专利名称：一种新型的灭活病毒的方法
技术领域：
本发明概括地涉及一种新型的灭活病毒的方法，更具体而言是涉及一种使用水溶性的萘类内过氧化物灭活病毒方法，其中是用水溶性萘类内过氧化物处理人或动物来源的全血、细胞制剂、全血浆、血浆衍生物以及其他生物制剂以灭活其中之病毒。
目前用于生物制剂病毒灭活的主要工业方法有巴斯德法利用病毒分子与所需生产的生物制剂的分子间的热稳定差异，在加热条件下使病毒分子失活并尽可能大地保护生物制剂的生物活性，其通常的液相反应条件为60℃下加热10小时，而且在反应介质中需要添加稳定剂，巴斯德法对所要制备的生物制剂的副作用较大，Solvant-Detergent(S.D.)法利用S.D.试剂系统的亲油性，与脂胞膜病毒产生亲和作用，从而使其失活。SD法广泛地应用于从血浆中生产凝血因子制品，但对非脂胞膜病毒完全没有作用。
膜过滤法利用病毒分子与所需制备之生物制品分子在流体力学尺寸上的差异，使可能存在的病毒大分子从生物制品中分离出来。膜过滤法是目前世界上工业生产中除去病毒的热点方法之一。但是，该方法主要是作为一种并用的方法，用于加强分子尺寸较小的蛋白质制剂的病毒安全性，而且其生产成本非常高。
低pH法利用病毒分子与所需制备之生物制品分子在酸性介质中的稳定性差异，使可能存在的病毒大分子(酸稳定性较差)失活。该方法仅对脂胞膜病毒有效，在工业生产中主要用于丙球蛋白的病毒灭活。由于是在酸性介质中进行，该方法对其他生物制剂的副作用较大。
另外，上述的病毒灭活方法都都有一个共同的缺点，即不适用于细胞制品。
近来，在病毒灭活领域中单氧传递体倍受瞩目，这是由于单氧(singlet molecularoxygen)作为亲电子的试剂，可攻击电子丰富的基团如双键、氨、硫或酚，因此能改变富含这些基团的生物大分子，例如病毒分子的结构，使其失去生物活性。
目前，单氧通常是在一种染料或光敏物质存在的情况下，例如卟啉衍生物、酞菁(染料)、金线桃素或亚甲基兰，由光作用于氧而产生的。然而，在光动力学的作用中，除单氧外还产生其他形式的激活态氧(激活羟基OHx、阴超氧基O2x-、激活过氧基ROOx)等。这些非特异基团能迭加于单氧引发的反应上，使可能发生的现象变得复杂。此外，利用特定波长的光线对生物制剂进行工业规模的处理，尚有技术上的困难，如光照的均匀性，有待克服。
本发明的目的是避免现有之病毒灭活技术中的缺陷，提供一种灭活效率高、生产成本低、并且对生物制剂的生物活性影响小的病毒灭活方法。
本发明的发明者对灭活病毒的方法进行了广泛且深入的研究和调查，其结果是发现，可通过以下的方法实现病毒的灭活用浓度为2-200mM的单一萘类内过氧化物或它们的混合物在15-80℃下与待处理的生物制剂接触5-200分钟。相比于已知的病毒灭活方法，根据本发明的方法效率更高，灭病毒谱更广，例如可用于处理人或动物来源的全血、细胞制剂、全血浆、血浆衍生物以及其他生物制剂，而且操作简单，生产成本低，对生物制品之生物活性的副作用更小。
简单地热分解水溶性萘类内过氧化物，即可按下式产生纯单氧
由上式可以看出，热分解过程中仅产生二种物质，即氧和再生萘，其中单分子氧大约占50％(其它氧以基础态释放)。在萘类内过氧化物这种特殊情况下，热分解能在大多数生物制品生物活性稳定的温度范围内进行。单氧可以在室温到80℃之间产生，而且热分解服从热力学第一原理。因此，热分解能产生可检测量的纯单分子氧，而单分子氧如前所述具有杀菌、杀病毒或致病毒突变的作用。
而本发明就是基于以上发现，用浓度为2-200mM的单一萘类内过氧化物或它们的混合物在15-80℃下与待处理的生物制剂接触5-200分钟，由此提供灭活其中之病毒的方法。所述的生物制剂包括人或动物来源的全血、血细胞制剂、全血浆、血浆衍生物以及其他生物制剂。
血浆制品包括例如全血浆、白蛋白、球蛋白等。血细胞制剂包括例如红细胞制剂、白细胞制剂、血小板等。其他生物制剂包括基因工程产品，如基因工程红细胞增长素、基因工程八因子等；疫苗，如日本脑炎病毒、狂犬病毒、腮腺炎病毒(制造疫苗用病毒的减毒)。
本发明的方法还可应用于其它以水溶液形式注射的药物以及其它在水溶液环境中的病毒灭活。
内过氧化物与生物制剂的接触时间优选在45-150分钟之间，温度优选为30-60℃。
为用于处理生物制剂，根据本发明的内过氧化物必须有相对较大的水溶性，因此在初始的萘类衍生物上就必须至少有一个基因被水溶性基团取代(R1至R8中任一个)，而且固定于芳香核上的水溶性基团应对单氧或单氧源不敏感。在此所用术语“单氧源”是指为产生内过氧化物所必须的化学的或光化学的物质。
在萘类衍生物的结构中，能符合上述要求的功能基团较多，例如有羟基、羧化物、酰胺、磷酸盐、硫酸盐、磺酸盐。但是这些基团很难能直接固定到芳香核，因为电子攻击作用减弱核对单氧的反应性，使内过氧化物的产生变得非常困难。为避免这些困难，可先在萘环上连接一个小烷链，然后在该烷链上再连接亲水性基团，使萘的亲水部分与萘环分开。
另外，其它替代R1至R8的基团可以是单独的氢原子、烷链、疏水基团或水溶性基团。R基团的多样性能使特定的萘类衍生物对某个生物作用点具有特别的亲和力或增加它们对脂质膜的通透性，从而达到对生物制剂中的病毒或细菌分子进行选择性灭活的目的。
可用于本发明的其他水溶性萘类内过氧化物的例子有
其中，R2、R3、R5、R6、R7和R8=H。
在本发明的方法中，单一的内过氧化物或内过氧化物的混合物即可作为生物环境中的单氧发生源。
为改善生物制品功能活性的保存，最好按下述方法稳定血浆及其衍生物、或其他蛋白制剂使用合适的缓冲液使pH和渗透压维持在该生物制剂有效成分稳定的范围内，通常pH维持在4.0-8.5之间，渗透压在10-300mOs/kg之间。所述的缓冲液有碳酸盐、Tris-HCl、磷酸盐、柠檬酸盐、氯化物或负载不同阴或阳离子的萘类衍生物的混合物。
浓缩红细胞或血小板则维持pH约为6.0、渗透压约为300mOsm/kg，可使用碳酸盐、磷酸盐、柠檬酸或它们的混合物。以上所指的盐主要是上述酸的钠盐。
在本发明的方法中，如果需要还可添加稳定剂。例如，生物制剂可以用如糖、多元醇、氨基酸、二价离子或联合应用这类物质作为稳定剂。这些稳定剂的例子如下右旋葡萄糖、庶糖、葡萄糖、果糖、甘露糖醇、甘油、甘氨糖、精氨酸、赖氨酸、氯化镁、氯化钙或肝素。
根据本发明的方法，通过使用萘类内过氧化物，可实现人或动物来源的全血、细胞制剂、全血浆、血浆衍生物以及其他生物制剂中的病毒的灭活。而且本发明的方法还可灭活多种细胞外和细胞内的病毒，不管是DNA还是RNA病毒，有膜病毒还是裸病毒。
以下将通过实施例和具体的生物实验对本发明作进一步的描述，本发明的上述优点以及其他的优点和特征将变得更为明显。实施例1水溶性萘类内过氧化物的灭病毒作用0.9ml模式病毒悬液置于37℃水浴中，待温度平衡于37℃后，分别加入1ml表1中所列的萘类内过氧化物，使其浓度得到20mM，混合液在37℃反应150分钟。然后测定混合液中病毒滴度的减少，结果见表1。
表1．水溶性萘类内过氧化物的病毒灭活作用
注-表示未进行该项实验实施例2基因工程红细胞增长素(rEPO)的病毒灭活处理0.8ml基因工程红细胞增长素(rEPO)(浓度2000IU/ml,pH7.0，渗透压300mOsm/kg，含柠檬酸钠、磷酸钠、右旋葡萄糖等稳定剂)，加入等体积的模式病毒悬液(pH7.0，渗透压300mOsm/kg，含柠檬酸钠、磷酸钠、右旋葡萄糖等稳定剂)。混合液置于37℃水浴中，待温度平衡于37℃后，加入0.4ml萘类内过氧化物溶液(浓度40mM，温度1-2℃,pH7.0，渗透压300mOsm/kg，含柠檬酸钠、磷酸钠、右旋葡萄糖等稳定剂)。混合液在37℃反应150分钟。然后测定混合液中病毒滴度的减少，结果见表2。
表2．利用萘类内过氧化物对rEPO溶液进行病毒灭活处理
所用萘类内过氧化物具有明显的灭病毒作用，但对基因工程红细胞增长素(rEPO)生物活性无负作用，见表3表3．萘类内过氧化物灭病毒反应中rEPO生物活性的稳定性
实施例3人全血浆的病毒灭活处理6.0ml人全血浆(HBV、HCV、HCMV及HIV-1抗体阴性，蛋白质浓度54mg/ml,pH7.5，渗透压300mOsm/kg，含肝素、柠檬酸三钠、葡萄糖酸钙、赖氨酸、精氨酸等稳定剂)，加入1ml的模式病毒悬液(pH7.5，渗透压300mOsm/kg，含肝素、柠檬酸三钠、葡萄糖酸钙、赖氨酸、精氨酸作为稳定剂)。混合液置于37℃水浴中，待温度平衡于37℃后，加入3ml萘类内过氧化物溶液(浓度40mM，温度1-2℃,pH7.5，渗透压300mOsm/kg，含肝素、柠檬酸三钠、葡萄糖酸钙、赖氨酸、精氨酸作为稳定剂)。混合液在37℃反应150分钟。然后测定混合液中病毒滴度的减少，结果见表4。
表4．利用萘类内过氧化物对人全血浆进行病毒灭活处理
所用萘类内过氧化物具有明显的灭病毒作用，但对人全血浆生物活性无负作用。例如，全血浆经上述的病毒灭活处理时，主要的凝血因子(五因子-FⅤ，七因子-FⅦ，八因子-FⅧ，九因子-FⅨ及纤原)的生物活性保持稳定，见表5
表5．萘类内过氧化物灭病毒反应中人全血浆主要组分生物活性的稳定性<
实施例4浓缩红细胞的病毒灭活处理5ml浓缩红细胞(血容积36-37％,pH6.0，渗透压300mOsm/kg，含柠檬酸盐、磷酸盐、右旋葡萄糖作为稳定剂)经离心处理(2500rpm,5min)，弃去上清，加入等体积的模式病毒悬液(pH6.0，渗透压300mOsm/kg，含柠檬酸盐、磷酸盐、右旋葡萄糖作为稳定剂)。混合液置于37℃水浴中，待温度平衡于37℃后，加入2ml小表6中所示的萘类内过氧化物溶液(40mM,1-2℃,pH6.0，渗透压300mOsm/kg，含柠檬酸盐、磷酸盐、右旋葡萄糖等稳定剂)。混合液在37℃反应150分钟。然后测定混合液中病毒滴度的减少，结果见表6。
表6．浓缩红细胞的病毒灭活处理<
p><p>所用萘类内过氧化物具有明显的灭病毒作用，但其中DHPNO2对红细胞生物活性的作用非常小，见表7。
表7．人红细胞经历萘类内过氧化物灭病毒反应后的稳定性
含NDPO2的浓缩红细胞在10天后呈明显的不稳定，而经DHPNO2处理的浓缩红细胞在15天上仍呈明显的活性稳定。实施例5人血浆衍生物的病毒灭活处理如下表8所述的0.4ml人血浆衍生物(HBV、HCV、HCMV及HIV-1抗体阴性，渗透压300-400mOsm/kg，含公知的稳定剂)，加入0.1ml的模式病毒悬液。混合液置于37℃水浴中，待温度平衡于37℃后，加入0.5ml萘类内过氧化物溶液(浓度40mM，温度1-2℃)。混合液在37℃反应150分钟。然后测定混合液中病毒滴度的减少，结果见表8。
表8．利用萘类内过氧化物对人血浆衍生物进行病毒灭活处理
所用萘类内过氧化物具有明显的灭病毒作用，但对人血浆衍生物生物活性无负作用，见表9
表9．萘类内过氧化物灭病毒反应中人血浆衍生物生物活性的稳定性
因此，根据本发明的萘类内过氧化物及灭活方法具有以下优点1、可处理的生物制品的范围广不仅可处理不含细胞的制剂，如血浆及血浆衍生物、基因工程蛋白质等，亦可处理含有细胞的制品，如全血、人血细胞产品等。
2、可灭活的病毒谱广不仅对胞膜病毒有灭活作用，还对非胞膜细胞病毒有灭活作用。
3、灭活病毒的反应条件在工业规模上简单易行其核心反应条件为制品在选定的萘类内过氧化物存在条件下的适度加温，例如在37℃下反应25小时。
4、灭活病毒添加剂易于排除萘类内过氧化物为小分子物质，易于通过物理方法(如UF)与所需制备的生物大分子分离开来。
5、生物制品中有效生物活性保持好由于反应条件温和而且反应的选择性强，灭活病毒反应对生物制品中有效成分的副作用保持在最低水平。
权利要求
1.一种病毒的灭活方法，其中，用浓度为2-200mM的单一水溶性萘类内过氧化物或它们的混合物在15-80℃下与待处理的生物制剂接触5-200分钟。
2.如权利要求1的灭活方法，其特征在于，所述萘类内过氧化物的浓度为5-100mM。
3.如权利要求1的灭活方法，其特征在于，所述萘类内过氧化物为DHPNO2、NDPO2、MNEAO2和/或MNPO2。
4.如权利要求3的灭活方法，其特征在于，所述萘类内过氧化物为DHPNO2。
5.如权利要求1的灭活方法，其特征在于，所述温度在30-60℃之间。
6.如权利要求4的灭活方法，其特征在于，所述时间为45-150分钟之间。
7.如权利要求1的灭活方法，其特征在于，所述生物制剂是基因工程产品、疫苗或人或动物来源的全血、血细胞制剂、全血浆或血浆衍生物。
8.如权利要求1的灭活方法，其特征在于，在稳定剂存在下进行病毒灭活。
9.如权利要求7的灭活方法，其特征在于，所述稳定剂是糖、多元醇、氨基酸、金属盐以及它们的共混物。
10.权利要求8的灭活方法，其特征在于，所述稳定剂是右旋葡萄糖、肝素、赖氨酸、精氨酸、柠檬酸钠、磷酸钠、葡萄糖酸钙。
11.如权利要求7的灭活方法，其特征在于，所述稳定剂维持pH在4.0-8.5之间，渗透压为10-300mOsm/kg。
12.如权利要求1的灭活方法，其特征在于，所述病毒是胞膜病毒和/或非胞膜病毒。
全文摘要
本发明涉及一种病毒的灭活方法,其中,用浓度为2—200mM的单一水溶性萘类内过氧化物或它们的混合物在15—80℃下与待处理的生物制剂接触5—200分钟。本发明的方法效率更高,操作简便,灭活病毒的范围广。
文档编号C12N7/06GK1224756SQ9810017
公开日1999年8月4日 申请日期1998年1月26日 优先权日1998年1月26日
发明者邹方霖, 倪道明 申请人:邹方霖