1/Bam HI酶切过的pCEP4。所得质粒pCEP4/GFP用于构建IRP融合蛋白表达构建物。
为将IRP DNA片段亚克隆至pCEP4/GFP，用PCR的方法在该片段两端加上XhoI和Hind III限制性酶切位点，以保证随后进行相同框架的连接。
下列引物对用于PCRS3 GFP.Xho.5，ATATCTCGAGCTATGGAGGACGGCGTCTAT，(SEQ ID NO20)和S3.GFP.H3.3，ATATAAGCTTGCGGCCGCTCAGGGCTGCTCCTGCTTC(SEQ ID NO21)用于扩增编码IRP-1 GFP融合蛋白的DNA；S7.GFP.Xho.5，ATATCTCGAGCTATGGAGGAGGACGACAGCTAC，(SEQ ID NO22)和S7.GFP.H3.3，ATATAAGCTTGCGGCCGCTCAGTGTCGCTTCGTGGAGG(SEQ ID NO23)用于扩增编码B2-1 GFP融合蛋白的DNA；S12.GFP.Xho.5，ATATCTCGAGCTATGGACCTGTGCCACCCAG(SEQ ID NO24)和S12.GFP.H3.3，ATATAAGCTTGCGGCCGCTCACTGCTTGCTGGCAATCTTC，(SEQ IDNO25)用于扩增编码IRP-2 GFP融合蛋白的DNA，S3.GFP.5.X，ATATCTCGAGCTATGAGCGAGGTGGAGGGGCTG，(SEQ ID NO26)S3.GFP.5.H3，ATATAAGCTTGCGGCCGCTCAGAAGGTGTGGGTCAGGTC，(SEQ ID NO27)用于扩增编码IRP-1 Sec7区域GFP融合蛋白的DNA；S3.GFP.P.X ATATCTCGAGCTATGACCTTCTTCAACCCGG，(SEQ ID NO28)和S3.GFP.H3.3用于扩增编码IRP-1 PH区域GFP融合蛋白的DNA。
另外，用Muta-Gene Phagemid体外突变试剂盒(Version 2，BioRad，Hercules，CA)以及下列寡核苷酸进行氨基酸置换突变S3.E1.56A，GTCAATTTTCTGGGCCGCTCCGGGTAGGCGAAA(SEQ ID NO29)用于制备E156A；S3.R279A，TGTGAGGATAAACCAGGCCCGCTTCCACGTCTTC(SEQ ID NO30)用于制备R279A。用引物S3.GFP.Xho5和S3.GFP.H3.3对突变的cDNA进行扩增以产生适当的限制性内切酶位点，用于GFP融合蛋白制备。
PCR产物连接至PCEP4/GFP的Xho I和Hind III位点。从大肠杆菌XLI Blue转化子中分离的克隆经测序证实。所有表达载体均设计成编码IRP/GFP融合蛋白，其中GFP位于融合蛋白的氨基端。用电转化法将表达构建物转染至JY-8细胞，并用潮霉素B(0.5mg/ml，Calbiochem，San Diego，CA)进行筛选。
另外，还制备了Sec7或PH区域氨基酸置换的IRP-1 GFP融合蛋白。选择出了第156位谷氨酸被丙氨酸置换的E156A，这是基于一种Arabidopsis蛋白EMB30的Sec7区域的这种突变对细胞粘附的影响而进行的[Shevell等，《细胞》第77卷1051-1062页(1994)]。同样，PH区域的另一置换，R279/A，也是基于BTK PH区域的突变造成X-染色体连锁性无丙种球蛋白血症(XLA)[Yao等，《(美国国立科学院进展》91卷，9175-9179页(1994)]而选择的，这种置换可能在PKC和[Yao等，《美国国立科学院进展》91卷，9175-9179页(1994)]和肌醇1，3，4，5-四磷酸(IP4)结合[Fukuda，等《生物与化学杂志》271卷30303-30306页(1996)中有重要作用。本发明还构建了IRP-1的Sec7区域或PH区域与GFP融合的截短物。
免疫印迹试验发现，所有JY-8转染细胞均表达IRP/GFP融合蛋白，且表达水平相近。为证实融合蛋白的表达，用针对IRP-1，B2-1，IRP PH区域和GFP的特异性抗体对经去污剂裂解的JY-8细胞进行免疫印迹检测。所有GFP融合蛋白在十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳上的迁移率与预测的一致。另外，融合蛋白除与适当的IRP-1，B2-1或PH区域特异性单克隆抗体结合外，也与GFP抗体结合。在JY裂解物上也检测到了内源性IRP-1和B2-1。几项免疫印迹的结果提示，所有七种融合蛋白的表达水平均高于内源性IRP-1和B2-1至少十倍。
整合素依赖性细胞粘附可由不同刺激物所诱导[Diamond和Springer，等《现代生物学观点》第4卷，506-517页(1994)]。已知诱导粘附的刺激物包括G蛋白偶联的趋化因子受体激活剂，比如白细胞介素-8，或PKC激活剂，比如PMA。这些刺激物以增强或稳定整合素依赖性粘附的方式来活化可能调节细胞骨架排列和整合素成簇的信号传递途径。趋化因子及激活剂，如PMA，在体外实验中常规用于增强粘附或确定粘附的最大水平。
测定IRP/GFP融合蛋白与ICAM-1或VCAM-1结合的粘附实验在96孔Easy Wash板(Corning)上进行，应用一种改良的Morla方法[Morla等，《自然》367卷193-196页(1994)]。检测孔用溶于50mM碳酸氢盐缓冲液(pH 9.6)的50μl ICAM-1/Fc(5μg/ml)或VCAM-1/Fc(2μg/ml)包被。一些孔用一种CD18单克隆抗体(122F12C，ICOS公司)包被来进行加入细胞结合或牛血清白蛋白封闭的100％定量，以便检测背景结合量。检测板用溶于PBS的1％的牛血清白蛋白在室温封闭1小时。洗涤后加入含有或不含有PMA(20ng/ml)或IL-8(25ng/ml)的粘附缓冲液(5％胎牛血清，5mM Kcl，150mM NaCl，1mM MgCl2，1mM CaCl220mM HEPES，10mM D-葡萄糖)200μl。然后将(100μl，5×106/ml)JY-8细胞加至每孔，在37℃，5％CO2的条件下孵育5至30分钟。粘附的细胞用加入50μl 10％戊二醛溶液的方法加以固定，并用0.5％结晶紫(SIGMA)溶液染色。洗涤后，加70％乙醇，在570nm处用SPECTRmaxTM250 Microplate SpectrophotometerSystem(Molecular-Devices)测定光吸收对粘附的细胞进行定量。粘附细胞的百分数用下列公式计算
检测了在无任何刺激的静止状态(基础水平结合)下以及在IL-8或PMA刺激状态下JY-8转染细胞与固定的ICAM-1或VCAM-1的粘附。与基础水平结合相比较，只表达GFP的JY-8细胞(对照)在IL-8存在的情况下，与ICAM-1的结合增高3-4倍，与VCAM-1的结合增高2倍。IL-8诱导的与VCAM-1的粘附在5分钟时已很明显，然而，5分钟到30分钟之间基础结合水平的增高使得有刺激和无刺激之间结合的差别降低。随后的实验进行30分钟。PMA处理导致与ICAM-1和VCAM-1的粘附增加4倍以上。过度表达IRP-1的JY-8转染细胞相对于表达相同或更高水平GFP的对照转染细胞，其与ICAM-1的结合降低了40～50％。这种降低在基础水平和IL-8刺激的粘附很明显，而在PMA诱导的粘附不明显。在IL-8刺激的条件下过度表达IRP-1的JY-8转染细胞与VCAM-1的结合降低了约40％，但在基础或PMA刺激的条件下没有降低。这些结果提示，IRP-1优先对趋化因子而非PMA刺激的粘附发挥影响，并且IRP-1过度表达也不导致细胞全部失去粘附能力。
为明确IRP-1不同的区域对粘附的抑制作用，对表达氨基酸置换和缺失突变体的JY-8细胞进行了检测。Sec7和PH区域氨基酸的置换阻断了IRP-1过度表达对粘附的作用。表达IRP-1 Sec7区域突变E156/A和PH区域突变R279/A的转染细胞，结合ICAM-1和VCAM-1的水平相当于表达GFP的JY-8细胞。另外，IRP-1 Sec7或PH区域各自都不能象野生型IRP-1一样降低与ICAM-1或VCAM-1的结合。因此，Sec7和PH区域一起发挥作用，调节IL-8刺激的与ICAM-1和VCAM-1的结合。
除IRP-1之外，也检测了IRP-2和B2-1过度表达对JY-8粘附的影响。与GFP转染细胞相比，过度表达IRP-2的转染细胞与ICAM-1的基础水平结合或与ICAM-1和VCAM-1的IL-8诱导的结合呈现轻微下降，约为20％。相反，过度表达B2-1的转染细胞IL-8刺激诱导的与ICAM-1的结合与对照水平相当，但与VCAM-1的结合增加了大约50％。因此，在IL-8刺激的与VCAM-1的粘附中对B2-1过度表达的作用与对IRP-1，IRP-2的作用恰好相反，并且对α4β7/VCAM-1相互作用是选择性的。
通过IRP的过度表达调节JY-8细胞与ICAM-1和VCAM-1的粘附不能归因于细胞表面αLβ2或α4β7水平的改变。相对于表达GFP的转染细胞，过度表达IRP的不同JY-8转染细胞之间αLβ2或α4β7的表达量差别甚小。过度表达IRP-1 Sec7的JY-8细胞表达α4β7呈中度下降，但这些细胞并未显示与VCAM-1粘附性的下降。
实例6α4β7整合素可以介导流体状态下淋巴细胞与内皮细胞配体VCAM-1和MadCAM-1的贴附及滚动粘附[Berlin等，同上(1995)]。为明确是否IRP表达对α4β7介导的细胞贴附及滚动粘附有影响，定量研究了在流体状态下JY转染细胞结合[Berlin等，同上(1995)]。另外，在测定了静态粘附后又测定流体状态下的结合，以明确IRP表达所引起的α4β7亲合力可能的改变。
用含有全长IRP-1(JYIRP-1)、IRP-2(JYIRP-2)或B2-1(JYB2-1)编码序列或对照载体DNA(JYVEC)对表达内源性α4β7的JY细胞进行转染，并将转染细胞置于包含固定化的VCAM-1/免疫球蛋白(VCAM-1/Ig)嵌合蛋白的环流系统(flow system loop)中[Vonderheide等，《细胞生物学杂志》125卷，215-222(1994)]。初始流动速率为3达因/cm2，维持1分钟。随后的5分钟内，流速降至1.5达因/cm2，在此期间，JYVEC转染细胞呈现贴壁和滚动粘附能力，JYB2-1也呈轻度贴壁及滚动粘附(图2)。转染IRP-1或IRP-2的细胞JYIRP-1和JYIRP-2不贴壁或极少贴附。
随后1分钟，停止流动，在固定的配体存在下对转染细胞进行孵育，这一时间不足以使JYIRP-1/VCAM-1或JYIRP-2/VCAM-1结合。上述静态结合期过后，流速逐渐增高，在4.5分钟之内由1.5达因/cm2调至9达因/cm2。当流速达到3达因/cm2时，JYB2-1和JYVEC的结合都降低(图2)。两种蛋白的结合以相似程度降低说明IRP-3与VEC具有相似的结合亲合力。
实验结果提示，IRP-1和IRP-2的表达阻断了流体状态及短期静态下α4β7与VCAM-1结合的能力。然而，B2-1的表达，似乎只降低贴壁和滚动粘附的效率。
为了明确IRP-1和IRP-2表达对内源性LFA-1与ICAM-1结合的影响，如上所述转染的JY细胞用于相似的试验，不同之处是，ICAM-1作为固定的反受体。除JYB2-1细胞以外，所有的JY转染细胞在流速1.5达因/cm2时发生贴壁和滚动粘附于ICAM-1。然而贴壁效率相对于α4β7/VCAM-1结合有所降低(图3)。1分钟静态结合后，除JYIRP-1细胞外，所有转染细胞与ICAM-1的粘附显著增高，JYIRP-1细胞虽也有增高，但增高程度不大。当静态结合后提高流速时，JYIRP-1，JYB2-1和JYVEC细胞与ICAM-1的结合降低。然而，JYIRP-2表现出对流速升高最能耐受，因为在高达7.5达因/cm2的流速下检测结合。这些结果提示B2-1表达阻断了流体状态下LFA-1与ICAM-1的贴附；IRP-1的表达降低了静止状态LFA-1/ICAM-1结合；IRP-2的表达维持了LFA-1与ICAM-1之间的高亲合性结合。
实例7用在大肠杆菌中表达并纯化的His标记的IRP-1和B2-1免疫小鼠，以制备IRP-1和B2-1特异性单克隆抗体。将IRP-1和B2-1的编码区以符合读框的方式连接到pET15b(Novagen，Madison.WI)中编码组氨酸标志的C末端，所以在大肠杆菌BL211ysS菌株中表达的IRP-1和B2-1蛋白就是氨基端为组氨酸标志的蛋白。按标准程序纯化重组蛋白(Qiagen，Chatsworth，CA)。
杂交瘤按Tjoelker等在《生物与化学杂志》270卷，25481-25487(1995)描述的方法制备。为制备杂交瘤系列200，5只6～12周龄的Balb/c小鼠在第0天采血，然后用大肠杆菌表达的HisB2-167μg与完全福氏佐剂混合进行皮下免疫。第21天，每只小鼠用25μg与不完全福氏佐剂混合的HisB2-1加强免疫一次。第34天采血进行Western印迹检测。经10％还原十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳的100ngHisB2-1蛋白被转至PVDF上，随后剪成小条。印迹在室温用溶于CMF-PBS的3％牛血清白蛋白、0.2％的Tween 20封闭1小时。免疫前和免疫血清以封闭缓冲液1∶500稀释，与小条在室温孵育两小时。小条用溶于CMF-PBS的2％Tween 20洗涤三次，然后与山羊抗小鼠(Fc)-HRP孵育1小时。洗涤4次，然后用Renaissance化学发光试剂(NEN)对小条进行曝光。#2413小鼠在45天时用25μg溶于CMF-PBS的HisB2-1蛋白腹腔内注射进行最后一次加强免疫，4天后取脾。
制备杂交瘤系列233，5只6～12周龄的Balb/c小鼠，每只在第0天取血，用大肠杆菌表达的HisIRP-130μg与完全福氏佐剂混合进行皮下免疫。第22天，每只小鼠用10μgHisIRP-1与不完全福氏佐剂混合加强免疫一次，第45天，每只用5μgHisIRP-1与不完全福氏佐剂混合再加强免疫一次。第55天取血用Western印迹检测抗HisIRP-1和HisIRP-2抗体。#2520小鼠再在133，134两天每天用溶于CMF-PBS的50μgHisIRP-1腹腔注射加强免疫，然后第137天于无菌条件下取脾。
下面描述细胞融合过程。简而言之，将脾脏用两个显微镜载玻片的毛面端进行碾磨，以形成单细胞悬液，碾磨时玻片须浸于加有2mM L-谷氨酰胺、1mM丙酮酸钠、100单位/ml青霉素、100μg/ml链霉素的无血清RPMI 1640(RPMI)(Gibco，Canada)中。细胞悬液用70目的Nitex细胞滤过器(Becton Dickinson，Parsippany，New Jersey)过滤，然后200g离心5分钟洗涤两次，重悬于无血清RPM1中。从3只未经免疫的Balb/c小鼠体内取出的胸腺细胞也按类似的方法制备。
NS-1骨髓瘤细胞用含11％FetalClone血清(FBS)(HycloneLaboratories，Inc.，Logan，Utah)的RPMI培养并使其在融合前3天内保持在对数期，NS-1细胞200g离心5分钟，接上述的方法洗涤两遍。洗涤后，每种细胞悬液都用无血清RPMI培养基调至10ml体积并计数。
按5∶1将脾细胞与NS-1细胞混合，离心，吸去上清。振荡1分钟弹散细胞团，同时加入2ml 37℃的PEG 1500(50％浓度，溶于75mMHepes，pH 8.0)(Boehringer Mannheim)。随后在7分钟的时间内加入14ml无血清RPMI。另加16ml RPMI，细胞在200g离心10分钟。弃去上清液、细胞重悬于200ml含15％FBS，100μM次黄嘌呤钠，0.4μM氨基喋呤，16μM胸腺嘧啶(HAT)(Gibco)，25单位/ml IL-6(Boehringer Mannheim)和1.5×106胸腺细胞/ml的RPMI。将这些细胞悬液分散至10个96孔平底组织培养板(Corning，United Kingdom)中，每孔200μl。在筛选前将板中的细胞更换培养液三至五次，方法是用18G针头(Becton Dickinson)从每孔中吸去约100μl液体，加入与上述成分类似的培养液，所不同的是IL-6浓度为10单位/ml以及不含胸腺细胞。
对融合细胞200上清的筛选最初是对免疫原进行ELISA，以辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG(fc)检测。对出现最高信号的30孔上清再用Western分析法对免疫原进行再检测。根据检测结果，9个孔被选作用于进一步克隆。这9孔被称为200A至200I。
融合细胞233的上清起初是用ELISA法在HisIRP-1和HisB2-1包被的板上检测的。与HisIRP-1而非HisB2-1反应的融合细胞孔选用来进行进一步克隆。
对这些融合细胞用含15％FBS，100μM次黄嘌呤钠、16μM胸腺嘧啶及10单位/mlIL-6的RPMI成功地进行了亚克隆。亚克隆时采用倍比稀释或有限稀释，按每孔0.5～1个细胞将细胞加于96孔板。对亚克隆平板的孔中细胞进行肉眼计数，记录密度最低的孔中克隆数目。对所选孔中的每一克隆，用上述ELISA或Western法进行检测，观察是否有最初融合孔中观察到的反应性。克隆结束，获得了细胞系200A，200B，200F，200H，200G，233E，233G和233K。通过用来源于8个杂交瘤细胞系的抗体与IRP-1，IRP-2和B2-1反应进行Western印迹检测。用Isostrip试剂盒(Boehringer Mannheim)或采用同种型特异性试剂(ZymedLaboratories，South San Francisco，CA)进行ELISA鉴定了来自这8个杂交瘤细胞系的单克隆抗体的同种型。除200G为IgG2a同种位外，其余抗体均为IgG1。
杂交瘤细胞系200A，200B和233G保藏于美国典型培养物保藏中心。
233系列单克隆抗体被进一步用Western印迹筛选杂交瘤上清来检定。简而言之，用GFP/IRP-1，GFP/IRP-2或GFP/B2-1(参见实例5)转染的JY-8细胞用1％CHAPS缓冲液裂解。细胞于冰上裂解30分钟，然后12000转/分离心10分钟。上清中加入样品缓冲液，煮沸样品4分钟。样品经8％Novex凝胶电泳并转至PVDF膜上。该膜用含3％牛血清的蛋白的TST(25mM Tris pH 8.0，150mM NaCl，0.2％Tween-20)封闭1小时。移去封闭液，换为以结合缓冲液(含3％BSA的TST)1∶20稀释的杂交瘤上清液，室温孵育1小时。用TST充分洗膜，然后与一种结合有辣根过氧化物酶的山羊抗小鼠IgG Fc片段(JacksonImmuno Research)在室温孵育30分钟。用TST洗涤后，用Renaissance试剂盒(NEN)进行ECL检测，膜曝光于Hyperfilm(Kodak)。来源于233A，233D，233G，233K和233L的上清都特异性地识别GFP-Irp-1裂解物中而非GFP-IRP-2或GFP-B2-1裂解物中一个适当大小的77 kDa带。使用233G的信号最强。
应用与上述同样的步骤，用Wstern印迹法测试了纯化的200A，200B单克隆抗体从JY-8转染细胞裂解物中检测GFP-IRP融合蛋白的能力。Western印迹检测中，两种单克隆抗体所用浓度均为1μg/ml。单克隆抗体200A能够同样好地识别GFP-Irp-1，GFP-IRP-2和GFP-B2-1，而200B优先识别GFP-B2-1，对GFP-Irp-1识别较弱(小于采用B2-1所见水平的10％)。在另一含表达IRP-1截短物GFP标记的PH区域的JY-8转染细胞裂解物的Western印迹上，200A检测到了一个相当于GFP-IRP-1PH区域截短物的条带，提示200A识别IRP-1，IRP-2和B2-1同源的PH区域中一个共同的表位。
用ELISA法对杂交瘤上清与重组蛋白的特异反应性进行了筛查。另外，特异性通过与含有大肠杆菌表达的IRP-1，IRP-2和B2-1蛋白的Western印迹的反应性来测定。单克隆抗体200A(与IRP-1，IRP-2和B2-1PH区域反应)，233G(与IRP-1反应)及200B(与B2-1反应)被用于检测JY-8 IRP转染细胞中GFP-IRP融合蛋白的表达水平和大小。
为检测JY-8转染细胞整合素表达水平，细胞用标准的间接免疫荧光法，应用针对αLβ2的单克隆抗体TS1/22(ATCC)及针对α4的单克隆抗体IC/A4.1(ICOS Corporation)进行染色。荧光强度用FACS扫描仪通过流式细胞荧光光度术定量。
实例8趋化作用不仅需要初始与底物的粘附和整合素通过在极化细胞上结合和脱离的循环，而且需要整合素从弥漫状态到前缘的循环。为明确IRPs除了作用于静态粘附外，是否也影响整合素的其他功能，用趋化细胞迁移试验检测了IRP在趋化作用中发挥的效应。本试验中，JY-8细胞以整合素和CAM依赖性方式移向有IL-8的部位。
本方法是Schreiner等在《免疫》88卷89-96(1980)所描述的琼脂糖下细胞迁移程序的改良。简单地说，将6孔板(Falcon)用溶于碳酸氢盐缓冲液(pH9.6)的ICAM-1/Fc(25μg/ml)或VCAM-1/Fc(10μg/ml)(ICOS Corporation)进行包被。用溶于含0.5％BSA(Intergen)的RPMI的1％琼脂糖铺板，4℃孵育30分钟。细胞用RPMI洗涤，重悬于含0.5％BSA的RPMI，浓度为5×107/ml。用2.5mm凝胶凿孔器(Pharmacia)在琼脂糖上打孔，立即加入10μl IL-8(2.5μg/ml)(PeproTech)或细胞悬液。培养板于37℃，5％CO2下孵育8小时。加入2％戊二醛固定细胞。移去琼脂糖后，用蒸馏水洗涤孔并待其干燥。细胞移动的定量测定应用视频显微观察工作站，后者包括一个Diaphot显微镜(Nikon，Tokyo Japan)，一个CCD-72视频摄像机，和DSP2000数字处理器(Dage，Michigan City，IN)，及一个MacintoshNIH成像程序(由美国国立卫生研究院设计，可通过匿名文件传输从互联网络zippy-nimh.nih.gov网址获取，或从NationalTechnical Information Service，Springfield，Virginia获取磁盘，编号为PB95-500195GEI)。
上面描述了表达GFP/IRP融合蛋白的JY-8细胞趋化性的测定。IRP-1，IRP-2和B2-1过度表达的JY-8细胞相对于表达GFP的转染细胞，其依赖ICAM-1和VCAM-1的趋化作用降低。表达IRP-1 PH区域氨基酸置换突变体R279/A的转染细胞趋化作用也降低。然而表达R279/A较表达野生型IRP-1降低趋化性的效率低得多。表达IRP-1 PH区域也降低其依赖ICAM-1和VCAM-1的趋化性。这些结果表明，IRP-1PH区域在IRP-1介导的趋化性降低中发挥主要的作用。IRP-1 Sec7区域置换E156A也造成趋化性下降，但较观察到的过度表达野生型IRP-1的趋化性降低程度小。IRP-1 Sec7区域的过度表达引起依赖ICAM-1的趋化性增高，但依赖VCAM-1的趋化性没有变化。这些结果说明，Sec7区域也有助于趋化作用。因此，IRP-1 Sec7和PH区域都在α4β7和αLβ2依赖性趋化性迁移中起作用。
正如上面讨论的，IRP-1过度表达对趋化性的抑制作用通过Sec7(E156/A)和PH(R279/A)区域的置换被降低，提示象对粘附一样，两个区域都参与IRP-1对趋化作用的调节。相对于野生型，表达IRP-1R279/A的JY-8转染细胞趋化性迁移的增强，以及表达IRP-1 PH区域近乎完全阻断迁移，说明PH区域在趋化作用中起主要作用。因此IRP-1 PH区域与磷脂酰肌醇[Harlan等，《生物化学》34卷，9859-9864页，(1995)；Pitcher等，《生物与化学杂志》270卷，11707-11710(1995)]或异三聚体G蛋白βγ亚单位[Nahadeven等，《生物化学》，34卷9111-9117页(1995)，Touhara等《生物与化学杂志》269卷，10217-10220(1994)，Pitcher等《生物与化学杂志》270卷，11707-11710(1995)]之间的相互作用看来是IRPs在趋化作用中发挥作用至关重要的。
实例9用单克隆抗体200B和233G检测了IRPs的组织分布。抗体200B优先识别B2-1，而抗体233G特异性识别IRP-1。
两种单克隆抗体均以10μg/ml浓度用于免疫细胞化学法检测人扁桃体、脾脏和淋巴结的冰冻切片。6微米厚的切片铺在Superfrost Plus玻片(VWR)上存于-70℃。用前将玻片从-70℃取出，置于55℃5分钟。用冰冷的4％对甲醛固定切片两分钟，然后于冷丙酮内放置5分钟，风干。切片在含1％BSA，30％正常人血清和5％正常大鼠血清的溶液中室温封闭30分钟。抗体200B或233G加于切片上室温放置1小时。用TBS缓冲液洗涤玻片三次除去未结合的抗体，每次洗涤5分钟。然后，加入生物素标记的大鼠抗小鼠抗体至TBS缓冲液中的各个切片，室温孵育30分钟。用一种ABC-elite试剂盒(Vector labs)检测第二抗体，加至所有切片上室温保持30分钟。加入DAB底物(Vectorlabs)，浸入水中终止显色。应用1％锇酸作用5-10秒使显色增强。玻片放入水中使显色增强终止。切片用Hematoxylin Gill’s No.2复染，脱水前用水、酸性乙醇、碳酸锂洗涤，最后浸入Permount(VWR)。扁桃体、脾脏和淋巴结中检测到200B和233G染色，但用对照IgG1抗体未见染色。
两种抗体在扁桃体的粉膜上皮上显示很强的标记。看来两种抗体都能标记一群成层排列的鳞状细胞。200B和233G在扁桃体结合的不同在于用233G可见次级滤泡内的标记。用200B未发现这种标记。在脾脏，两种抗体看上去在结合、标记红髓区个别细胞都非常相似。在淋巴结深皮质区发现200B抗体与个别细胞的结合，而在深皮质区和近髓的皮质区发现233G抗体与个别细胞结合。200B的标记方式呈点状，这种标记方式虽也可在用233G时见到，但非常细微。
实例10PH区域存在于70多种功能各异的蛋白中，包括激酶和接头蛋白。据报道PH区域赋予与G蛋白βγ亚单位、PIP2和PKC结合的能力。IRP的SEC7基序也存在于除SEC7基序外相互之间无同源性的其他蛋白中，可能有助于分子内的相互作用。另外，也可以同样推测，IRP的激动蛋白/肌球蛋白氨基末端的同源性可能维持其与其他蛋白间的相互作用。与IRP相互作用的蛋白质可用下述不同的方法加以鉴定。
本发明考虑的第一种鉴别方法是双杂合筛选。双杂合系统是在酵母中建立的[Chien等，美国国立科学院进展，第88卷，9578-9582页(1991)]，其基于激活报告基因的转录因子的体内功能重建。具体而言，可通过以下方法来分离与IRP相互作用的蛋白质的编码多核苷酸用包含报告基因的DNA构建物转化或转染适当的宿主细胞，该报告基因受一个启动子的控制，启动子由具有DNA结合区域和激活区域的转录因子调节；在宿主细胞中表达第一杂合DNA序列，该序列编码的第一融合蛋白包括部分或全部IRP以及转录因子的DNA结合区域或激活区域；在宿主细胞中表达第二杂合DNA序列文库，其编码的第二融合蛋白包括部分或全部推测的IRP结合蛋白以及第一融合蛋白中不存在的转录因子的DNA结合区域或激活区域；通过检测特定的宿主细胞内报告基因产物的量来检测宿主细胞内IRP相互作用蛋白与IRP的结合；从该特定的宿主细胞中分离编码这种相互作用蛋白的第二杂合DNA序列。本方法中优选使用一种驱动LacZ报告基因表达的LexA启动子，一种包含LexA DNA结合区域和GAL4反式激活区域的转录因子以及酵母宿主细胞。
其他用于鉴定与IRPs相互作用的蛋白的方法包括固定IRPs或一种检测蛋白，用非固定结合的配偶体可检测地标记，将结合的配偶体一起孵育并检测结合上的标记物量。结合上的标记物表明检测蛋白与IRPs相互作用。
另一类鉴定IRP相互作用蛋白的方法包括固定IRPs或其片断于荧光物质包被(或浸渗)的固相支持物上，检测蛋白用一种能激发荧光物质的化合物标记，将固定的IRPs与标记的检测蛋白接触，测定荧光物质的光发射，根据检测蛋白引起荧光物质的光发射即可将其鉴定为相互作用蛋白。或者，本方法中推测的相互作用蛋白可以为固定的，而IRPs可以被标记。
实例11本发明考虑到IRP相互作用的调节剂用于降低整合素，特别是β2和/或β7整合素，与细胞或细胞外基质配体间的粘附，导致由整合素参与维持的功能的下调，特别是细胞生长、刺激和炎症过程中的定位。具体而言，考虑到这些调节剂在治疗炎症性疾病或自身免疫性疾病中有治疗价值，它们通过减少细胞，例如中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞或NK细胞向炎症部位的内流和降低已经存在于这些部位的细胞的细胞毒活性发挥作用。调节剂可能既下调整合素依赖性粘附，又拮抗整合素的刺激与共刺激活性。因为整合素的参与具有活化效应并且促进炎症，所以整合素调节蛋白的调节剂可能优于影响整合素与细胞外配体(即，封闭抗体或细胞外配体拮抗剂)结合的化合物。IRP结合的调节剂可以直接或间接地干扰整合素信号传递途径。因为过度表达IRPs的羧基末端PH区域看来不能引起整合素特异性细胞粘附下降，这种特异性可能是与激动蛋白或SEC7同源的氨基末端序列的功能。因此与这些氨基末端序列结合的调节剂可以以整合素特异性方式作用于细胞粘附。鉴定调节IRP与其他蛋白相互作用的化合物的方法如下。
第一种方法包括用包含报告基因的DNA构建物转化或转染适当的宿主细胞，报告基因处于一个启动子控制之下，启动子由具有DNA结合区域和激活区域的转录因子调节；在宿主细胞内表达第一杂合DNA序列，该序列编码第一融合蛋白，后者包括IRP的部分或全部及转录因子的DNA结合区或激活区域；在宿主细胞内表达第二杂合DNA序列，该序列编码的融合蛋白包括与IRP相互作用的蛋白的全部或部分及第一融合蛋白中不存在的转录因子的DNA结合区域或DNA激活区域。在检测化合物存在或缺失的情况下，通过检测宿主细胞中报告基因产物的量，来测定特定宿主细胞中相互作用蛋白与IRPs的结合，并以此估计检测化合物对IRP与相互作用蛋白间相互作用的效果；与没有调节化合物的情况下报告基因产物的量相比，检测化合物改变报告基因产物的量，则其可被鉴定为调节化合物。本发明的方法优选使用驱动LacZ报告基因表达的LexA启动子；包含LexA DNA结合区域和GAL4反式激活区域的转录因子和酵母宿主细胞。
鉴定调节IRPs与相互作用蛋白间相互作用的化合物的另一类方法是固定IRPs或一天然的IRP相互作用蛋白，可检测地标记非固定的结合配偶体，将结合配偶体一起孵育，确定检测化合物对结合上的标记物量的影响，其中，在有检测化合物的情况下所结合的标记物量较没有检测化合物的情况下结合的标记物量减少就提示检测物质是一种IRP与相应蛋白相互作用的抑制剂。相反，有检测化合物的情况下所结合的标记物量较没有检测化合物的情况下结合的标记物量增加提示该推测的调节剂是IRP与相应蛋白相互作用的激活剂。
特别地，IRP蛋白是以组氨酸-标记的或组氨酸-肯普肽-标记的重组蛋白的形式表达，经对pET15b-转化的大肠杆菌裂解物用金属螯合层析树脂纯化。
众所周知的一种放射性标记重组蛋白的方法是将这段肽用一个肯普肽标志对其进行标记。肯普肽标志是一段7个氨基酸的多肽片段，含有一蛋白激酶A(PKA)的磷酸化位点。对肯普肽标记的重组蛋白，就可以通过PKA的作用在肯普肽标志部位进行放射性标记[Mohanraj等，《蛋白表达与纯化》8卷，第2期，175-182页(1996)]。
IRPs(非肯普肽标记的)用游离125I通过Iodobead方法(Pierce)或用改良的乳酸过氧化物酶/过氧化氢法[《抗体，实验室手册)》，冷泉港实验室，Harlow和Lane，第9章，第319-358页(1988)]进行标记。放射性标记的蛋白脱盐并贮存于结合试验缓冲液中，缓冲液为20mMHEPES或20mM pH7.5的磷酸钠缓冲液，含有150mM或300mM的NaCl，加有或不加有0.05％去污剂(NP-40或Triton-X-100)，以及2mM叠氮化合物作为防腐剂。最终特异放射活性在3～10μCi[125I]/nmolIRP之间。
β2整合素的胞浆蛋白尾(C-尾)作为重组His3E9-标记的蛋白在pET15b转化的大肠杆菌或转化的酵母中表达和纯化，或获得未标记的合成肽制剂(Anaspec，Inc.San Jose，CA，Macromolecular Resources，Fort Collins，CO)。
整合素的C-尾溶于pH9.6的碳酸氢盐缓冲液，浓度为1～100μg/ml，向96孔微量滴定ScintistripTM(Wallac)板每孔加入50～100μl上述溶液使整合素的C-尾固定于板上，4℃过夜孵育。使板干燥，每孔加入350μl溶于结合试验缓冲液并过滤除菌的1～2％牛血清白蛋白(BSA)，室温孵育1～2小时。临加入IRPs之前用结合试验缓冲液洗涤板孔3次。
结合试验的形式既可以是一种竞争/抑制结合试验，也可以是一种饱和结合试验。在竞争结合试验中，放射性标记的IRPs用结合试验缓冲液稀释至25～100nM，其中还包含一种可能的结合调节剂(未标记的IRPs，可溶性C-尾或非特异性对照多肽，如BSA)。实验开始，加入100μl标记的IRPs/可能的调节剂溶液至封闭过的ScintistripTM板孔中(50,000-200,000cpm/孔)，然后室温(22-24℃)孵育1小时，用结合试验缓冲液快速洗涤3-5次终止。饱和结合试验按相似的方法进行，不同的是需对0.01-0.30μM的总浓度范围进行检测，其中放射标记的未标记的IRP保持1∶20不变。板干后在已校正的Wallac Model1450液闪计数仪上进行测定。用-ScintistripTM检测板(包含在G11内)对孔间交叉影响进行校正，100μl 25-100nM放射性标记的IRP被孔中包被的抗-IRP单克隆抗体200A所捕获，后者以20μg/ml的碳酸氢盐溶液加至孔中。检测板的孵育时间和条件与上述的结合试验相同。
用C-尾-包被的孔中放射性标记的IRPs计数高于BSA包被的孔中的计数来测定结合。特异性结合以加入未标记的IRP或可溶性C-尾后C-尾包被的孔中的计数来测定。
应用碘标记的IRP-1所进行的竞争结合试验显示，可能的调节剂IRP-1，IRP-1 Sec7区域，B2-1抑制碘标记的IRP-1与固定的His3E9-标记的β2C-尾之间的结合。当IRP-1，IRP-1 Sec7区域，B2-1的浓度在0.001-4μM范围内时，使碘标记的IRP-1与β2C-尾的结合降低75％。加入对照肽(BSA)未能降低IRP-1与固定的β2C-尾间的结合。另外，另一对照未将β2C-尾固定于BSA封闭过的微量滴度板，只显示基础水平的放射性标记的IRP-1结合。
可以改良结合试验，应用其它整合素的IRPs和C-尾，包括但不限于β1，β3和β7。IRPs或C-尾可用[3H]-硼酸氢化钠，[125I]-Botton-Hunter试剂标记，也可以用[35S]代谢标记法，蛋白激酶[32P]-标记法或其它合适的放射性标记交联方法。蛋白和肽可以被固定至微量滴度板(Nunc Covalink，Pierce Reactibind，Costar Labcoat，等)或小珠上(SPA或其它)。也可以由熟练的技术人员调整孵育时间及改良缓冲液条件对结合试验进行改良。另外，试验中所用的多肽可以包括多种合成肽片段，可以用本专业的技术人员知道的多种方法制备这些多肽，其中包括cDNA构建物的表达、从自然物中分离和化学合成。鉴定一种检测化合物是调节剂要通过将检测化合物加至结合试验体系中来完成。正如上述讨论，结合量的增加或降低提示检测化合物是一种IRP调节剂。
被认为有助于鉴定IRP活性的调节剂的其他结合试验包括测定IRPs结合至结合配偶体(ARFs，磷脂酰肌醇或其它相关化合物)的检测方法。这些试验中，IRPs或其配偶体被固定至微量滴度板或小珠上。在适当的条件下检测有无检测化合物时可检测地标记的IRP或其结合配偶体的结合量。IRP活性的调节剂就是能够增强或降低IRP与其结合配偶体结合的化合物。
为测定IRP与磷脂酰肌醇的结合，将His-标记的IRP-1 PH区域(5′HA IRP-1 PH)固定于微量滴度板上，方法是，将100μl浓度为20μg/ml溶于pH 9.6的碳酸氢盐缓冲液的5′HA IRP-1 PH加至板上，4℃孵育约16小时。然后倒掉，用1-2％人IgG于22℃左右封闭1小时。用试验缓冲液(25mM Tris pH 7.4，100μM NaCl，0.25％NP-40，0.1％脱氧胆酸钠，1mM MgCl2，0.5％DTT)洗板3次。向100μl试验缓冲液中加入10纳摩尔的3H-肌醇磷酸(IPn)(Du Pont，NEN)以及0-100微摩尔的冷IPn，22℃孵育2小时。微量滴度板洗涤四次，加入闪烁液。在闪烁计数仪中测定结合的放射活性以检测结合量。结果提示，His-标记的IRP-1 PH区域与肌醇(1，3，4，5)四磷酸和肌醇六磷酸(IP6)的结合高出对照10倍。IRP与肌醇磷酸之间结合的调节剂的检测可以用将检测化合物加至试验体系并检测有无检测化合物的情况下结合量的差别的方法来进行。
本发明还考虑了另一种鉴定能调节IRP与相互作用的蛋白间结合的化合物的方法，包括将IRP或其片段固定在包被(或浸渗)了一种荧光物质的固相支持物上，用能激发荧光物质的化合物标记这种相互作用蛋白，将标记的相互作用蛋白在有或无检测化合物的情况下与固定化的IRP结合，测定荧光物质的光发射，与没有检测化合物的情况下荧光物质的光发射相比，影响荧光物质光发射的检测化合物就可被鉴定为调节化合物。另外，还可以将IRP相互作用蛋白固定，将IRPs标记用于检测。
组合文库、肽及肽模拟物、合成化学物质、寡核苷酸和天然产物文库可用上面提到的方法从中筛选调节剂。
实例12明确确定结合过程中必需的蛋白部分有助于对IRPs相互作用调节剂的鉴定。通过标准突变技术进行氨基酸置换也用于鉴定这些蛋白的结合区域。缺失分析也有助于鉴定结合区域，其中可采用PCR方法产生截短形式的蛋白质，并且这种缺失对蛋白的三级或四级结构的破坏不影响其反受体对其进行识别。
对结合过程中重要蛋白区域的鉴定使我们能够对结合活性的可能调节剂作更为精确和有效的筛选。本发明设想到一种高产量的筛选方法用于分析含小分子或肽的巨大文库，以及针对其中一种或全部两种结合配偶物的免疫特异性抗体的文库，分析其调节β2、β7、β1和/或β3整合素与IRPs之间相互作用的能力以及IRPs与其它一些相互作用蛋白间相互作用的能力。因为本发明中公开的双杂合筛选，闪烁值近似测定(SPA)和免疫学方法[例如酶联免疫吸附法(ELISA)]本身不是HTS方法，故可以进行调整用于检测所列多种化合物调节结合的能力。SPA和ELISA在这种鉴定过程中特别有用，并可对其进行改良以允许对所描述的检测化合物进行高产量的筛选。
尽管本发明已就具体实施方案进行了描述，但应理解，本领域技术人员可以对其进行调整或改进。因而，本发明仅由权利要求书进行限定。
序列表(1)总体信息(i)申请人ICOS公司(ii)发明名称整合素结合/信号传递的细胞质调节剂(iii)序列数目30(iv)联系地址(A)联系人Marshall，O′Toole，Gerstein，Murray & Borun(B)街道233 South Wacker，6300 Sears Tower(C)城市Chicago(D)州Illinois(E)国家U.S.A.
(F)邮政编码60606(v)计算机可读形式(A)介质类型软盘(B)计算机IBM PC兼容(C)操作系统PC-DOS/MS-DOS(D)软件PatentIn Release#1.0，Version#1.30(vi)当前申请资料(A)申请号(B)申请日(C)分类(viii)代理人/代理机构信息(A)姓名Young J.Suh(B)注册号P-41，377(C)参考/摘要号27866/33886(ix)电讯信息(A)电话312-474-6300(B)传真312-474-0448(2)SEQ ID NO1信息(i)序列特征(A)长度1700碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(ix)特征(A)名称/关键词CDS(B)位置238…1482(xi)序列描述SEQ ID NO1TCCTAGATGA TCTCGAGAGG CGCAGTGTGC TCTAAAGGCG AGGGCGGTGA GGACGACAGC 60GCCCACTGTG GATTGGACAG TGTCAAAAAG AGGGGCGGTC CCTACTGAAG GGGCGGTTGG 120GCGACGAAGG GAAGAGTCTT TTCAGCGCTG AGGACTGGCG CTGAGGAGGC GGCGGTGGCT 180CCCGGGGCGT TTGAGCGGGC TCACCCGAGC CCGCGGGCCA ACGCGGATCC AGGCCCGACTGGCGGGACCG CCCCGGATTC CCCGCGGGCC TTCCTAGCCG CC ATG GAG GAC GGC294Met Glu Asp Gly1GTC TAT GAA CCC CCA GAC CTG ACT CCG GAG GAG CGG ATG GAG CTG GAG 342Val Tyr Glu Pro Pro Asp Leu Thr Pro Glu Glu Arg Met Glu Leu Glu5 10 15 20AAC ATC CGG CGG CGG AAG CAG GAG CTG CTG GTG GAG ATT CAG CGC CTG 390Asn Ile Arg Arg Arg Lys Gln Glu Leu Leu Val Glu Ile Gln Arg Leu25 30 35CGG GAG GAG CTC 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(A)长度29碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(xi)序列描述SEQ ID NO8ATATCTCGAG TCAGTGTCGC TTCGTGGAG29(2)SEQ ID NO9信息(i)序列特征(A)长度71碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(xi)序列描述SEQ ID NO9ATATGCTAGC CACCATGGGG TACCCATACG ATGTTCCTGA CTATGCGACG CGTATGGAGG 60AGGACGACAG C71(2)SEQ ID NO10信息(i)序列特征(A)长度68碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(xi)序列描述SEQ ID NO10ATATGTCGAC TCACGCATAG TACAGGAACA TCGTATGGGT ACATACGCGT GTGTCGCTTC 60GTGGAGGA68(2)SEQ ID NO11信息(i)序列特征(A)长度20碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性
(ii)分子类型DNA(xi)序列描述SEQ ID NO11TAATACGACT CACTATAGGG20(2)SEQ ID NO12信息(i)序列特征(A)长度30碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(xi)序列描述SEQ ID NO12ATATACGCGT ACTTTCTTCA ATCCAGACCG 30(2)SEQ ID NO13信息(i)序列特征(A)长度29碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(xi)序列描述SEQ ID NO13ATATTCTAGA TCAGTGTCGC TTCGTGGAG 29(2)SEQ ID NO14信息(i)序列特征(A)长度29碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(xi)序列描述SEQ ID NO14ATATACGCGT ATGGAGGACG GCGTCTATG 29(2)SEQ IDNO15信息(i)序列特征(A)长度33碱基对
(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(xi)序列描述SEQ ID NO15ATATGAATTC CACCATGGAC CTGTGCCACC CAG 33(2)SEQ ID NO16信息(i)序列特征(A)长度29碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(xi)序列描述SEQ ID NO16ATATGTCGAC TCACTGCTTG CTGGCAATC 29(2)SEQ ID NO17信息(i)序列特征(A)长度28碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(xi)序列描述SEQ ID NO17ATATACGCGT ACCTTCTTCA ATCCAGAC 28(2)SEQ IDNO18信息(i)序列特征(A)长度29碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(xi)序列描述SEQ ID NO18ATATGTCGAC TCACTGCTTG CTGGCAATC29(2)SEQ ID NO19信息(i)序列特征(A)长度29碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(xi)序列描述SEQ ID NO19ATATACGCGT ATGGACCTGT GCCACCCAG 29(2)SEQ ID NO20信息(i)序列特征(A)长度30碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其它核酸(A)描述/desc＝“引物”(xi)序列描述SEQ ID NO20ATATCTCGAG CTATGGAGGA CGGCGTCTAT 30(2)SEQ ID NO21信息(i)序列特征(A)长度37碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其它核酸(A)描述/desc＝引物”(xi)序列描述SEQ ID NO21ATATAAGCTT GCGGCCGCTC AGGGCTGCTC CTGCTTC 37(2)SEQ IDNO22信息(i)序列特征(A)长度33碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性
(ii)分子类型其它核酸(A)描述/desc＝“引物”(xi)序列描述SEQ ID NO22ATATCTCGAG CTATGGAGGA GGACGACAGC TAC 33(2)SEQ ID NO23信息(i)序列特征(A)长度38碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其它核酸(A)描述/desc＝“引物”(xi)序列描述SEQ ID NO23ATATAAGCTT GCGGCCGCTC AGTGTCGCTT CGTGGAGG 38(2)SEQ ID NO24信息(i)序列特征(A)长度31碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其它核酸(A)描述/desc＝“引物”(xi)序列描述SEQ ID NO24ATATCTCGAG CTATGGACCT GTGCCACCCA G 31(2)SEQ ID NO25信息(i)序列特征(A)长度40碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其它核酸(A)描述/desc＝“引物”(xi)序列描述SEQ ID NO25ATATAAGCTT GCGGCCGCTC ACTGCTTGCT GGCAATCTTC 40(2)SEQ ID NO26信息(i)序列特征(A)长度33碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其它核酸(A)描述/desc＝“引物”(xi)序列描述SEQ ID NO26ATATCTCGAG CTATGAGCGA GGTGGAGGGG CTG 33(2)SEQ ID NO27信息(i)序列特征(A)长度39碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其它核酸(A)描述/desc＝“引物”(xi)序列描述SEQ ID NO27ATATAAGCTT GCGGCCGCTC AGAAGGTGTG GGTCAGGTC 39(2)SEQ ID NO28信息(i)序列特征(A)长度31碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其它核酸(A)描述/desc＝“引物”(xi)序列描述SEQ ID NO28ATATCTCGAG CTATGACCTT CTTCAACCCG G 31(2)SEQ ID NO29信息(i)序列特征(A)长度33碱基对(B)类型核酸(C)链型单链
(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其它核酸(A)描述/desc＝“引物”(xi)序列描述SEQ ID NO29GTCAATTTTC TGGGCCGCTC CGGGTAGGCG AAA 33(2)SEQ ID NO30信息(i)序列特征(A)长度34碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其它核酸(A)描述/desc＝“引物”(xi)序列描述SEQ ID NO30TGTGAGGATA AACCAGGCCC GCTTCCACGT CTTC3权利要求
1.一种编码SEQ ID NO2中列出的人IRP-1氨基酸序列的纯化和分离的多核苷酸。
2.一种编码SEQ ID NO4中列出的人IRP-2氨基酸序列的纯化和分离的多核苷酸。
3.权利要求1或2的多核苷酸，其为DNA分子。
4.权利要求3的DNA，其选自cDNA、基因组DNA、部分合成DNA和合成DNA。
5.一种包括SEQ ID NO1中列出的人IRP-1多肽编码区序列的DNA分子。
6.一种包括SEQ ID NO3中列出的人IRP-2多肽编码区序列的DNA分子。
7.一种编码IRP多肽的DNA分子，选自a)SEQ ID NO1中列出的人IRP-1 DNA；b)SEQ ID NO3中列出的人IRP-2 DNA；c)在严紧条件下与(a)中蛋白编码区的非编码链杂交的DNA分子；及d)在严紧条件下与(b)中蛋白编码区的非编码链杂交的DNA分子。
8一种包括权利要求1、2或7的DNA的DNA表达构建物。
9.一种以权利要求1、2或7的DNA转化或转染的宿主细胞。
10.一种制备IRP多肽的方法，包括在适当的培养基中培养权利要求9的宿主细胞并由宿主细胞或其生长培养基中分离IRP多肽。
11.一种包括SEQ ID NO2中列出的人IRP-1氨基酸序列的纯化和分离的多肽。
12.一种包括SEQ ID NO4中列出的人IRP-2氨基酸序列的纯化和分离的多肽。
13.一种特异性与IRP-1结合的抗体。
14.一种特异性与IRP-2结合的抗体。
15.权利要求13或14的抗体，其为单克隆抗体。
16.一种抗独特型抗体，其特异性与权利要求13或14的单克隆抗体结合。
17.一种产生权利要求13或14的单克隆抗体的杂交瘤细胞系。
18.杂交瘤细胞系200A(ATCC HB-12331)。
19.一种由权利要求18的杂交瘤细胞系产生的单克隆抗体。
20.杂交瘤细胞系200B(ATCC HB-12332)。
21.一种由权利要求20的杂交瘤细胞系产生的单克隆抗体。
22.杂交瘤细胞系233G(ATCC HB-12333)。
23.一种由权利要求22的杂交瘤细胞系产生的单克隆抗体。
24.一种鉴定调节IRP-1和β整合素亚单位间结合的化合物的方法，包括步骤a)让IRP-1或其片段与β整合素亚单位或其片段接触；b)测定IRP-1或其片段与β整合素亚单位或其片段间结合；c)在存在检测化合物时测定IRP-1或其片段与β整合素亚单位或其片段间结合；d)比较步骤(b)中测量值与步骤(c)中测量值，其中步骤(c)中结合下降表明检测化合物为结合抑制剂，而步骤(c)中结合升高表明检测化合物为结合激活剂。
25.一种鉴定调节IRP-2和β整合素亚单位间结合的化合物的方法，包括步骤a)让IRP-2或其片段与β整合素亚单位或其片段接触；b)测定IRP-2或其片段与β整合素亚单位或其片段间结合；c)在存在检测化合物时测定IRP-2或其片段与β整合素亚单位或其片段间结合；d)比较步骤(b)中测量值与步骤(c)中测量值，其中步骤(c)中结合下降表明检测化合物为结合抑制剂，而步骤(c)中结合升高表明检测化合物为结合激活剂。
26.一种鉴定调节IRP-1和ADP核糖基化因子(ARF)间结合的化合物的方法，包括步骤a)让IRP-1或其片段与ARF或其片段接触；b)测定IRP-1或其片段与ARF或其片段间结合；c)在存在检测化合物时测定IRP-1或其片段与ARF或其片段间结合；d)比较步骤(b)中测量值与步骤(c)中测量值，其中步骤(c)中结合下降表明检测化合物为结合抑制剂，而步骤(c)中结合升高表明检测化合物为结合激活剂。
27.一种鉴定调节IRP-2和ADP核糖基化因子(ARF)间结合的化合物的方法，包括步骤a)让IRP-2或其片段与ARF或其片段接触；b)测定IRP-2或其片段与ARF或其片段间结合；c)在存在检测化合物时测定IRP-2或其片段与ARF或其片段间结合；d)比较步骤(b)中测量值与步骤(c)中测量值，其中步骤(c)中结合下降表明检测化合物为结合抑制剂，而步骤(c)中结合升高表明检测化合物为结合激活剂。
28.一种鉴定调节IRP-1和磷脂酰肌醇(PI)间结合的化合物的方法，包括步骤a)让IRP-1或其片段与PI接触；b)测定IRP-1或其片段与PI间结合；c)在存在检测化合物时测定IRP-1或其片段与PI间结合；d)比较步骤(b)中测量值与步骤(c)中测量值，其中步骤(c)中结合下降表明检测化合物为结合抑制剂，而步骤(c)中结合升高表明检测化合物为结合激活剂。
29.一种鉴定调节IRP-2和磷脂酰肌醇(PI)间结合的化合物的方法，包括步骤a)让IRP-2或其片段与PI接触；b)测定IRP-2或其片段与PI间结合；c)在存在检测化合物时测定IRP-2或其片段与PI间结合；d)比较步骤(b)中测量值与步骤(c)中测量值，其中步骤(c)中结合下降表明检测化合物为结合抑制剂，而步骤(c)中结合升高表明检测化合物为结合激活剂。
30.一种分离编码与IRP-1结合的蛋白的多核苷酸的方法，包括步骤a)以含有一个报告基因的DNA构建物转化或转染适当的宿主细胞，该报告基因处于一个启动子的控制之下，该启动子由具有DNA结合区域和激活区域的转录因子调节；b)在该宿主细胞中表达第一杂合DNA序列，其编码第一融合蛋白，该蛋白包括部分或全部IRP-1及所说转录因子的DNA结合区域或激活区域；c)在该宿主细胞中表达第二杂合DNA序列文库，其中序列编码第二融合蛋白，该蛋白包括部分或全部推定的IRP-1结合蛋白及第一融合蛋白中不存在的所说转录因子的DNA结合区域或激活区域；d)通过测定所说的宿主细胞中报告基因产物的量来测定特定宿主细胞中IRP-1结合蛋白与IRP-1的结合；及e)由所说的特定宿主细胞中分离编码IRP-1结合蛋白的第二杂合DNA序列。
31.一种分离编码与IRP-2结合的蛋白的多核苷酸的方法，包括步骤a)以含有一个报告基因的DNA构建物转化或转染适当的宿主细胞，该报告基因处于一个启动子的控制之下，该启动子由具有DNA结合区域和激活区域的转录因子调节；b)在该宿主细胞中表达第一杂合DNA序列，其编码第一融合蛋白，该蛋白包括部分或全部IRP-2及所说转录因子的DNA结合区域或激活区域；c)在该宿主细胞中表达第二杂合DNA序列文库，其中序列编码第二融合蛋白，该蛋白包括部分或全部推定的IRP-2结合蛋白及第一融合蛋白中不存在的所说转录因子的DNA结合区域或激活区域；d)通过测定所说的宿主细胞中报告基因产物的量来测定特定宿主细胞中IRP-2结合蛋白与IRP-2的结合；及e)由所说的特定宿主细胞中分离编码IRP-2结合蛋白的第二杂合DNA序列。
全文摘要
本发明提供了编码整合素调节蛋白多肽的纯化的和分离的多核苷酸,这些多肽调节β
文档编号C12R1/91GK1195374SQ97190719
公开日1998年10月7日 申请日期1997年4月15日 优先权日1996年4月15日
发明者D·E·斯套顿, B·P·利普斯基 申请人:艾科斯有限公司