专利名称：细胞内半胱氨酸和谷胱甘肽浓度的评价的制作方法
背景技术：
发明领域本发明主要涉及营养学和生物化学以及细胞的谷胱甘肽代谢领域。更具体地说，本发明涉及测定半胱氨酸和谷胱甘肽胞内功能水平，以提供对预防退化性疾病和应付氧化应力的个体能力的衡量。
相关技术的说明目前被广泛认可的是，反应性氧分子，即通常所谓的自由基的存在，会令包括衰老、关节炎、癌、动脉粥样硬化、心血管梗塞、中风、病毒性感染、肺病、肠道病和神经退化性疾病等许多人体健康状况发展或恶化。这些不良分子是生理过程的正常副产物，而且是由氧代谢产生的；例如，通过细胞呼吸，功免疫系统功能(杀伤外来物质)和代谢所必须的许多酶反应而产生。此外，自由基在环境中也是常见的。自由基的环境来自包括烟雾、离子幅射、空气污染、化学物质(致癌物、许多石油化学物质、杀虫剂、染料、溶剂、细胞生长抑制剂等)、毒性重金属和氧化或腐败脂肪。最常见的自由基有一部分是超氧化物、羟基自由基、单态氧和过氧化物，其中包括过氧化氢。某些价态的铁和铜能够催化自由基的形成，这些自由基虽然存在时间很短，但是启动了自由基形成的链反应，随后引起生物分子的改变、破坏。
自由基对活的生物有毒，会导致生物分子的结构破坏。分子破坏可能造成遗传密码的改变、破坏细胞膜的完整性、神经紊乱、内分泌失调、过敏性增高、血管内皮破坏和关节退化和发炎。
人们发现许多被称为抗氧化剂的分子具有对抗自由基有害作用的保护功能。抗氧化剂可以将自由基及其链反应副产物中和掉并转化为危害性较低的产物。抗氧化剂可以是酶(例如过氧化物歧化酶、过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶)，必需营养素(例如β胡萝卜素、维生素C和E、硒)或各种内源性化合物(如谷胱苷肽)或饮食化合物(例如生物类黄酮)。所以，人体具有多种自由基的天然猝灭剂。
人体研究表明，营养性抗氧化剂的摄入不足与癌症、心血管疾病、关节炎、白内障等的较高危险性相关。此外，较多摄入营养性抗氧化剂与慢性退化性疾病的较低发生相关。以上鼓舞人心的研究表明，补充营养性抗氧化剂进行干预可能对人具有治疗作用。
出于多种原因，抗氧化剂状态的实验室分析还没有常规进行。自由基存在时间极短，通常不易直接测定。自由基损伤的副产物是可以测定的，例如血清或尿液中的丙二醛酸(malondialdehyde)(MDA)，硫巴比妥酸反应性物质(TBARS)或脂质过氧化物；然而，这些测试也许是氧化应力的指示，但是只反映对某些类型生物分子的破坏(主要是多聚不饱和脂肪酸和核酸)。另外，测定血清或细胞内抗氧化营养素水平和细胞内抗氧化酶活性的方法，能够确定某些特定成份的缺乏水平。
谷胱甘肽是一种突出的细胞抗氧化剂，它富含于细胞质、细胞核和线粒体内。谷胱甘肽除了强烈的抗氧化功能外，它还起着强抗毒剂的作用，令机体能够消除各种生物异源物质和致癌化合物。而且，谷胱甘肽为细胞介导免疫功能所必需，对于维持血液红细胞完整性至关重要。而且，通常认为，谷胱甘肽系统的缺陷引起明显的细胞老化以及最终细胞死亡。
细胞谷胱甘肽浓度对抗氧化功能具有重要作用；而且，营养限制、运动和氧化应力对细胞谷胱甘肽的浓度具有显著影响。在氧化性条件下，经与生物异源物质的偶联，谷胱甘肽偶联物和谷胱甘肽二硫化物从受影响细胞的分泌，可能大大削弱了谷胱甘肽的功能。在严重的氧化应力下，相当数量的谷胱甘肽会成为结合蛋白质。幸好，可有诸如N-乙酰-半胱氨酸之类的化合物来提高细胞内的谷胱甘肽功能。
谷胱甘肽可以用ATP、镁和甘氨酸、谷氨酸和半胱氨酸这三种氨基酸经一系列生物化学反应来合成。通常，γ谷氨酰半胱氨酸的合成速度决定了谷胱甘肽的合成速度，而半胱氨酸的巯基(sulfyhydryl)为谷胱甘肽提供了生物活性。所以，在测定谷胱甘肽的功能利用度和评价抗氧化功能时，都必需测定半胱氨酸的利用度(availability)。
评价半胱氨酸和谷胱甘肽还有助于评价硒缺乏。当谷胱甘肽作为抗氧化剂起作用时，它在由谷胱甘肽过氧化物酶催化的反应中与过氧化氢反应形成谷胱甘肽二硫化物。谷胱甘肽过氧化物酶需要硒作为功能性辅因子。所以，充足的半胱氨酸功能伴随以缺陷性或一般性SPECTROXTM结果，表明细胞内缺乏硒并需要进一步检测。
现有技术的不足在于缺乏用生物化学方法来评价人细胞内半胱氨酸和谷胱甘肽水平(亦即个体应付氧化应力的能力)的简单而经济的方法。本发明满足了该领域长期以来的这一需求。
发明概述本发明目的之一是提供一种用于测定淋巴细胞内谷胱甘肽功能水平和进行抗氧化功能生物化学分析的细胞培养基，所述的培养基包含含有以下成份的无血清缓冲液糖，选自葡萄糖或生物学上能够在细胞内产生葡萄糖的化合物；生物可利用形式的泛酸，胆碱或能够在细胞内产生胆碱的生物可利用形式的物质；生物可利用形式的氯、磷酸根、钙、镁、钾、钠和铁等无机离子；L-丁硫因-[S.R.]-亚砜亚胺(L-Buthionine-[S.R.]-Sulfoximine)；去离子水；和含量能有效刺激被测淋巴细胞的促细胞分裂原；所述无血清缓冲液的pH约6.8至7.6；而且，所述细胞培养基的特征在于能够有效测定淋巴细胞内谷胱甘肽的功能水平，营养缺陷、不足和失调，并能够通过生物化学方法分析淋巴细胞的抗氧化功能。
本发明实施方案之一包括在本发明的细胞培养基中补充了选自生物可利用形式的氨基酸和维生素等物质的营养素补充物而在该营养素补充物中删除了待测的某营养素、或让此待测营养素以有限量或抑制量存在其中。
本发明另一目的是提供测定个体内谷胱甘肽胞内功能水平和生物化学分析细胞抗氧化功能的方法，它包括以下步骤将本发明细胞培养基和待测个体的淋巴细胞一起接种；培育接种后的细胞培养基；将该淋巴细胞的反应与个体对照组淋巴细胞的反应进行比较。
本发明的另一目的是提供一种用于测定人淋巴细胞细胞内半胱氨酸功能水平和生物化学分析抗氧化功能的细胞培养基，所述培养基包含含有以下成分的无血清缓冲液糖，选自葡萄糖或生物学上能够在细胞内产生葡萄糖的化合物；生物可利用形式的泛酸；胆碱或能够在淋巴细胞内产生胆碱的生物可利用形式的物质；生物可利用形式的氯、磷酸根、钙、镁、钾、钠和铁等无机离子；氢过氧化枯烯；去离子水；N-乙酰-L-半胱氨酸和刺激被测淋巴细胞的有效量的促细胞分裂原；所述无血清缓冲液的pH约6.8至7.6；所述细胞培养基的特征在于能够有效测定营养缺陷、不足和失调，并能够通过生物化学方法分析淋巴细胞的抗氧化功能。
本发明实施方案之一包括在本发明的细胞培养基中补充了选自生物可利用形式的氨基酸和维生素等物质的营养素补充物，而在该营养素补充物中删除了待测的某营养素、或让此待测营养素以有限量或抑制量存在其中。
本发明另一目的是提供测定个体内半胱氨酸胞内功能水平和生物化学法分析细胞抗氧化功能的方法，它包括以下步骤将本发明细胞培养基和待测个体的淋巴细胞一起接种；培养接种后的细胞培养基；将该淋巴细胞的反应与个体对照组淋巴细胞的反应进行比较。
通过以下对本发明优选实施方案的说明，本发明的其它内容、特征和优点将是显而易见。这些实施方案的给出目的是公开本发明。
本发明的详细说明本发明涉及用生物化学法分析人淋巴细胞内半胱氨酸和谷胱甘肽细胞内功能的方法。这样的分析反映出外周淋巴细胞中个体抗氧化系统的生理健康状态。本发明方法能够准确评价人淋巴细胞内半胱氨酸和谷胱甘肽的胞内功能，由此就可以采取治疗措施来改善个体的抗氧化功能特性。
采用淋巴细胞的本发明方法具有独特的优点，因为淋巴细胞(1)是细胞介导免疫系统的主角，并且易于受刺激而生长(细胞分裂)；(2)反映了长时期内的平均营养状态(淋巴细胞的生命周期约6个月)；(3)具有与其它细胞共同的代谢通路；而且(4)用标准的静脉穿刺术收集方便。
通过测定淋巴细胞的生长来评价半胱氨酸和谷胱甘肽的胞内功能，本发明方法可以反映出各病人各不相同的独有特征。所以，可以根据各患者(而不是根据用所谓标准测定的“一般”患者)的特殊生物化学需求采用相应的治疗方法。
对本领域技术人员来说显而易见的是，对于在此公开的本发明内容可能进行的各种取代和修改都属于本发明的范围和宗旨内。
给出以下实施例是为了说明本发明的各种实施方式，而不是对本发明作任何形式的限制。
实施例l抽取患者血样本发明方法需要两份10ml用柠檬酸-葡萄糖保存的全血标本，无须禁食。全部所需就是抽取血样。可以就地进行本发明的试验，或者在室温下将患者的血样送至合适的实验室。不需要离心血样。全面的测试结果提供了对患者谷胱甘肽或半胱氨酸特征的可信而科学的分析。
实施例2样品的处理分离细胞全部过程均在层流罩下以无菌技术进行，以确保样品的无菌性。实验室在收到各个患者的血样后分别指定登记号。以该登记号作为样品编号，从而能够在贯穿处理、数据收集和数据分析的各步骤中进行追踪。处理患者血样涉及到的每根试管、离心管、微滴板和数据输出都以该样品(登记)号标记。
各患者的样品包括各含8ml全血的(2)两管柠檬酸-葡萄糖(顶端黄色)真空试管。在指定了登记(样品)号后，颠倒6次混合全血。将两管全血合并到一根50ml的一次性离心试管内。
从各份样品中无菌取500μl的一小份加到一个12×17mm试管中。用该份样品在CoulterT540型细胞计数仪上进行全血细胞计数。Coulter打印出的全血细胞计数结果标上登记号，并贴在该患者的检查单(worksheet)上。
在15ml的圆锥形试管内加入5.0ml Histopaque 1077(Ficoll/3，5-双(乙酰氨基))-2，4，6-三碘苯甲酸钠，Sigma Chemical，St Louis，Missouri)，每个血样如此准备(2)两根Ficoll梯度试管。用一根10ml的移液管和一台电动移液辅助仪缓慢地在各Ficoll梯度试管中铺叠上8ml全血。将Ficoll梯度试管封盖，以2160RPM离心20分钟。
离心完毕，小心地从离心机中取出梯度试管避免扰乱梯度。用5ml移液管将位于中部Ficoll层界面处的浅黄色层(内含淋巴细胞)转移到一个15ml一次性圆锥形离心试管内。将浅黄层与磷酸盐缓冲液-0.72％葡萄糖溶液(PBS-G)合并，使最终体积达12ml。将试管加盖，颠倒6次以混合浅黄层和PBS-G。
含有浅黄层和PBS-G的离心管以2160RPM离心5分钟。离心后，吸弃上清液，留下细胞沉淀。将细胞沉淀重悬在12ml PBS-G中，然后颠倒6次以确保细胞沉淀充分分散。然后如上所述再次离心样品。
在第二次离心后，吸弃上清液。将细胞沉淀重悬在6.0ml PBS-G中。用与一电动移液辅助仪连接的5ml移液管将细胞沉淀打散并与PBS-G混合。在得到均质细胞悬液后，取200μl的一份悬液转移到一个12×75mm的试管内。用该份样品在Coulter T540型细胞计数仪上进行初始的细胞悬液(ICS)计数。
该份样品的打印结果标上样品号并贴在检查单上。如果淋巴细胞数量在每立方毫米3.9至1.2×103细胞之间(THSD/mm3)，则该样品可用于微滴板接种。加入的细胞悬液体积见表I和表IV。如果淋巴细胞数量超过3.9THSD/mm3，则该样品需要再稀释。但是，如果淋巴细胞数量低于1.2THSD/mm3，则放弃该样品。
用以下计算公式来确定适当再稀释需加入的PBS-G量C1，V1＝C2V2C＝淋巴细胞浓度(THSD/mm3)V＝体积当C2＝3.0THSD/mm3时，这是最终细胞悬液要求的淋巴细胞浓度。例如，当6.0ml的初始细胞悬液计数(LY#)＝5.6THSD/mm3时，C1，V1＝C2V2(5.6)(6.0ml)＝(3.0)(X)X＝11.2ml的最终体积在重悬细胞中加入适当体积的PBS-G使最终体积为11.2ml。在该实例中，要达到11.2ml的最终体积，需在原来的6.0ml中加入5.2ml。将所需体积的PGS-G加入(ICS)中形成最终细胞悬液(FCS)。将LY#计数和PBS-G体积记录在SPECTROXTM测试检查单上。
再稀释后，如前所述，将200μl的一份再稀释细胞悬液转移到一个新的12×75mm试管内，并进行细胞计数。将再稀释细胞悬液计数打印结果(最终细胞悬液LY#)贴在检查单上，并记录接种体积。
实施例3谷胱甘肽浓度的评价A.微滴板接种将最终细胞悬液加入一无菌槽中，并在层流罩内放置含培养基的微滴板。用配有0-50μl屏蔽吸嘴的12通道手动微量移液管，将特定量(根据表I)的最终细胞悬液分置在微滴板的各孔内。
表I根据所列的最终细胞悬液淋巴细胞数(LY#)用下列体积进行微滴板接种。
最终细胞悬液的LY# 用于接种的调整后体积3.9-0.37 8.0μl3.6 8.5μl2.5-3.5 10.0μl2.4 12.5μl2.3 13.0μl2.2 14.0μl2.1 14.5μl2.0 15.0μl1.9 16.0μl1.8 17.0μl1.7 18.0μl1.6 19.0μl1.5 20.0μl1.4 21.5μl1.3 23.0μl＜＝1.2 25.0μl细胞加入培养基后，将微滴板加盖，置于CO2培养箱中在37℃维持96小时。B.标记全部标记过程均在放射性同位素室(Radioisotope Room)中进行。从冰箱中取出氚化胸腺嘧啶(H3-TdR)工作液，水浴温热至37℃。96小时后，从培养箱中取出微滴板。将H3-TdR工作液加入一无菌槽中，用配有0-50μl屏蔽吸嘴的12通道手功微量移液管将10μl的H3-TdR工作液分置到微滴板的各孔内。微滴板返回37℃培养箱内再放置24小时。将执行标记的技术人员的日期和姓名首字母记录在样品记录单上。C.收获全部收获过程均在放射性同位素室中进行。用#2铅笔在一张玻璃纤维滤板(Packard Part#6005416)上标以样品号。启动真空泵，并将干燥烘箱设定在100℃。将与收获器相连的蒸馏水罐装满。加入H3-TdR 24小时后，从培养箱中取出微滴板。将执行收获的技术人员的日期和姓名首字母记录在样品记录单上。
细胞收集器(Packard#C9619型)处于打开位置，暴露出O环，将玻璃纤维滤板放在收集器上，以粗糙面与O环接触。将细胞收集器关好，用清洗盘的蒸馏水湿润滤板。将收集器留置在真空循环(vacuum cycle)(VAC)上。去除微滴板上的盖子，将微滴板置于收集器的探头吸嘴下。缓慢抬高微滴板至收集器探头，直至探头吸嘴触及板底。抽吸培养基，缓慢地以圆周运动方式移动微滴板，藉此用探头吸嘴刷擦孔底。刷擦持续10秒钟。即，保持微滴板与收集器的探头吸嘴接触，连续刷擦抽吸，按住“洗涤”钮10秒钟。抽吸出孔内液体，重复上述刷吸步骤。取下微滴板，在清洗盘中装入甲醇，抬高清洗盘，吸取甲醇，再降低清洗盘。
打开收集器，滤板粘贴在上部，在真空VAC中继续操作5秒钟。5秒后，关闭VAC，同时从收集器表面取下滤板。将滤板粗面朝上在干燥烘箱内放置10分钟。从烘箱中取出滤板，冷却至室温。D.放射活性的计量全部计量过程均在放射性同位素室中进行。将滤板装入计量盒中，粗面朝上。在滤板上方放置一准直仪，即将滤板固定在位的不锈钢薄板。将该盒装入Packard Matrix9600β粒子放射活性计量仪内，并启动Q-气流(含1.3％丁烷的氦气)流入Matrix9600中。按“启动”钮，启动计量程序，对每孔进行3分钟的总放射活性计量。将各样品的计量值记录在Matrix9600硬驱中。此外，打印出放射活性原计量值的硬拷贝。E.数据的转换将数据从Matrix9600的硬驱中下载到一张3.5时磁盘上。利用Microsoft Excel内的宏将原数据转化成可记录格式。该宏从各数据点中减去微滴板背景值，产生一式三份孔值的平均值，以微滴板对照值设定为100％，将该平均值表示为对照值的百分数。F.数据的分析(标准化)利用淋巴细胞生长应答试验来检测谷胱甘肽(GSH)的抗氧化功能。将细胞置于化学成分明确的无血清培养基中(内含5μM L-丁硫因-(S，R)-亚砜亚胺(BSO))，加入促细胞分裂化合物来刺激其生长。通过3H-胸腺嘧啶掺入法测定的生长反应以对照生长的百分比表示。BSO抑制合成谷胱甘肽所需的谷胱甘肽转移酶的合成。所以，在培养基中加入BSO及其对谷胱甘肽合成的抑制反映为细胞生长的改变，以淋巴细胞中谷胱甘肽的状态表示。所用的BSO剂量(5μM)是在1995年确定的。
个体的淋巴细胞生长以在含有或不含BSO的培养基中的生长百分比表示。用Microsoft Excel计算相对于100％生长(不含BSO)的+BSO生长比率。输入了1000多个患者的结果比值，并用标准Excel程序进行了统计学分析，以确定比值的平均值、中值、范围和方差。将“无关项”，即离差落在±2个标准离差范围外的数据从总体基数中去除。余下的数据用来确定参照点和确立总体参照范围。该总体参照范围在图形上表现为散在图分布。已经测得，谷胱甘肽的标准/参考值大于85％(＞85％)；所以，谷胱甘肽值低于85％的任何人都归类为缺乏谷胱甘肽。G.设备和试剂本发明试验中使用了以下设备层流罩；离心机，Beckman GS-6；细胞计数仪(Coulter T540型)；12通道移液器(5-500μl)；电动吸量泵(Drummond)；无菌的50ml有盖圆锥形塑料试管；12×75mm聚丙烯试管；无菌的15ml有盖圆锥形塑料离心试管；移液管(0-20，0-200，0-100μl量程)；无菌玻璃一次性移液管-5.0ml，10.0ml；试管架和吸气屏蔽吸嘴(0-50μl)。
表II 列出了本发明方法中所用的各种试剂及其来源表II试剂盐酸腺嘌呤 Sigma A 8751抗生素溶液(PSF) GIBCO 15245-012盐酸精氨酸 Sigma A5131L-丁硫因-(S，R)-亚砜亚胺Sigma B2515d-生物素Sigma B4501无水氯化钙 Sigma C4901盐酸胆碱Sigma C1879氢过氧化枯烯Sigma C0524氰钴胺素(维生素B12)Sigma V2876无水盐酸半胱氨酸Sigma C1276EDTA二钠Sigma E4884七水合硫酸亚铁 Sigma F8633叶酸，钙盐 Sigma F7878葡萄糖 Sigma G5767葡萄糖溶液(10％)Sigma G3126L-谷胺酰胺 Sigma G3126甘氨酸 Sigma G7126HEPES，无酸 SigmaH3375L-组氨酸(盐酸单水合盐) SigmaH8125Histopaque(Ficoll/3，5-双(乙酰氨基))-Sigma1077-12，4，6-三碘苯甲酸盐)羟钴胺素(HCI(B12)) SigmaH7126肌醇 SigmaI5125L-异亮氨酸 SigmaI2752L-亮氨酸 SigmaL8000L-赖氨酸 SigmaL5626无水硫酸镁 SigmaM7506纯甲醇 VWR VWR4300-7L-甲硫氨酸 SigmaM9625烟酰胺(维生素B3)SigmaN3376D-泛酸钙 SigmaP0290酚红溶液，0.5％PBS SigmaP0290L-苯丙氨酸 SigmaP2126磷酸盐缓冲液，pH7.4 SigmaP3813植物血凝素，PHA-PSigmaL8754磷酸氢二钾 SigmaP3786吡哆素(HCI(维生素B6)) SigmaP9755核黄素(维生素B2)SigmaR4500L-丝氨酸 SigmaS4500氯化钠 SigmaS9625氢氧化钠，5.0N的溶液 VWR RS4151丙酮酸钠 SigmaP2256丙酮酸钠溶液，(100mM)SigmaS8636硫胺素(维生素B1)SigmaT4625L-苏氨酸 SigmaT8625胸腺嘧啶 SigmaT9250[3H]-胸腺嘧啶 ICN 24066L-色氨酸 SigmaT0254L-酪氨酸 SigmaT3754L-缬氨酸 SigmaV0500H.溶液所有溶液都是用组织培养级去离子水(tcd H2O)配制的。
1.磷酸盐缓冲液。欲制备磷酸盐缓冲液(PBS)+0.72％葡萄糖(PBS-G)溶液，用去离子水根据包装说明制备PBS。加入足量的10％葡萄糖溶液，达0.72％的最终浓度。溶液经过滤灭菌，保存在冰箱中(2至8℃)。
2.储备液。按以下方法制备浓缩(2X)储备液在去离子水中将(1)23.80gHEPES；(2)14.02g氯化钠；(3)1.05g磷酸氢二钾；(4)0.241g硫酸镁；(5)1.0ml(10μM)盐酸腺嘌呤；(6)30.0ml(100mM)丙酮酸钠；(7)0.5ml 0.5％酚红；(8)5.0ml抗生素混合液；(9)8.0ml 5N氢氧化钠；(10)20.0ml Fe/EDTA(1.0mM FeSO4/0.4mM Na2EDTA)混合。在全部物质都混合充分后，用5N氢氧化钠将pH调节至7.60。加入去离子水令最终体积达1.0L。溶液经0.2μM的滤膜过滤除菌，并保存于4℃的冰箱中。溶液的稳定期为4周。
3.基础液。如下制备用于100％微滴板对照和本发明新方法的基础液过滤后必须使用无菌技术。在层流罩下制备基础液，将表III所列的各成份混合，并加去离子水至要求的最终体积。溶液经真空除菌过滤装入一无菌瓶中。加入适当体积的PHA储备液。
表III最终体积基础液(ML)储备液 100ml250ml500ml 1000ml 1500ml 2000ml2X储备液(ml) 50 125 250 500 750 1000硫胺素(B1)储备液(μl)10 25 50 100 150 200核黄素(B2)储备液(μl)10 25 50 100 150 200烟酰胺(B3)储备液(μl)10 25 50 100 150 200吡哆素(B6)储备液(μl)10 25 50 100 50 200羟钴胺素(B12)储备液(μl) 10 25 50 100 150 200亚叶酸(Folimic)第二储备液(μl)10 25 50 100 150 200生物素储备液(μl) 10 25 50 100 150 200葡萄糖储备液(ml) 0.721.8 3.6 7.2 10.8 14.4Cho/Ino储备液(ml) 10 2.5 5.0 10.0 15.0 20.0各种氨基酸储备液(ml) 10 2.5 5.0 10.0 15.0 20.0CaCl2储备液(ml) 10 1.25 2.5 5.0 7.5 10.0PHA(ml) 10 0.5 1.0 2.0 3.0 4.0
4.L-丁硫因-(S，R)-亚砜亚胺(BS)工作液的制备(5μM/L)。将0.2223gBSO(Sigma B 2515)溶解在20ml PBS-G中制备成50mM的储备液。然后该溶液用无菌技术经真空抽滤除菌进入一无菌瓶。在900μl无菌PBS-G中加入100μl 50mMBSO制得第二BSO储备液(500μM)。将2.5ml第二储备液、500μM BSO储备液加入247.5ml基础液中并充分混合，制备成5μM的BSO工作液。
该溶液的稳定期为1周。
5.胸腺嘧啶(ThY)储备液。如下制备冷胸腺嘧啶(ThY)储备液(1.33mM ThY，0.322g/L)称取0.161g ThY溶解在去离子水中，最终体积为500ml。该溶液用无菌技术经真空抽滤除菌装入一无菌瓶内。将该溶液等分置入50ml的离心管中。欲短期保存，溶液可保存在冰箱内(4℃)，稳定期为1个月。欲长期保存，可将溶液冷冻(-70℃)，稳定期为6个月。为了标记细胞，应用胸腺嘧啶工作液稀释放射性胸腺嘧啶(H3TdR)。
为了制备胸腺嘧啶工作液，ThY+3H-TdR，在300ml无菌除气去离子水中加入以下化合物1.15ml 1.33mM ThY(低温)，1.70ml比活性为300μCi/mmol的3H-TdR(ICN part#24066)。一经制成，溶液可在冰箱条件下(4℃)保存1周。
实施例4半胱氨酸浓度的评价A.微滴板接种将最终细胞悬液加入一无菌槽中，并在层流罩下放置含培养基的微滴板。用配有0-50μl屏蔽吸嘴的12通道手动微量移液管将特定体积(根据表IV)的最终细胞悬液分置到微滴板的各孔中。
表 IV根据下列最终细胞悬液淋巴细胞数量(LY#)，使用下列体积进行微滴板接种。
最终细胞悬液LY# 用于接种的调整后体积3.9-0.37 8.0μl3.6 8.5μl2.5-3.5 10.0μl2.4 12.5μl2.3 13.0μl2.2 14.0μl2.1 14.5μl2.0 15.0μl1.9 16.0μl1.8 17.0μl1.7 18.0μl1.6 19.0μl1.5 20.0μl1.4 21.5μl1.3 23.0μl＜＝1.2 25.0μl将细胞加入培养基后，在微滴板的1至3排1至9列中加入10μl N-乙酰-L-半胱氨酸溶液(最终浓度为150mM)。
在微滴板上另6排的1至3列中加入10μl 200μM氢过氧化枯烯(CuOOH)。在此6排的4至6列中加入10μl 300μM氢过氧化枯烯(CuOOH)。在此6排的7至9列中加入10μl 400μM氢过氧化枯烯(CuOOH)。在微滴板中加入CuOOH后，将微滴板加盖放置于CO2培养箱中在37℃维持96小时。B.标记全部标记过程均在放射性同位素室中进行。从冰箱中取出氚化胸腺嘧啶(H3-TdR)工作液，水浴温热至37℃。96小时后，从培养箱中取出微滴板。将H3-TdR工作液加入一无菌槽中，用配有0-50μl屏蔽吸嘴的12通道手动微量移液管将10μl的H3-TdR工作液分置入微滴板的各孔内。微滴板返回37℃培养箱内再放置24小时。将执行标记的技术人员的日期和姓名首字母记录在样品记录单上。C.收获全部收获过程均在放射性同位素室中进行。用#2铅笔在玻璃纤维滤板(Packard Part#6005416)上标以样品号。启动真空泵，并将干燥烘箱设定在100℃。将与收获器相连的蒸馏水罐装满。加入H3-TdR 24小时后，从培养箱中取出微滴板。将执行收获的技术人员的日期和姓名首字母记录在样品记录单上。
细胞收集器(Packard#C9619型)处于打开位置，暴露出O环，将玻璃纤维滤板放在收集器上，以粗糙面与O环接触。将细胞收集器关好，用清洗盘的蒸馏水湿润滤板。将收集器留置在真空循环(vacuum cycle)(VAC)上。去除微滴板上的盖子，将微滴板置于收集器的探头吸嘴下。缓慢抬高微滴板至收集器探头，直至探头吸嘴触及板底。抽吸培养基，缓慢地以圆周运动方式移动微滴板，藉此用探头吸嘴刷擦孔底。刷擦持续10秒钟。即，保持微滴板与收集器的探头吸嘴接触，连续刷擦抽吸，按住“洗涤”钮10秒钟。抽吸出孔内液体，重复上述刷吸步骤。取下微滴板，在清洗盘中装入甲醇，抬高清洗盘，吸取甲醇，降低清洗盘。
打开收集器，滤板粘贴在上部，继续VAC操作5秒钟。5秒后，关闭VAC，同时从收集器表面取下滤板。将滤板粗面朝上在干燥烘箱内放置10分钟。从烘箱中取出滤板，冷却至室温。D.放射活性的计量全部计量过程均在放射性同位素室中进行。将滤板装入计量盒中，粗面朝上。在滤板上方放置一准直仪，即将滤板固定在位的不锈钢薄板。将该盒装入Packard Matrix9600β粒子放射性计量仪内，并启动Q-气流(含1.3％丁烷的氦气)流入Matrix9600中。按“启动”钮，启动计量程序，对每孔进行3分钟的总放射性计量。将各样品的计量值记录在Matrix9600硬驱中。此外，打印出放射性原计量值的硬拷贝。E.数据的转换将数据从Matrix9600的硬驱中下载到一张3.5时磁盘上。利用Microsoft Excel内的宏将原数据转化成可记录格式。该宏从各数据点中减去微滴板背景值，产生一式三份孔值的平均值，以微滴板对照值设定为100％，将该平均值表示为对照值的百分数。F.数据的分析(标准化)本测试是对胞内半胱氨酸浓度的评价，该浓度是细胞抗氧化能力的一个量度。使用经促细胞分裂原刺激而生长的淋巴细胞，通过比较在氢过氧化枯烯(CuOOH)存在下，加或不加半胱氨酸时淋巴细胞生长反应的差异，由此表示抗氧化功能。CuOOH产生了用于测定患者个体内全面抗氧化状态的氧化应力。在培养基中加入半胱氨酸提供了一种抗氧化剂，它能够修复CuOOH产生的氧化应力造成的损伤。CuOOH和半胱氨酸的剂量分别为300μM和150μM。
个体的淋巴细胞生长以在含有CuOOH，或在含有半胱氨酸+CuOOH的培养基中的生长百分比表示。用Microsoft Excel计算在半胱氨酸+CuOOH中生长相对于在CuOOH中生长的比值。输入了1000多个患者的结果比值，用标准Excel程序进行统计学分析，以确定比值的平均值、中值、范围和方差。将“无关项”，即离差落在±2个标准离差范围外的数据从总体基数中去除。余下的数据用来确定参照点和确立总体参照范围。该总体参照范围在图形上表现为散在图分布。已经测得，半胱氨酸的标准/参考值低于127％(＜127％)；所以，半胱氨酸值等于或高于127％的任何人都归类为缺乏半胱氨酸。G.设备和试剂本发明试验中使用了以下设备层流罩；离心机，Beckman GS-6；细胞计数仪(Coulter T540型)；12通道移液器(5-500μl)；电动吸量泵(Drummond)；无菌的50ml有盖圆锥形塑料试管；12×75mm聚丙烯试管；无菌的15ml有盖圆锥形塑料离心试管；移液管(0-20，0-200，0-100μl量程)；无菌玻璃一次性移液管-5.0ml，10.0ml；试管架和吸气屏蔽吸嘴(0-50μl)。
表V列出了本发明方法中所用的各种试剂及其来源表V试剂盐酸腺嘌呤 Sigma A8751抗生素溶液(PSF) GIBCO 15245-012盐酸精氨酸 Sigma A5131N-乙酰-L-半胱氨酸Sigma A8199d-生物素 Sigma B4501无水氯化钙 Sigma C4901盐酸胆碱 Sigma C1879氢过氧化枯烯 Sigma C0524氰钴胺素(维生素B12) Sigma V2876无水盐酸半胱氨酸 Sigma C1276EDTA二钠 Sigma E4884七水合硫酸亚铁 Sigma F8633叶酸，钙盐 Sigma F7878葡萄糖Sigma G5767葡萄糖溶液(10％) Sigma G3126L-谷胺酰胺Sigma G3126甘氨酸Sigma G7126HEPES，无酸 Sigma H3375L-组氨酸(盐酸单水合盐)Sigma H8125Histopaque(Ficoll/3，5-双(乙酰氨 Sigma 1077-1基))-2，4，6-三碘苯甲酸盐)羟钴胺素(HCI(B12)) Sigma H7126肌醇 Sigma I5125L-异亮氨酸Sigma I2752L-亮氨酸 Sigma L8000L-赖氨酸 Sigma L5626无水硫酸镁Sigma M7506纯甲醇VWRVWR4300-7L-甲硫氨酸Sigma M9625烟酰胺(维生素B3) Sigma N3376D-泛酸钙 Sigma P0290酚红溶液，0.5％PBSSigma P0290L-苯丙氨酸Sigma P2126磷酸盐缓冲液，pH7.4 Sigma P3813植物血凝素，PHA-P Sigma L8754磷酸氢二钾Sigma P3786吡哆素(HCI(维生素B6))Sigma P9755核黄素(维生素B2) Sigma R4500L-丝氨酸 Sigma S4500氯化钠Sigma S9625氢氧化钠，5.0N的溶液 VWRRS4151丙酮酸钠 Sigma P256丙酮酸钠溶液，(100mM) Sigma S8636硫胺素(维生素B1) Sigma T4625L-苏氨酸 Sigma T8625胸腺嘧啶 Sigma T9250[3H]-胸腺嘧啶ICN24066L-色氨酸 Sigma T0254L-酪氨酸 Sigma T3754L-缬氨酸 Sigma V0500H.溶液所有溶液都是用组织培养级去离子水(tcd H2O)配制的。
1.磷酸盐缓冲液。欲制备磷酸盐缓冲液(PBS)+0.72％葡萄糖(PBS-G)溶液，用去离子水根据包装说明制备PBS。加入足量的10％葡萄糖溶液，达0.72％的最终浓度。溶液经过滤灭菌，保存在冰箱中(2至8℃)。
2.储备液。按以下方法制备浓缩(2X)储备液在去离子水中将(1)23.80gHEPES；(2)14.02g氯化钠；(3)1.05g磷酸氢二钾；(4)0.241g硫酸镁；(5)1.0ml(10μM)盐酸腺嘌呤；(6)30.0ml(100mM)丙酮酸钠；(7)0.5ml 0.5％酚红；(8)5.0ml抗生素混合液；(9)8.0ml 5N氢氧化钠；(10)20.0ml Fe/EDTA(1.0mM FeSO4/0.4mM Na2EDTA)混合。在全部物质都混合充分后，用5N氢氧化钠将pH调节至7.60。加入去离子水令最终体积达1.0L。溶液经0.2μM的滤膜过滤除菌，并保存于4℃的冰箱中。溶液的稳定期为4周。
3.基础液。如下制备用于100％微滴板对照和本发明新方法的基础液过滤后必须使用无菌技术。在层流罩下制备基础液，将表VI所列的各成份混合，并加去离子水至要求的最终体积。溶液经真空除菌过滤进入一无菌瓶中。加入适当体积的PHA储备液。
表VI最终体积基础液(ML)储备液 100ml250ml 500ml 1000ml 1500ml 2000ml2X储备液(ml) 50 125 250 500 750 1000硫胺素(B1)储备液(μl) 10 2550 100 150 200核黄素(B2)储备液(μl) 10 2550 100 150 200烟酰胺(B3)储备液(μl) 10 2550 100 150 200吡哆素(B6)储备液(μl) 10 2550 100 150 200羟钴胺素(B12)储备液(μl)10 2550 100 150 200亚叶酸(Folinic)第二储备液(μl) 10 2550 100 150 200生物素储备液(μl)10 2550 100 150 200葡萄糖储备液(ml) 0.72 1.8 3.6 7.2 10.8 14.4Cho/Ino储备液(ml)10 2.5 5.0 10.0 15.0 20.0各种氨基酸储备液(ml) 10 2.5 5.0 10.0 15.0 20.0CaCl2储备液(ml) 10 1.25 2.5 5.0 7.5 10.0PHA(ml) 10 0.5 1.0 2.0 3.0 4.0
4.氢过氧化枯烯(CuOOH)储备液。氢过氧化枯烯的保存期很短。自从Sigma购得之日起的保质期为3个月。在从瓶中进行CuOOH的移液时，应知道CuOOH会增加粘度。必须确保液体完全吸到了吸嘴内。为了确保吸嘴充满，吸取时需要较长的时间和较多的注意力。而且，必须将吸嘴擦净以去除吸嘴外的过量CuOOH。同样，必须将CuOOH充分分散。在此程序后，可将该溶液在冰箱条件下(2至8℃)保存，稳定期长达3个月。
就第一CuOOH储备液(1.0M的CuOOH以PBS-G溶液)配制而言，将9.5μl氢过氧化枯烯(CuOOH)与990.5μlPBS-G混合。
经以上过程后，该溶液可在冰箱条件下(2至8℃)保存，稳定期长达3个月。
第二CuOOH储备液(100mM，以PBS-G溶液配制)必须每天在细胞分离前制备，而且不能储存过夜。欲制备第二CuOOH储备液，将200μl第一CuOOH储备液与1800μl PBS-G混合。
就氢过氧化枯烯工作液而言，每日在细胞分离前制备4份工作液。将该溶液加入CuOOH转移板(分开的微滴板)中，用于给患者板上样。该溶液不得储存过夜。工作液为300μM CuOOH将330μl第二CuOOH储备液与4670μl PBS-G混合。
5.胸腺嘧啶(ThY)储备液。如下制备低温胸腺嘧啶(ThY)储备液(1.33mM ThY，0.322g/L)称取0.161g ThY溶解在去离子水中，最终体积为500ml。该溶液用无菌技术经真空抽滤除菌装入一无菌瓶内。将该溶液等分置入50ml的离心管中。欲短期保存，溶液可放在冰箱内(4℃)，稳定期为1个月。欲长期保存，可将溶液冷冻(-70℃)，稳定期为6个月。为了标记细胞，应用胸腺嘧啶工作液稀释放射性胸腺嘧啶(H3TdR)。
为了制备胸腺嘧啶工作液，ThY+3H-TdR，在300ml无菌除气去离子水中加入以下化合物1.15ml 1.33mM ThY(低温)，1.70ml比活性为300μCi/mmol的3H-TdR(ICN part#24066)。一经制成，该溶液可在冰箱条件下(4℃)保存1周。
6.N-乙酰-L-半胱氨酸(NAC)工作液。将0.0702gN-乙酰-L-半胱氨酸(SigmaA8199)溶解在4ml PBS-G溶液中形成最终浓度为0.1M的储备液。将该储备液分成1ml的等份，加入12×75无菌试管内，这些等份可在-70℃的冷冻柜中保存1周。欲制备工作液，可取每份990μl的0.1M NAC储备液加入29.01ml PBS-G溶液中，并充分混合。工作液应用无菌技术真空抽滤除菌装入一无菌瓶中。最后，应在一式三份的测试孔中加入10μl的该溶液。有一点很重要，即必须每天在进行测试前新鲜制备N-乙酰-L-半胱氨酸工作液。
本说明书中提及的任一专利或出版物都反映了本发明所属领域内技术人员的水平。而且，本发明对这些专利或出版物进行了同等程度的参考和引用，如同具体而单独地指出各个出版物为本文所引用和参考。
本领域技术人员很容易理解，本发明很适合实施，可达到所述的目的和获益，以及隐含于其间的那些目的和利益。以上实施例，连同本文所述的方法、程序、处理方法、分子和特定化合物都提供了优选实施方式，它们是示范性的，而不是要限定本发明的范围。本领域技术人员对其中作出的改变和其它用途都包含在权利要求范围所明确的本发明宗旨内。
权利要求
1.一种用于测定淋巴细胞内谷胱甘肽胞内功能水平和进行所述淋巴细胞抗氧化功能生物化学分析的细胞培养基，所述的培养基包含含有以下成份的无血清缓冲液糖，选自葡萄糖和生物学上能够在所述淋巴细胞内产生葡萄糖的化合物；生物可利用形式的泛酸，胆碱或能够在所述淋巴细胞内产生胆碱的生物可利用形式的物质；生物可利用形式的无机离子，包括氯、磷酸根、钙、镁、钾、钠和铁；L-丁硫因-[S.R.]-亚砜亚胺(L-Buthionine-[S.R.]-Sulfoximine)；去离子水；和含量能有效刺激所述淋巴细胞的促细胞分裂原；所述无血清缓冲液的pH约6.8至7.6；所述细胞培养基的特征在于能够有效测定所述淋巴细胞内谷胱甘肽的胞内功能和生物化学分析所述淋巴细胞的抗氧化功能。
2.根据权利要求1所述的细胞培养基，其中所述的培养基补充了选自以下物质组的补充营养素生物可利用形式的氨基酸和维生素，在所述补充营养素中删除了待测的某营养素、或让此待测营养素以有限量或抑制量存在其中。
3.根据权利要求1所述的细胞培养基，其中所述的维生素选自生物素、叶酸或生物可利用形式的叶酸、烟酰胺或烟酸、核黄素、硫胺素、维生素B6和维生素B12，以及能够在细胞内生成以上物质的化合物；其中所述的氨基酸或生物学上能够生成这些氨基酸的化合物包括L-精氨酸、L-半胱氨酸、L-谷胺酰胺、甘氨酸、L-组氨酸、L-异亮氨酸、 L-亮氨酸、L-赖氨酸、L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸和L-缬氨酸，氨基酸成组存在，各自的量都不超过抑制浓度。
4.根据权利要求1所述的细胞培养基，其中所述的L-丁硫因-[S.R.]-亚砜亚胺以约5μM至约500μM的浓度存在。
5.根据权利要求1所述的细胞培养基，其中补充了选自以下物质组的一种或多种刺激性营养素丙酮酸、腺嘌呤和肌醇，或能够在所述淋巴细胞内产生上述物质的化合物，它们的浓度能够激发几乎是最大强度的反应。
6.一种测定个体内谷胱甘肽胞内功能水平和生物化学分析细胞抗氧化功能的方法，它包括以下步骤将所述个体的淋巴细胞接种到权利要求1所述的细胞培养基中；培养接种后的细胞培养基；和将淋巴细胞的反应与个体对照组淋巴细胞的平均反应进行比较。
7.一种用于测定人淋巴细胞内半胱氨酸胞内功能水平和进行人淋巴细胞内抗氧化功能生物化学分析的细胞培养基，所述的培养基包含含有以下成份的无血清缓冲液糖，选自葡萄糖或生物学上能够在所述淋巴细胞内产生葡萄糖的化合物；生物可利用形式的泛酸，胆碱或能够在所述淋巴细胞内产生胆碱的生物可利用形式的物质；生物可利用形式的无机离子，包括氯、磷酸根、钙、镁、钾、钠和铁；氢过氧化枯烯；去离子水；N-乙酰-L-半胱氨酸和和含量能有效刺激所述淋巴细胞的促细胞分裂原；所述无血清缓冲液的pH约6.8至7.6；所述细胞培养基的特征能够有效测定营养缺陷、不足和失调，并能够生物化学分析淋巴细胞的抗氧化功能。
8.根据权利要求7所述的细胞培养基，其中所述的培养基补充了选自以下物质组的补充营养素生物可利用形式的氨基酸和维生素，在所述补充营养素中删除了待测的某营养素、或让此待测营养素以有限量或抑制量存在其中。
9.根据权利要求7所述的细胞培养基，其中所述的维生素选自生物素、叶酸或生物可利用形式的叶酸、烟酰胺或烟酸、核黄素、硫胺素、维生素B6和维生素B12，以及能够在细胞内生成以上物质的化合物；其中所述的氨基酸或生物学上能够生成氨基酸的化合物包括L-精氨酸、L-半胱氨酸、L-谷胺酰胺、甘氨酸、L-组氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸、L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸和L-缬氨酸，氨基酸成组存在，各自的量都不超过抑制浓度。
10.根据权利要求7所述的细胞培养基，其中所述的氢过氧化枯烯以约5μM至约500μM的浓度存在。
11.根据权利要求7所述的细胞培养基，其中补充了选自以下物质组的一种或多种刺激性营养素丙酮酸、腺嘌呤和肌醇，或能够在所述淋巴细胞内产生上述物质的化合物，它们的浓度能够激发几乎是最大强度的反应。
12.一种测定个体中半胱氨酸胞内功能水平和生物化学分析细胞抗氧化功能的方法，它包括以下步骤将所述个体的淋巴细胞接种到权利要求7所述的细胞培养基中；培养接种后的细胞培养基；和将淋巴细胞的反应与个体对照组淋巴细胞的平均反应进行比较。
全文摘要
本发明提供了一种培养淋巴细胞的培养基和方法,用于测定人淋巴细胞内谷胱甘肽或半胱氨酸的细胞内浓度,为个体应付氧化性应力(oxidative press)的能力提供生化分析。所述的培养基是一种无血清缓冲溶液,pH约为6.8至7.6,其中含有葡萄糖或能够在淋巴细胞内产生葡萄糖的化合物、泛酸、胆碱或能够在淋巴细胞内产生胆碱的物质、氯、磷酸根、钙、镁、钾、钠和铁等无机离子、L－丁硫因－[S.R.]－亚砜亚胺(L－Buthionine－[S.R.]－Sulfoximine)、去离子水和刺激淋巴细胞的促细胞分裂原。在测定半胱氨酸浓度时,该培养基另外含有N－乙酰－L半胱氨酸和氢过氧化枯烯。所述方法是如下进行的:将该培养基与某个体的淋巴细胞一起接种,培养培养基中的淋巴细胞,并将淋巴细胞的反应与个体对照组淋巴细胞的平均反应进行比较。
文档编号C12N5/02GK1268977SQ97197585
公开日2000年10月4日 申请日期1997年9月3日 优先权日1996年9月3日
发明者J·F·克劳福德 申请人:研究发展基金会