表面锚着载体及其用于外源蛋白质的系统的制作方法

专利名称：表面锚着载体及其用于外源蛋白质的系统的制作方法
技术领域：
本发明涉及含冰成核蛋白(INP)基因片段的表面锚着载体，它能将外源蛋白质表达到细胞表面。
且本发明涉及使用INP在细胞表面制备外源蛋白质的方法及以该表面表达系统制备的外源蛋白质的应用。
具体地说，本发明涉及表面锚着载体，在细胞表面制备外源蛋白质的方法及其应用，它使用细胞外膜蛋白，来自丁香假单胞菌，一种革兰氏阴性菌的冰成核蛋白(INP)。
背景技术：
目前，在诸如噬菌体，细菌、酵母等的单细胞生物中研究了蛋白质的表面表达以产生新疫苗，进行各种抗原和抗体的筛选以及将有用的酶定位到细胞表面。
为了稳定地生产疫苗已尝试蛋白质的表面表达首先在细胞表面表达抗原性肽。迄今，为了产生疫苗，将病原菌任意突变并进行筛选以选择能稳定诱导免疫的安全细菌。然而，该筛选方法的缺陷是当疫苗经口服施用进入体和动物体时丧失抗原活性。因此，已进行了许多研究以克服这一缺陷。
首先，已进入的表面表达使用的方法是，采用革兰氏阴性细菌中的细胞表面蛋白的基因片段，将它连接到抗原性多肽的基因上并用于转化合适的细菌宿主以有效地生产融合蛋白质。由该方法制备的融合蛋白质可作为有效的抗原，因为它们稳定地伸出细胞表面。特别是在革兰氏阴性细菌中，外膜脂多糖(LPS)增加了在细胞表面表达的蛋白质的抗原性。
为了在细胞表面表达蛋白质，分泌信号在蛋白质的一级序列内是必须的，它帮助细胞内产生的外源蛋白质穿过细胞膜。特别是在革兰氏阴性细菌中，蛋白质应穿过细胞内膜和周质空间，稳定地定位于细胞外膜上并向外伸出。例如，表面蛋白质，特异性的酶和毒素蛋白质具有将蛋白质定位到细胞表面的分泌信号和靶向信号。实际上，经过使用该分泌信号，靶向信号等与合适的启动子组合能成功地将外源蛋白质表达到细胞表面。
迄今，存在于革兰氏阴性细菌的表面蛋白主要用于生产必需在细胞表面的外源多肽。有4类用于细胞表面表达的蛋白质，如细胞外膜蛋白，脂蛋白，分泌蛋白和细胞表面结构蛋白。作为细胞外膜蛋白，LamB，phoE，OmpA等已用于表面表达。然而，在这些情况下，表达到细胞表面的蛋白质的大小是有限的，因为蛋白质应插入从细胞表面伸出的环内。另外，还因为外源蛋白质的C-和N-端在三维结构上应互相靠近。因此，当两个末端之间的距离较长时，应将C-和N-端连接。
实际上，如果LamB或PhoE用于插入包含超过50-60个氨基酸的外源多肽时，由于结构限制，不能稳定地生产膜蛋白[Charbit等，免疫学杂志，1391658-1664(1987)；Agterberg等，疫苗，885-91(1990)]。为了克服结构限制，使用含有将外源蛋白质定位到细胞外膜的最小靶向序列的部分OmpA蛋白质，尽管完整的OmpA蛋白质也用于将外源蛋白质插入到伸出的环中。使用上面描述的方法，经过与OmpA蛋白质C端靶向序列融合将β-丙酰胺酶表达到细胞表面上。在这种情况下，OmpA片段辅助的蛋白质表达并结合到细胞表面上，与OmpA N末端融合的大肠杆菌脂蛋白LPP的信号序列帮助将该蛋白质定位到细胞外膜上[Francisco等，美国科学院学报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，4892713-2717(1992)]。
因此，使用外膜蛋白的细胞表面表达应在细菌中进行，所使用的方法是将选定的外膜蛋白在基因水平与外源蛋白质融合，该方法用于诱导融合蛋白的生物合成，稳定地穿过内膜并维持外源蛋白质与外膜的结合。因此，上膜蛋白作为表面锚着基序必需满足下述要求。外膜蛋白应当(i)具有分泌信号，融合蛋白能以其穿过细胞内膜，(ii)具有靶向信号，该蛋白质能以其结合于细胞外膜上，(iii)在细胞表面大量表达及(iv)不管蛋白质的大小如何均能稳定表达。然而，尚未形成满足所有这些要求的任何细胞表面锚着基序且仅存在上面的缺陷。
脂蛋白作为一种表面蛋白也已用于表面表达。具体地说，大肠杆菌脂蛋白能因其N端的分泌信号通过细胞内膜且因未端L-半酰氨酸经共价结合能直接定位于外或内膜脂类上。另外，由于主要脂蛋白LPP在N端结合于细胞外膜且在C端结合于细胞层，肽葡聚糖上，与外膜OmpA片段连接的外源蛋白质能稳定地分泌到细胞外膜用于表面表达[Francisco，等，美国科学院学报4892713-2717(1992)]。经过使用脂蛋白的特征，已采用另一脂蛋白TraT将诸如脊髓灰质炎病毒C3抗原决定基等的多肽表达到细胞表面上[Felici等，分子生物学杂志，222301-310(1991)]。另外，尚未确切地了解其功能的肽葡聚糖相关性脂蛋白(PAL)也已用来在细胞表面表达重组抗体[Fuchs等，生物/技术，91369-1372(1991)]。在这种情况下，PAL在C端与肽葡聚糖相连，在N端与重组抗体相连以便在细胞表面表达融合蛋白。
分泌蛋白质，如穿过细胞外膜的表面蛋白质已用于表面表达。然而，在革兰氏阴性细菌中，分泌蛋白质未被很好地开发，仅有一些分泌蛋白质经辅助特异性分泌过程的蛋白质参与穿透细胞外膜。例如，来自克雷白氏杆菌属种类的支链淀粉酶在N端用脂成份取代，结合到细胞外膜上并分泌进细胞培养基中。Kornacker等试图经过使用支链淀粉酶的N端片段在细胞表面表达β-内酰胺酶。不幸的是，支链淀粉酶-β内酰胺酶融合蛋白立即结合到细胞表面并分泌进细胞培养基。另外，以上述方法已尝试使用了碱性磷酸酶，周质空间蛋白。但碱性磷酸酶不能稳定地表达到细胞表面，因为在分泌过程中必需14种以上的蛋白质[Kornacker等，分子微生物学，41101-1109(1990)]。
IgA蛋白酶来自病原微生物奈瑟氏球菌属并具有独特的分泌机制。IgA蛋白酶的C-末端β-片段具有一个信号，N端蛋白酶可以其定位到细胞外膜上。蛋白酶到达细胞外膜在细胞表面伸出后，伸出的蛋白酶经自发水解分泌进细胞培养基。经过使用IgA蛋白酶的β片段，Klauser等也稳定地将12kDa的霍乱毒素B亚基表达在细胞表面上[Klauser等，EMBO J.，91991-1999(1990)]。然而，融合蛋白的分泌受到抑制，因为在分泌过程中在周质空间诱导蛋白质折叠。
另外，存在于细胞表面的其它细胞表面结构，如鞭毛，伞毛，菌毛等可用于表面表达。经过使用鞭毛蛋白，鞭毛的一种结构亚基，分别稳定地表达了霍乱毒素B亚基和来自乙型肝炎病毒的其它肽，且这些肽分别与抗体强烈地结合[Newton等，科学，24470-72(1989)]。经过使用菌毛蛋白，一种在细胞表面象线一样存在的菌毛的结构蛋白，也表达了外源蛋白质。结果，仅成功地表达了小肽[Hedegaard等，基因，85115-124(1989)]。
除了革兰氏阴性细菌的表面蛋白质外，最近已尝试用革兰氏阳性细菌的表面蛋白质在细胞表面表达外源蛋白质[Samuelson等，细菌学杂志，1771470-1476(1995)]。另外，穿过细胞内膜并结合到细胞膜上的表面锚着基序是必需的。实际上来自Straphylo coclushyicus的脂酶分泌信号和来自金黄色葡萄球菌的蛋白A膜结合基质用于将外源蛋白质表达到细胞表面。结果，包含80个氨基酸的疟疾血液阶段抗源和来自链球菌属G蛋白的白蛋白结合蛋白质有效地在革兰氏阳性细菌的细胞表面表达。
在对上面所述的革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌的表面表达中，已形成了一些用于蛋白质表达的有用的系统。在最近3年中，这些系统已在美国欧洲、日本等国申请并作为专利权进行了登记，特别是登记了使用革兰氏阴性细菌的细胞外膜5个申请。另外，使用菌毛，一种细胞表面结构的一个申请和使用一种细胞表面脂蛋白的一个申请已登记。
本发明人研究了冰成核蛋白质(INP)，一种来自丁香假单胞菌KCTC1832的表面蛋白质作为新表面锚着基序并建立了含INP并有效地在细胞表面表达外源蛋白质的新表面锚着载体，在细胞表面制备外源蛋白质的方法及其使用。
本发明概述本发明的目的是利用冰成核蛋白质(INP)的特征提供用于表面表达的表面锚着载体。特别是本发明的载体含有INP在其一级序列中所具有的分泌信号和靶向信号。
而且本发明的目的是提供用于制备外源蛋白质的方法，它使用INP特征的表面锚着载体并将外源蛋白质表达到细胞表面上。
更具体地说，本发明提供了制备外源蛋白质的方法，其中即使不破碎细胞或分离也能方便地利用蛋白质，因为该蛋白质表达到了表面。
另外，本发明可提供表达到细胞表面的外源蛋白质的应用，它包含有效地生产抗体和抗原及生产用于筛选抗原，结合或吸附蛋白质，生理学激活物等的文库。例如表达到细胞表面的果聚糖蔗糖酶可用于有效地生产果聚糖。
所有的含有来自丁香假单胞菌KCTC1832的INP基因的表面锚着载体可在本发明的范围内。
而且本发明的表面锚着载体可应用于所有的细菌宿主。优选该宿主可选自革兰氏阴性细菌，更优选大肠杆菌，醋杆菌属种类，假单胞菌属种类，黄单胞菌属种类，欧文氏杆菌属种类和Xymomonas sp.。
所有使用这些细菌的制备方法可在本发明的范围内。
在具体的实施方案中，构建了pANC3载体(保藏号KCTC0326BP)，其中含有来自丁香假单胞菌KCTC1832的中央重复区缺失的INP基因且由于插入了C-端限制性位点而易于克隆外源基因。
另外，可将所有或一些限制性位点插入INP的C端，且含这些限制性位点的所有表面锚着载体可在本发明的范围内。
在具体实施方案中，构建了pANC3-CM2重组载体，其中含有中央重复区缺失的INP基因且在INP基因的C端连接CMCase基因的N端以融合蛋白的形式将CMCase产生到细胞表面上。
在具体实施方案中，构建了pGINP21M载体(保藏号KCTC0239BP)，其中含有INP基因且由于插入了C端限制性位点而易于克隆外源基因。
而且在具体实施方案中，构建了pASCM1重组载体(保藏号KCTC0237BP)，其中含有INP基因且在INP基因的C端连接羧甲基纤维素酶(CMCase)基因的N端以融合蛋白的形式将CMCase产生到细胞表面上。
另外在具体实施方案中，构建了pASLP1重组载体，其中也含有INP基因且在INP基因C端连接脂酶基因的N端代替CMCase基因以融合蛋白质的形成将脂酶产生到细胞表面。
且在具体实施方案中，构建了pASIg1重组载体，其中也含有INP基因且在INP基因的C-端连接单链Fv抗体基因的N端代替CMCase基因以融合蛋白的形成将单链Fv抗体产生到细胞表面上。
且在具体实施方案中，构建了pSSTS109重组载体，其中也含有INP基因且连接果聚糖蔗糖酶基因以融合蛋白质的形式将果聚糖蔗糖酶产生到细胞表面上。
附图的简要描述

图1显示了pGINP21M载体的限制性图谱，它含有INP基因及在INP基因C端限制性位点。
图2显示了pASCM1重组载体的限制性图谱，它含有CMCase基因且将CMCase表达到细胞表面上。
图3图示说明了从pASCM1重组载体的大肠杆菌转化子表达到细胞表面的CMCase的活性，分别比较了在洗涤的细胞，培养基和破碎的细胞中的活性。
图4以脂裂解程度说明了从pASALP1重组载体的大肠杆菌转化子表达到细胞表面的脂酶的活性。
图5说明了经过进行ELISA方法从pASIg1重组载体的大肠杆菌转化子表达到细胞表面的单链Fv抗体与抗原的结合活性。
图6显示了含有重复区缺失的INP基因的pANC3载体的限制性图谱。
图7说明了从pANC3-CN2重组载体的大肠杆菌转化子表达到细胞表面的CMCase的活性。
图8显示了从pANC3-CM2重组载体的大肠杆菌DH5α转化子的免疫荧光染色。左侧组(A和C)显示了pZL8载体和pSSTS109重组载体的大肠杆菌转化子的光学显微照片，右侧组(B和D)分别显示了上述大肠杆菌转化子的共焦点荧光显微照片。
图9显示了在完整细胞系统中蔗糖向果聚糖的生物转化，其中利用了pSSTS109重组载体的大肠杆菌DH5α转化子。优选实施方案的详细描述冰成核蛋白，一种细胞外膜蛋白在假单胞菌属种类，欧文氏杆菌属种类，黄单胞菌属种类等中发现且具有在过冷的水中诱导冰形成的独特功能。
考虑到来自各种类型的细菌的INP基因的序列，特别是有8个氨基酸单位在INP中央区域是重复的。预期该单位象冰颗粒一样提供排列过冷的水的框架。且特异性氨基酸序列分别存在于INP的N-和C-端。预期该序列是分泌信号和靶向信号，INP可以其通过细胞内膜。特别是INP N端在结合到细胞外膜中发挥作用。
INP由超过1,200个氨基酸组成且其分子量是118kDa。一级氨基酸序列由N端特有的氨基酸(占总蛋白质序列的4％)和中央重复区(占总蛋白质序列的81％)组成。特别是8个氨基酸单位在中央INP区域内精确重复122次。
Green等经过使用在该蛋白质3个不同区域的INP基因突变体研究了INP的生理功能[Gren，等，分子普通遗传学，215165-172(1988)]。结果，鉴定了INP的中央重复单位的长度影响冰成核活性。缺乏重复特征减小或丧失冰成核活性且仅减小中央区域的长度保留冰成核活性。因此，如果不考虑蛋白质的分泌和靶向，预期重复区域将过冷的水分子排列到邻近INP以形成冰颗粒结构。且预期INP的N端在结合到细胞外膜上发挥作用。即使当INP的N端完全裂解，仍保留冰成核活性。然而，预期INP的C端在将INP分泌并靶向到细胞外膜上起作用。由于C端的裂解而完全减小了冰成核活性。
作为表面表达基质，INP具有许多来自其一级氨基酸序列，其结构及其特征的优势。首先，INP大量表达到细胞表面上。其次，表达到细胞表面的INP在细胞生长的静止期保持稳定。第三，INP位于细胞外膜上且暴露于外表面。第四，外源蛋白质和细胞表面间的距离便于调节，因为根据外源蛋白质的大小，INP中央重复单位的长度可变化。第五，由于INP在大范围的革兰氏阴性细菌中是一种稳定表达的酶，革兰氏阴性细菌的各种宿主可用于表面表达。
为了构建含INP基因的表面锚着载体，使用含有所需基因的pGINP21(保藏号KCTC8608P)质粒。在INP C端，切下翻译终止密码子，以聚合酶链式反应(PCR)插入3个新限制性位点，如Bam HI，SmaI和EcoRI，它提供外源蛋白质基因的插入位点。结果，构建了pGINP21M载体(保藏号KCTC0239BP)(见图1)，其中上面提到的任意限制性酶位点对于经基因操作构建释译密码阅读框来插入外源蛋白是可能的。
另外，可构建在INP C-端含全部或一些限制性位点的各种载体。
以上面的方法构建的表面锚着载体含有原始INPDNA序列且表达INP。且当外源蛋白质基因在框架中连接到INP C端时，可表达融合蛋白质且稳定地结合到细胞表面。
对于表面锚着载体的有效性，应鉴定外源蛋白质的合成，穿过细胞内膜并结合到细胞表面。因此，外源蛋白质基因在阅读框中连接到INP基因上，转化进细菌宿主以诱导表达且鉴定融合蛋白质表达到细胞表面上。
经过使用以上述方法构建的pGINP21M载体，构建了pASCM1重组载体(保藏号KCTC0237BP)以便将来自革兰氏阴性细菌，芽孢杆菌属种类的羧甲基纤维素酶(CMCase)表达到细胞表面。羧甲基纤维素酶基因的N-端390bp DNA从含该基因的pUC19载体获得[ParK，等，酶微生物学技术，8(12)725-728(1986)]并插入pGINP21M载体中。然后从不同pUC19载体获得CMCase的C-端DNA片段并插入上述制备的载体中以构建pASCM1重组载体(见图2)。
为了将CMCase酶表达到细胞表面上，用pASCM1重组载体转化大肠杆菌，培养并诱导表面表达。然后，使用羧甲基纤维素酶作底物检测CMCase活性。结果，分别在洗涤的完整大肠杆菌细胞和破碎的大肠杆菌细胞中本发明的酶活性相似。因此，预期总酶活性仅出现在伸出细胞表面的CMCase中。由于羧甲基纤维素分子量太高难以穿透细胞外膜，因此将细胞表面表达的CMCase与溶于底物溶液的羧甲基纤维素接触可出现酶活性。由于细胞培养基不显示CMCase活性，表明CMCase很少从细胞表面分离且限制了酶活性(见图3)。
已构建了含INP的pASLP1重组载体以便将来自革兰氏阴性细菌，假单胞菌属种类的脂酶表达到细胞表面。经过进行pCR从pJH92质粒(Jung Kook Hoon，生物科学部，Ph D Thesis，KIST，1990)获得脂酶基因且与用Bam HI和Eco RI消化的pASCM1重组载体连接以构建产生INP与脂酶的融合蛋白的pASLP1重组载体。
为了将脂酶表达到细胞表面，用pASLP1重组载体转化大肠杆菌，培养并诱导表面表达。然后，以醋酸铜方法测量脂酶活性。与缺乏脂酶的宿主细胞相比，在将脂酶表达到细胞表面的转化大肠杆菌中出现更高的脂酶活性。因此，将脂酶表达到细胞表面的宿主细胞可直接用于双相脂水解(见图4)。
已构建含INP基因的pASIg1重组载体以表达单链Fv抗体。从能在大肠杆菌中以分泌蛋白生产抗体的pLUV2质粒获得单链Fv抗体基因并以上述方法插入以构建pASIg1重组载体。
为了将单链Fv抗体表达到细胞表面，转化大肠杆菌，培养并诱导表面表达。然后，以测量抗原与表面表达的抗体的结合程度的ELISA(酶联免疫吸附)法鉴定单链Fv抗体的表面表达。
已构建了含INP基因的pSSTS109重组载体(保藏号KCTC0327 BP)以表达果聚糖蔗糖酶。用pZL8载体进行PCR获得果聚糖蔗糖酶基因，亚克隆进pT7 Blue(R)载体，然后插入本发明的pGINP21M载体中。
为了将果聚糖蔗糖酶表达到细胞表面上，转化大肠杆菌，培养并诱导表面表达。经过进行免疫荧光染色获得果聚糖蔗糖酶的表面表达(见图8)。
另外，表达到细胞表面的果聚糖蔗糖酶可用于从蔗糖方便且有效地生产果聚糖(见图9)。
为了构建含重复区缺失的INP基因的表面锚着载体，已诱变了INP基因以缺失中央重复区。
将编码INP N端特异性区域，前2个重复亚基，最后3个重复亚基和C端特异性区域的基因片段精确克隆到pKK223-3质粒载体tac启动子下游。结果，构建了pANC3载体(保藏号KCTC0326BP)(见图6)。
经过使用以上述方法构建的pANC3载体，已构建了pANC3-CM2重组载体以表达CMCase到细胞表面上。以上述方法测量CMCase活性(见图7)。
如上所述，本发明的表面表达系统有效地生产有用的酶和抗体。上面表达的外源蛋白质作为例子说明了使用INP的表面表达，但不是为了限制本发明。以本发明的细胞表面表达系统可将任何外源蛋白质表达到细胞表面上。
下面的实施例将进一步说明本发明，而不限制本发明。
实施例<实施例1>用于表面表达的pGINP21M载体的构建为了构建含INP基因的表面锚着载体，使用含克隆的INP基因的pGINP21质粒(7.1kb)(保藏机构韩国生物科学和生物技术研究所；保藏号KCTC86089，保藏日期1994年7月13日)。为了提供外源蛋白质基因的插入位点，经PCR反应插入3个新的限制性位点。结果，以PCR机器扩增了从Kpn位点到INP基因C末端的大约1.7kb的片段。
使用SEQ.ID.No.1和SEQ.ID.No.2引物。合成SEQ.ID.No.1引物以插入KpnI限制性位点，合成SEQ.ID.No.2引物以依次插入诸如Bam HI，Sma I和Eco RI的3个限制性位点。插入的限制性位点有利于基因扩增后亚克隆INP基因。以PCR机器扩增的基因片段用限制性酶Kpn I和Eco RI消化，并插入已用Kpn I和EcoRI消化的pGINP21载体中。结果，构建了pGINP21M载体(见图1)，其中插入了新限制性位点代替INP基因的翻译终止密码子。pGINP21M载体的大小是7.1kb。用本发明的pGINP21M载体转化大肠杆菌，转化的大肠杆菌于1997年3月28日保藏于KRIBB，KIST(保藏号KCTC0239BP)。
<实施例2>pASCM1重组载体的构建构建pASCM1重组载体，它使用INP并可在细胞表面表达CMCase。
为了将CMCase基因插入pGINP21M载体用于表面表达，用BamHI和EcoRI消化该载体，也用BamHI和EcoRI消化含CMCaseN端390bp DNA的PVLC19通用克隆载体。上面制备的2个DNA片段与DNA连接酶连接以构建pGINP21CM1质粒。然后，经过用Eco RI消化从另一PVLC19载体的Eco RI位点获得CMCase的C端DNA片段并插入含CMCase N-端的pGINP21CM1质粒的EcoR1位点。结果，将完整的CMCase基因连接到INP基因的C端。上面制备的pASCM1重组载体在图2中显示。用本发明的pASCM1重组载体转化大肠杆菌，转化的大肠杆菌于1997年3月22日保藏于KRIBB，KIST(保藏号KCTC0237BP)。
<实施例3>CMCase的表面表达用pASCM1重组载体经大肠杆菌，在含100ml LB培养基和抗生素，100mg/L氨苄青霉素的500ml烧瓶中培养并诱导表面表达。
然后，使用羧甲基纤维素作底物经DNS方法测量CMCase活性。具体地说，1％(W/V)羧甲基纤维素溶于50mM柠檬酸缓冲液中以制备底物溶液。加入0.5ml该底物溶液与0.5ml酶溶液充分混合并在双层热水贮槽中60℃加温30分钟进行反应。然后，加入3ml DNS溶液，它经过将7.5g 2，5-二硝基水杨酸，14.0g NaOH，216.1gRochel盐，5，4g苯酚和5.9g Na2S2O5依次溶于1L纯水中制备。底物溶液与DNS溶液在沸水中反应5分钟，然后在冰水中冷却。使用室温的冷却溶液测550nm的吸光率。经过与葡萄糖的标准曲线比较计算释放的还原糖量。1单位的酶表示1分钟释放1μM葡萄糖的酶量。
结果，当洗涤后的完整大肠杆菌细胞和破碎的大肠杆菌细胞用作酶来源时，两种情况的酶活性相似。
<实施例4>重组载体pASLP1的构建构建pASLP1重组载体，它使用INP并能在细胞表面表达脂酶。
用Bam HI和Eco RI消化实施例2中制备的PASCM1重组载体，去掉CMCase基团以制备表面的pJH92质粒并经PCR技术操作以插入Bam HI和Eco RI限制性位点。因此，经过用Bam HI和Eco RI消化该pJH92载体可获得脂酶基因并连接进上面制备的表面锚着载体上。结果，构建了pASLP1重组载体，它能以融合蛋白质的形式表达INP和脂酶。
<实施例5>脂酶的表面表达以氯化钙方法用pASLP1重组载体转化大肠杆菌，以实施例3所述的相同方法培养并诱导表面表达。然后，以下面所述的醋酸铜方法测量表达到细胞表面上的脂酶活性。5ml大肠杆菌培养液与溶于5ml异辛烷的5％的橄榄油底物混合并在40℃反应1小时。然后，悬浮溶液和油相，用1ml醋酸铜试剂处理3ml悬浮溶液并剧烈摇动。然后，测量反应混合物在715nm下的吸光率。此时，预期吸光率越高，酶活性越高，因为降解了更多的油产生酸性酯。结果，测量的表达到细胞表面的脂酶活性在图4中表示。
<实施例6>pASIg1重组载体的构建构建pASIg1重组载体，它使用了INP并能将人类化的单键Fv抗体表达到细胞表面。为了制备脂酶基因，用Sal I和Eco RI消化含单链Fv抗体基因且能作为分泌蛋白产生该抗体的pLUV2质粒并连接到一个合成寡核苷酸上以加入一个新的Bg1 II限制性位点代替Sal I位点。用Eco RI和Bam HI消化实施例2制备的pASCM1重组载体以去掉用于表面表达的CMCase基因并连接到用Bgl II和Eco RI消化的单链抗体基因上。结果，构建了pASIG1重组载体，它能以融合蛋白的形式表达INP和单链Fv抗体。
<实施例7>单链Fv抗体的表面表达。
用pASIg1重组载体转化大肠杆菌并以实施例3所述的相同方法诱导表面表达。然后，以测量抗原与表面表达的抗体的结合程度的ELLSA方法鉴定表达到细胞表面的单链Fv抗体的活性。在表达抗体的细胞和仅含表达载体的细胞中分别比较了抗原结合的程度。
调节各细胞使具有相同的浓度，收获，用PBS缓冲液洗涤(pH7.4)并用1.4ml相同的缓冲液重悬。将这些悬浮溶液分成25，50，100，200和250μl的批次，然后与能结合抗体(H69k)的临界浓度的pre-S2抗原混合并在室温下反应2小时。然后在室温下离心结合的溶液2分钟并将所得的上清液加入ELISA板上覆盖过夜。此时，加入计算量的抗体H69k并以如下的ELISA方法测量覆盖的抗体量。
经过使用含2％牛血清白蛋白的TBS-T缓冲液
封闭覆盖过夜的平板2小时并用TBS-T缓冲液洗涤。然后，加入10ng第一抗体H69k，反应2小时并用相同的缓冲液洗涤以去掉未结合的抗体。用1000倍的缓冲液稀释与辣根过氧化物酶结合的第二抗体并反应。加入H2O2作过氧化物酶的底物且OPD作显色剂以诱导显色且经过使用硫酸终止该反应。然后，测量在492nm下的吸光率并转换成对不含细胞的空白的100％吸光率的百分数。结果，与对照细胞的抗原结合进行比较，结果如图5所示。
<实施例8>含果聚糖蔗糖酶基因的pSSTS109重组载体的构建构建pSSTS109重组载体，它使用INP并能将果聚糖蔗糖酶表达到细胞表面。
将果聚糖蔗糖酶基因插入本发明的pGINP21M载体中。使用pZL8载体[Song和Rhee，生物技术通讯，161305-1310(1994)]作模板进行PCR以扩增果聚糖蔗糖酶。此时分别与开架阅读框(ORF)上游和下游序列互补且含有新的限制性酶位点，即ORF起点为Bam HI位点，终点为Sma I和Eco RI位点的寡核苷酸SEQ.ID.No.3和SEQ.ID.No.4用作引物。将PCR产物有效地亚克隆进pTT Blue(R)载体(Novagen Co.，USA)。用Bam HI-Eco RI消化亚克隆的果聚糖蔗糖酶基因并插入用相同酶消化的pGINP21M载体中。
结果，制备pSSTS109重组载体，转化大肠杆菌DH5α，且转化的大肠杆菌于1997年3月27日保藏于KRIBB，KIST(保藏号KCTC 0327 BP)。
<实施例9>果聚糖蔗糖酶的表面表达用pSSTS109重组载体转化大肠杆菌并以实施例3所述的相同方法诱导表面表达。
表面锚着的果聚糖蔗糖酶的物理观察在图8中提供。用果聚糖蔗糖酶反应抗体和FITC抗记的第二抗体的免疫荧光染色该果聚糖蔗糖酶。有效染色的阳性反应细胞如图8(D)所示，而阴性反应细胞末染色(见图8(B))。这是INP能指导外源蛋白质表达到细胞外膜且作为表面锚着基序有用的直接证据。
<实施例10>经过使用表面表达系统将蔗糖生物转变为果聚糖已报道了经过使用果聚糖蔗糖酶使蔗糖经酶转变为果聚糖[Song和Rhee，生物技术通讯，161305-1310(1994)]。生物转化的最适温度为10℃，在10％蔗糖溶液中的最高产率为46％。洗涤经过使用INP锚着基序在其表面表达果聚糖蔗糖酶的完整细胞，然后用于以最大产量直接形成果聚糖，如果将它们重悬于10℃的乙酸缓冲溶液(pH5.5)中无需分离酶或制备细胞溶胞产物(见图9)。
起始细胞浓度较低，如1.3 OD600nm。由于果聚糖蔗糖酶的比活足够高，该细胞密度适用于生物转化。在12天反应期间精确水解77％的所加入的蔗糖并聚合成果聚糖(51.1g/l)。此时从上述蔗糖溶液释放并积累未聚合的葡萄糖(77g/l)。与这些阳性细胞的结果相比，在胞质空间含果聚糖蔗糖酶的阴性细胞在反应期间不能将蔗糖转变为果聚糖。结果，仅检测到少量的葡萄糖，如2.13g/l，无可测量的果聚糖量。因此证实了用洗涤的完整细胞形成的果聚糖由表面暴露的果聚糖蔗糖酶的反应引起。
<实施例11>含重复区缺失的INP的pANC3载体的构建为了构建含重复区缺失的INP基因的表面锚定载体，已诱变了INP基因使缺失中央重复区。
将编码INP N端特异性区域(175个氨基酸残基)，前2个重复亚基(32个氨基酸残基)，后3个重复亚基(48个氨基酸残基)和INP的C端特异性区域(49个氨基酸残基)的重组DNA精确放在pKK223-3质粒载体tac启动子下游(Pharmacia.Co.，Sweden)，产生表面锚定载体，pANC3(见图6)。
用本发明的pANC3载体转化大肠杆菌，转化的大肠杆菌于1997年3月27日保藏于KRIBB，KIST(保藏号KCTC 0326 BP)。
<实施例12>pANC3-CM2重组载体的构建构建pANC3-CM3重组载体，它使用重复区缺失的INP且能在细胞表面表达CMCase。
经过进行实施例2的相同程序将CMCase基因也亚克隆进pANC3载体以制备表面锚着载体pANC3-CM2。
<实施例13>用重复区缺失的INP表面表达CMCaseINP是具有内部重复区的大型多肽，该重复区对于运输到细胞外膜可能是不必要的。按实施例12所述也将CMCase基因亚克隆进pANC3锚着载体，制备pANC3-CM2重组载体。用pANC3-CM2重组载体转化大肠杆菌JM109菌株。经过进行实施例3相同的程序测定转化的大肠杆菌JM109细胞表面的总CMCase活性。
洗涤细胞后经测量完整细胞CMCase活性来证实(见图7)。在42℃生长的细胞显示出比在37℃生长的细胞具有更高水平的CMCase活性。在生长的早期静止期其活性达到最大点，然后其活性在几小时内下降。
结果证实INP的N端和/或C端区在其本身一级序列上具有分泌和靶向信号，因为缺乏INP中央重复区的INP也引导CMCase到细胞表面。
在本发明中制备的pGINP21M载体和pANC3载体有效地表达CMCase脂酶，人类化的单链Fv抗体，果聚糖蔗糖酶等到大肠杆菌的细胞表面。该载体具有如下所述的极大的优势。表达的蛋白质不被稀释，因为该蛋白质浓度位于细胞表面。仅经过洗涤细胞就能容易地鉴定该表达，因为细胞破碎或蛋白质分离或纯化不是必需的。
使用INP特性的本发明的载体对于克隆外源蛋白基因是有用的，因为在INP的一级序列中除了分泌信号和靶向信号外，INP的中央重复区的长度可根据需要发生变化。因此，该载体所具有的显著优势是外源蛋白质和细胞表面间的距离可便于调节。
本发明的制品的方法使用了INP的特性且能不管细胞周期而稳定表达外源蛋白质。它能应用于各类细菌宿主。另外，表面表达因为大量表达到细胞表面而有利于外源蛋白质的鉴定。
本发明的表面表达系统可用于有效地生产重组外源蛋白质，它包括各种抗原，抗体，酶，结合或吸附蛋白，用于筛选生理学激活剂的肽文库等。由于该系统具有广泛的应用，所以它可用于生产新疫苗，抗肽抗体，用于分离微生物的吸附剂，位于细胞表面的酶等。
尤其是表达到细胞表面的果聚糖蔗糖酶对于从蔗糖生产果聚糖是非常有用的，日本发明的该方法可有效地用于生物转化。
序列描述(1)一般信息(iii)序列数4个(2)SEQ ID No.1的信息(i)序列特征(A)长度25个碱基对，(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑线型(ii)分子类型寡核苷酸(iii)序列描述SEQ ID No.1AAGTA CAGGT ACCGCAGGTC ACGAG(2)SEQ ID No.2的信息(i)序列特征(A)长度34个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑线型(ii)分子类型寡核苷酸(iii)序列描述SEQ ID No.2GGAGTGCTTG AATTCCCCGG GATCCTTTAC CTCT(2)SEQ ID No.3的信息(i)序列特征(A)长度25个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑线型(ii)分子类型寡核苷酸(iii)序列描述SEQ ID No.3GGATCCGATG TTGAATAAAG CAGGC(2)SEQ ID No.4的信息(i)序列特征(A)长度28个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑线型(ii)分子类型寡核苷酸(iii)序列描述SEQ ID No.4GATTCCGGGA ATCAGAAACG AAACGTCA
权利要求
1.一种表面锚着载体，它含有冰成核蛋白质(INP)的基因片段。
2.根据权利要求1的表面锚着载体，其中INP来自丁香假单胞菌KCTC1832。
3.根据权利要求2的表面锚着载体，它含有包括N端分泌信号和C端靶向信号的INP的基因片段。
4.根据权利要求3的表面锚着载体，其中INP基因的长度在INP的中央重复区中是可变的。
5.根据权利要求2的表面锚着载体，它含有用于插入外源基因的在INP基因C端的限制性位点。
6.根据权利要求4或权利要求5的表面锚着载体，它是pANC3克隆载体。
7.经过用权利要求6的pANC3克隆载体转化大肠杆菌制备的转化子(保藏号KCTC0326BP)。
8.根据权利要求5的表面锚着载体，它是pGINP21M克隆载体。
9.经过用权利要求7的pGINP21M克隆载体转化大肠杆菌制备的转化子(保藏号KCTC0239BP)。
10.用于表面表达的重组载体，其中外源蛋白质的基因插入权利要求6的表面锚着载体。
11.根据权利要求10的pANC3-CM2重组载体，其中外源蛋白质包括用于表面表达的CMCase。
12.用于表面表达的重组载体，其中的外源蛋白质基因插入权利要求8的表面锚着载体中。
13.根据权利要求12的pASCM1重组载体，其中外源蛋白质包括用于表面表达的CMCase。
14.根据权利要求12的pASLP1重组载体，其中外源蛋白质包括用于表面表达的脂酶。
15.根据权利要求12的pASIG1重组载体，其中外源蛋白质包括用于表面表达的人类化的单链Fv抗体。
16.根据权利要求12的pSSTS109重组载体，其中的外源蛋白质包括用于表面表达的果聚糖蔗糖酶。
17.经过用权利要求10或权利要求12的重组载体转化宿主细胞制备的转化子。
18.根据权利要求17的转化子，其中的宿主细胞包括大肠杆菌，醋杆菌属种类，假单胞菌属种类，黄单胞菌属种类，欧文氏杆菌属和Xymomonas sp.。
19.根据权利要求17的转化子，它经过用权利要求11的pANC3-CM2重组载体转化大肠杆菌JM109获得。
20.根据权利要求17的转化子，它经过用权利要求13的pASCM1重组载体转化大肠杆菌JM109获得(保藏号KCTC0237BP)。
21.根据权利要求17的转化子，它经过用权利要求14的pASLP1重组载体转化大肠杆菌JM109获得。
22.根据权利要求17的转化子，它经过用权利要求15的pASIG1组载体转化大肠杆菌JM109获得。
23.根据权利要求17的转化子，它经过用权利要求16的pSSTS109重组载体转化大肠杆菌DH5α获得(保藏号KCTC0327BP)。
24.一种制备外源蛋白质的方法，包括如下步骤a)培养权利要求17的转化子。b)以融合蛋白的形式将外源蛋白质与INP表达到细胞表面。
25.根据权利要求24的用于制备外源蛋白质的方法，其中的外源蛋白质是果聚糖蔗糖酶。
26.根据权利要求17的制备外源蛋白质的方法，其中外源蛋白质的大小可经过调节INP中央重复区的INP基因长度而变化。
27.以权利要求24的方法制备的外源蛋白质的应用，包括抗体，酶，抗原，结合蛋白质，吸附蛋白质和肽文库。
28.根据权利要求27的外源蛋白质的应用，其中的外源蛋白质是果聚糖蔗糖酶，它可用于使用权利要求23的转化子来制备果聚糖。
全文摘要
本发明涉及表面锚着载体,用于制备外源蛋白质到细胞表面的方法及其应用,它使用了来自革兰氏阴性细菌,丁香假单胞菌的细胞外膜蛋白,冰成核蛋白(INP)。
文档编号C12N9/42GK1185809SQ97190288
公开日1998年6月24日 申请日期1997年4月2日 优先权日1996年4月2日
发明者潘在龟, 郑兴采, 朴胜焕, 韩文熙, 朴英薰 申请人:韩国科学技术研究院