专利名称：用于工业发酵生产赤霉素a的制作方法
技术领域：
本发明涉及一株新的用于工业发酵生产赤霉素A4及A7的菌株，更具体地，本发明涉及一株新的能发酵产生高水平赤霉素A4及A7的藤仓赤霉菌(Gibberella fujikuroi)菌株，此菌株被命名为y-08菌株。
众所周知，赤霉素类物质是植物生长调节剂，它有很多同系物，目前在自然界中已发现84种，根据发现的早晚，这些同系物被命名为赤霉素A1(GA1)、GA2、GA3、GA4……GA84。其中GA3、GA4和GA7的结构式如下所示
不同的赤霉素同系物对植物的生长调节作用是不同的，如GA3主要是促进植物枝叶的生长；GA4、GA7都具有促进植物果实细胞的伸长作用，但对花芽分化和植物其它功能又有所不同。目前已实现大量生产的是GA3，而GA4+7(GA4和GA7的混合物)仅在美国有少量生产，年总产量不超过1吨。GA4+7在美国主要用于苹果使果形变高，萼部五棱突出，称之为“高庄苹果”或“蛇果”。近几年来，本发明人在国内的少量试验表明GA4+7除了对苹果有明显的改变果形效果外，对梨能增产20-50％，并能使之提早成熟半个月，对油菜增产20％，个别增产70％，对水稻、小麦等能增产10-20％，这些结果显示出GA4+7对农作物的巨大增产潜力，是前景宽广的新产品。
目前已知产生这些赤霉素的有植物和微生物，由于微生物生长速度快，可以通过一些生物技术手段较快地提高代谢产物的产量，因此迄今为止商品赤霉素都由微生物生产。不同的微生物种和菌株产生的赤霉素种类和比例是不同的，因此工业生产某种赤霉素时，需要对微生物进行选育，不仅要使目的赤霉素产量高，其它赤霉素产量低，而且要求工业生产简便。迄今为止，仅有少量生产的GA4+7是采用GA3型的菌种，所谓GA3型菌种，是指在正常的环境条件下该菌种以产生GA3为主，只有强制改变环境的pH条件(如pH6-7)，有时伴随温度的升高(如从28℃升至32-34℃)才能使分泌到发酵液中的GA4、GA7增加，而抑制GA3的积累。由于这种工艺使生产菌处于非正常状态，虽然能增加GA4、GA7的比例，但GA4+7的产量仍很低，并且GA3至少还占1/3(例见真菌学报14(4):302-309,1995)。
因此，不少研究者为获得GA4、GA7的专用菌种作了许多工作，其中Wilhelm Rademacher等(Bioche.and Biophy.Res.Comm.91(1),1979)发现木薯疮痂病的病原菌Sphaceloma monihoticola只产生GA4，但是GA4的产量太低，仅为400μg/L发酵液，比通常的出发菌株几乎低500倍，要求达到工业生产的最低水平难度很大，至今未见进一步报道。另外一项研究报告(B.Bruchner等，Applied Microbiol.Biotechnol.75(3),1991)公开了一株藤仓赤霉菌的突变株14/141,该突变株GA3微生物合成的最后一步被阻断，因而代谢产物中积累GA7(微生物合成赤霉素的其中一条途径是→→→GA4→GA7→GA3)。这一突变株的GA7产量未见报道，即使其GA7产量高，但是由于其不能积累GA4，而目前已知GA4的作用大于GA7，且需要量大，因此仍需要开发能发酵产生高水平GA4和GA7的菌株。
因此，本发明的目的在于提供一株新的能发酵产生高水平赤霉素A4及A7的菌株，本发明的菌株被命名为藤仓赤霉菌菌株y-08，其能用于大规模工业化生产GA4+7。
本发明的另一目的在于提供一种大规模发酵培养产生高水平赤霉素A4及A7的方法，所述的方法使用本发明的y-08菌株，简便易行。
具体地说，本发明涉及一株新的藤仓赤霉菌菌株y-08，其发酵产生高水平的赤霉素A4和A7，同时赤霉素A3水平较低。本发明的藤仓赤霉菌菌株y-08已于1997年10月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC NO.0325。y-08菌株是从数百株野生藤仓赤霉菌中筛选，并经多种化学物理诱变处理培育而成。该菌株菌丝呈白色，略产紫色色素，能产生卵圆形至长圆形小分生孢子。该菌株经每月传代一次，目前共传代12代，从菌丝生长速度、产色素情况、产孢情况、特别是产GA4和GA7情况看，表现都十分稳定。另外，经测定，y-08菌株的致病性已完全丧失。
藤仓赤霉菌也称水稻恶苗病菌，得到这种微生物的最好途径是从水稻恶苗病植株中分离，因此，本发明人采用的原始出发菌株是采自浙江农村水稻田的恶苗病植株中的编号为46的菌株。该46菌株产生深紫色素，有大分生孢子和小分生孢子，其经多次紫外诱变和亚硝基胍诱变筛选，终于获得一株GA7渗漏型变异株，命名为y-08。经测定y-08菌株有很强的发酵产生赤霉素A4+7的能力，而GA3的产量很低。
本发明还涉及一种大规模发酵生产赤霉素A4和A7的方法，包括如下步骤(1)将本发明的y-08菌株接种在摇瓶中的液体种子培养基中，28℃振荡培养约48小时得到一级种子培养物；(2)将一级种子培养物以0.1-2％的比例(体积比)接种入种子罐中的液体种子培养基中，28℃通气搅拌培养约30小时，得到二级种子培养物；(3)将二级种子培养物以5-10％的比例(体积比)接种入发酵罐中的发酵培养基中，于28℃通气搅拌培养150-168小时，收集发酵液；(4)过滤发酵液，用大孔吸附树脂柱吸附，用丙酮洗脱吸附树脂柱，浓缩得到含赤霉素类物质的浓缩液；(5)将浓缩液pH调整为约pH6，加乙酸乙酯萃取，浓缩乙酸乙酯萃取液得到GA4结晶和母液；(6)将步骤(5)提取GA4后的萃余液的pH调节至约pH4.4-4.5，加乙酸乙酯萃取，浓缩乙酸乙酯萃取液得到GA7结晶和母液。
另外，在本发明所述的方法中步骤(3)还可变化为将接种后的发酵培养基于28℃培养48小时后，加入CaCO3悬浮液以调整发酵液pH至约pH6，并将罐温升至34℃，继续培养约120小时，收集发酵液。
本发明中y-08菌株发酵所用的种子培养基和发酵培养基可以是任何常规用于藤仓赤霉菌发酵的培养基，例如种子培养基可为1％淀粉、1.5％豆饼粉、1％葡萄糖、0.05％(NH4)2SO4、0.12％KH2PO4、0.1％MgSO4,pH自然。发酵培养基可为7％淀粉、0.9％豆饼粉、0.3％花生饼粉、0.05％(NH4)2SO4、0.08％KH2PO4、0.05％MgSO4、0.001％硼酸，pH5.8。
在获得y-08菌株之前，GA4+7的发酵是应用GA3型生产菌进行，为了抑制GA3的积累，必须采取二个措施一是调节pH，即将发酵培养基的pH从发酵48小时时的pH3.5-4.0人为地升至pH6.7左右，这样就会减少GA3产量，增加GA4+7产量。二是升高温度，即发酵48小时后，温度由28℃升至32-34℃，这也对积累GA4+7有利。但是由于调整pH和升高温度对藤仓赤霉菌都不是正常的生长环境，所以导致藤仓赤霉菌非常容易自溶，GA4+7总产量也不高。而y-08菌株可以在正常生长环境条件下积累GA4+7，其发酵产生赤霉素A4、A7及A3产物的比例约为70-80∶10-13∶7-20(重量比)，使得大规模工业发酵生产GA4+7成为可能。而当将y-08菌株在如上所述的pH调整和变温处理条件下发酵时，其GA3的比例有所下降，GA7的比例增加，例如，赤霉素A4、A7和A3产物的比例可达60-70∶25-33∶5-7(重量比)。
本发明的y-08菌株有如下独特的优点
首先，本发明的y-08菌株有很强的产生小分子孢子的能力，由于小孢子是单细胞的，其用于诱变育种很有利。目前现有的GA3型生产菌株基本上都已丧失产孢能力，整个世代都是菌丝，而它的菌丝细胞是多核的，这给育种工作带来很大难度。
其次，本发明的y-08菌株生产周期短，一般在7-8天，而GA3型菌株生产周期约为10-12天，因此应用y-08菌株生产成本低，设备利用率高。
第三，本发明的y-08菌株产量高，而且有很大的高产潜力，目前中试结果的GA4、GA7产量可达930μg/ml发酵液(HPLC测定)，而应用GA3型菌株生产时，GA4+7产量只有400-500μg/ml发酵液。
第四，本发明的y-08菌株使得提取产物容易，产物结晶率高，这是因为y-08菌株的发酵液中GA3比例低，极易清除，而且由于GA4+7产量高，结晶率可高达总收率的70％。
以下将参照实施例详细描述本发明，但应理解实施例仅仅是说明性的，而非限制本发明。实施例1诱变筛选y-08菌株原始出发菌株是采自浙江农村水稻田的恶苗病植株中的编号为46的野生藤仓赤霉菌菌株，其产GA4+7为90μg/ml，产GA3为52μg/ml。整个诱变过程为约11次紫外线处理(采用15W紫外灯，距离30cm，每次处理5分钟)、3次亚硝基胍固体点种处理、1次钴60照射(剂量为20000rad)、1次亚硝酸处理(浓度为0.1M，处理3分钟)。最后得到一株突变株，命名为y-08。该菌株菌丝呈白色，略产紫色色素，能产生卵圆形至长圆形小分生孢子。实施例2 y-08菌株发酵产生赤霉素的小试研究A、发酵将实施例1获得的y-08菌株接入6个装有种子培养基(1％淀粉、1.5％豆饼粉、1％葡萄糖、0.05％(NH4)2SO4、0.12％KH2PO4、0.1％MgSO4)的锥形瓶中(3000ml容积的锥形瓶装1000ml培养基),28℃在回转式摇瓶机上以180rpm振荡培养48小时作为种子培养物。将200升容积的发酵罐装入140升发酵培养基(7％淀粉、0.9％豆饼粉、0.3％花生饼粉、0.05％(NH4)2SO4、0.08％KH2PO4、0.05％MgSO4、0.001％硼酸，pH5.8),120℃灭菌30分钟，冷却至28℃时接入种子培养物(6000ml)，通入无菌空气并搅拌培养168小时。之后发酵液直接取全样经高效液相色谱测定，测得赤霉素GA4+7产量为788.2μg/ml发酵液，GA3产量为72μg/ml发酵液。B、发酵液的提取提取方法详见本发明人的中国专利申请公开CN1111286A。简而言之，提取方法包括如下步骤将上述得到的发酵液经过滤去除菌丝体和固形物得到过滤液；将过滤液通过用大孔吸附树脂RPY-2(扬州制药厂)填充的柱，过滤液中的赤霉素类物质被吸附，而大量的色素、蛋白质、糖类、矿物质等随废水而流出；用75％丙酮以10L/h的流速洗脱柱，从柱上洗脱下赤霉素类物质，减压浓缩丙酮洗脱液，得到浓缩液；用6NHCl或H2SO4调节浓缩液的pH至pH6，加入1.2倍体积的乙酸乙酯萃取，浓缩乙酸乙酯萃取液得到GA4结晶和母液；将萃余液调节pH至pH4.4-4.5，加入1.2倍体积的乙酸乙酯萃取，浓缩乙酸乙酯萃取液得到GA7结晶和母液；将提取GA7后的萃余液调节pH至pH2.0-2.2，加1倍体积的乙酸乙酯萃取，浓缩乙酸乙酯萃取液，得到GA3结晶和母液。经过如上提取处理，上述A步骤中得到的发酵液中GA4+7的收率为57％(62.9克)，其中结晶率为62％(39克)，经高效液相色谱测得GA4+7结晶中GA4所占比例为90.69％(35.37克)，GA7为6.31％(2.46克)。进一步分离纯化可以得到GA4、GA7单独结晶。而得到的GA4+7母液为220ml(析成纯品23.9克)，其中GA4为19.36克，GA7为4.54克。得到GA3母液50ml(析纯5克)。合计得到54.73克GA4,7.0克GA7,5克GA3,GA4∶GA7∶GA3的重量比约为80∶10.2∶7.3。实施例3 y-08菌株较大规模发酵产生赤霉素的研究如实施例2所述摇瓶制备一级种子培养物，将2000ml得到的一级种子培养物接种入装有1400升种子培养基(组成同实施例2所述)的2000升容积的种子发酵罐中，28℃培养30小时作为二级种子培养物待用。将25000升容积的发酵罐装入18000升发酵培养基(组成同实施例2所述),121℃灭菌30分钟，冷却至28℃时接入种子发酵罐中的二级种子培养物，通入无菌空气并搅拌，28℃培养154小时。而后发酵液直接取全样经高效液相色谱测定，测得赤霉素A4+7产量为892μg/ml发酵液，GA3产量为95μg/ml发酵液。并如实施例2步骤B所述进行提取处理之后，测得GA4+7的收率为70.2％(11270克)，其中结晶率为61.3％(6910克)，经高效液相色谱测得GA4+7结晶中GA4所占比例为85.1％(5871克),GA7为5.8％(399克)。得到的44升母液(析纯4360克)中的GA4含量为3548克，GA7含量为812克。另外，得到GA3结晶和母液923.4克。因此GA4、GA7与GA3的重量比约为80∶10.3∶7.8。本实施例说明本发明的y-08菌株适于大规模发酵生产GA4+7。实施例4改变发酵液pH值和发酵温度对y-08菌株产生赤霉素类物质的影响发酵步骤如实施例3所述，只是发酵培养基在25000升容积发酵罐于28℃通气培养48小时后，加入CaCO3悬浮液调整pH至约pH6，并将罐温升至34℃，继续培养120小时。之后发酵液取全样检测，测得赤霉素GA4+7产量为930μg/ml发酵液，GA3产量为75μg/ml发酵液。如实施例2步骤B所述进行提取处理之后，测得GA4+7的收率为71.0％，其中结晶率为59.7％，经高效液相色谱测得GA4+7结晶中GA4所占比例为63.2％,GA7为28.5％。
权利要求
1.藤仓赤霉菌菌株y-08，其菌丝呈白色，略产紫色色素，能产生卵圆形至长圆形小分生孢子，该菌株于1997年10月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNO.0325。
2.如权利要求1所述的藤仓赤霉菌菌株，其特征在于，所述的菌株在藤仓赤霉菌的正常发酵条件下发酵产生赤霉素A4、A7及A3产物的比例为70-80∶10-13∶7-20(重量比)。
3.一种大规模发酵生产赤霉素A4和A7的方法，包括如下步骤(1)将权利要求1的菌株接种在摇瓶中的含有1％淀粉、1.5％豆饼粉、1％葡萄糖、0.05％(NH4)2SO4、0.12％KH2PO4、0.1％MgSO4的液体种子培养基中，28℃振荡培养约48小时得到一级种子培养物；(2)将一级种子培养物以0.1-2％(体积比)的比例接种入种子罐中的种子培养基中，28℃通气搅拌培养约30小时，得到二级种子培养物；(3)将二级种子培养物以5-10％(体积比)的比例接种入发酵罐中的含有7％淀粉、0.9％豆饼粉、0.3％花生饼粉、0.05％(NH4)2SO4、0.08％KH2PO4、0.05％MgSO4、0.001％硼酸，pH5.8的发酵培养基中，于28℃通气搅拌培养约150-168小时，收集发酵液；(4)过滤发酵液，用大孔吸附树脂柱吸附，用丙酮洗脱吸附树脂柱，浓缩得到含赤霉素类物质的浓缩液；(5)将浓缩液pH调整为约pH6，加乙酸乙酯萃取，浓缩乙酸乙酯萃取液得到GA4结晶和母液；(6)将步骤(5)提取GA4后的萃余液的pH调节至约pH4.4-4.5，加乙酸乙酯萃取，浓缩乙酸乙酯萃取液得到GA7结晶和母液。
4.如权利要求2所述的方法，其中步骤(3)用如下步骤取代将接种后的发酵培养基于28℃培养48小时后，加入CaCO3悬浮液，调整pH至约pH6，并将罐温升至34℃，继续培养约120小时，收集发酵液。
全文摘要
本发明涉及一株新的藤仓赤霉菌菌株,命名为y－08,其菌丝呈白色,略产紫色色素,能产生卵圆形至长圆形小分生孢子,所述的菌株在藤仓赤霉菌的正常发酵条件下发酵产生赤霉素A
文档编号C12P27/00GK1222575SQ9810020
公开日1999年7月14日 申请日期1998年1月5日 优先权日1998年1月5日
发明者颜方贵, 林锦湖 申请人:中生北方生物工程开发研究所