专利名称：生长得到改造的植物的制作方法
技术领域：
本发明涉及细胞分裂调控蛋白或其部分，优选地结合成视网膜细胞瘤样蛋白的细胞分裂调控蛋白，更优选地细胞周期蛋白尤其是D型细胞周期蛋白和编码这些蛋白的基因的用途，用于制备具有改造的表型的植物，具体地具有改造的生长速率的植物或含有具有改造的生长速率和/或改造的相对大小的部分的植物或具有改造的结构的植物。本发明也涉及表达这样的DNA的植物细胞和植物。发明背景当真核细胞分裂时，它们都经历了相同的顺序发生的一系列事件，术语“细胞周期”反映了这些事件的有序本质和普遍性。在真核细胞周期中，DNA复制(S)和细胞分裂(M)通常以顺序G1-S-G2-M发生被“间”期(G1和G2)在时间上分开。这种安排使得进入DNA复制和有丝分裂的关键过程被精确地调控。细胞周期的细胞学事件的基础是一系列空间上和时间上组织有序的、确定周期方向和顺序的分子和细胞过程。在真核细胞中，细胞周期过程似乎是被在G1→S期和G2→M期边界发挥作用的主要控制调控的。通过这些调控点需要依赖于细胞周期蛋白的激酶(CDKs)，其催化活性和底物特异性是由已知为细胞周期蛋白的特异的调控亚基以及与调节复合物磷酸化状态的其它蛋白的相互作用确定的(在Atherton-Fessier等1993；Solomon，1993中综述)。在芽殖和裂殖酵母中，G1→S和G2→M期过渡是由粟酒裂殖酵母中的cdc2+基因以及酿酒酵母中的CDC28编码的单个CDK控制的。p34cdc2(芽殖酵母中的p34CDC28与不同的细胞周期蛋白配偶体的共同作用使这两个调控点相互区别(Nasmyth，1993中综述)。在哺乳动物细胞中，更为复杂的状况占主要地位，有至少6个相关的但具有不同作用的不同的CDKs(由cdc2/cdk1、cdk2、cdk3、cdkain4、cdk5和cdk6编码)，每一种与一个或多个相关的细胞周期蛋白配偶体联合作用(Fang和Newport，1991；Meyerson等，1991，1992；Xiong等，1992b；Tsai等，1993a；van den Heuvel和Harlow，1993；Meyerson和Harlow，1994)。B型细胞周期蛋白是参与G2→M过渡和与p34cdc2或其直接同系物相关的主要类别(Nurse，1990中综述)。细胞周期蛋白B是最初描述的在无脊椎动物卵的分裂间期积累在有丝分裂期迅速被破裂的两个细胞周期蛋白中的一个(Evans等，1983)，并且它是非洲爪蟾促成熟因子的组分(Murray等，1989)。随后，细胞周期蛋白B同系物被从多种真核物种中鉴定。细胞周期蛋白A也在多细胞生物中广泛存在，其精确作用不明，但其丰富的高峰提示它在S期发挥功能(在Pines，1993中综述)。
G1→S期过渡在酿酒酵母中的了解最为详尽。遗传学研究确定了晚G1期被称为START的点。经过START后，细胞进入S期并完成完整的另外一轮分裂，导致G1期再次产生两个子细胞(Hartwell，1974；Nasmyth，1993中综述)。三个酿酒酵母G1细胞周期蛋白基因的产物为CLN1，CLN2和CLN3是经过START的主要限制成分(Richardson等，1989；Wittenberg等，1990；Tyers等，1993)。CLN1和CLN2的转录在G1期被活化，其蛋白产物经过正反馈机制积累到关键的阈水平导致p34CDC28激酶活化及通过START的过渡(Dirickt和Nasmyth，1991)。然后G1期细胞周期蛋白的一级序列降解为PEST基序，似乎导致了快速的蛋白转换(Rogers等，1986；Lew等1991；Reed，1991中综述)。
酿酒酵母G1细胞周期蛋白至少部分过剩，因为三个G1细胞周期蛋白基因中的两个被删除且第三个置于半乳糖调控的启动子的控制下的酵母株系呈现出依赖于半乳糖的生长表型。这样的株系它被用于鉴定当存在的单个酵母CLN基因被抑制时在半乳糖平板上拯救这种条件cln缺陷表型的果蝇和人cDNA克隆(koff等，1991；Lahue等，1991；Leopold和O’Farrell，1991；Lew等，1991；Xiong等，1991)。通过这种方法鉴定了新的三类细胞周期蛋白C，D和E的人cDNAs。尽管这些细胞周期蛋白与酵母CLN蛋白的同源性有限，它们对于理解在哺乳动物细胞G1期和G1→s期边界限制点起作用的调控是重要的(Pardee，1989；Matsushime等，1992；koff等；1992，1993；Ando等，1993；Quelle等，1993；Tsai等，1993b)。细胞周期蛋白E作为G1→S期边界的限速成分(Ohtsubo和Roberts，1993；Wimmel等，1994)，而细胞周期蛋白D水平对于血清生长因子的依赖性(Matsushime等；1991；Baldin等，1993；Sewing等，1993)提示D型细胞周期蛋白可能形成这些信号和细胞周期进程的连接。
参与哺乳动物细胞周期进程调控的重要因素是编码成视网膜细胞瘤蛋白(Rb)的成视网膜细胞瘤易感基因。Rb与转录因子E2F家族结合并使之失活，并且Rb是通过这种能力发挥其大部分的在G1期抑制细胞分裂的能力。已知E2F转录因子开启细胞周期蛋白E和S期基因且细胞周期蛋白E和/或E2F的水平升高导致了复制的开始(Nevins，1992，Johnson等，1993)。Rb使E2F失活的能力依赖于其磷酸化状态。在大多数G1中，Rb处于低磷酸化状态，但在G1晚期，Rb的磷酸化由依赖于细胞周期蛋白的激酶具体是CDK4与其主要调控亚基，细胞周期蛋白D形成复合物(Pines，1995)及CDK2与细胞周期蛋白E(在G1/s交界处)或细胞周期蛋白A(在S期)形成复合物完成的。Rb的多磷酸化导致它释放E2F，然后E2F最终促进S期基因转录。
植物细胞被用于细胞生长和分裂早期研究以确定真核细胞周期不连续的时期(Howard和Pelc，1993)，但关于植物体系中分子细胞周期调控的数据很少。由于体眠体内停止分裂或由于营养贫乏体外停止分裂的植物细胞停滞在G1和G2的主要调控点(van’t Hof和kovacs，1972；Gould等，1981；van’t Hof，1985中综述；这与在其它真核体系中发挥作用的调控基本一致。尽管成熟的植物细胞含有G1或G2DNA含量(Evans和van’t Hof，1974；Gould等，1981)，G1群通常处于主要地位。氮饥饿培养的植物细胞中的G1调控点更为严格；这些细胞完全停滞在G1期(Gould等，1981)。因此在植物细胞周期的G1主要调控点、酵母的START调控和哺乳动物细胞的限制点之间有很强的相似性。
抗体或组蛋白HI激酶实验用于显示植物细胞中有活性的CDC-2相关激酶的存在和定位(John等，1989，1990，1991；Mineyuki等，1991；Chiatante等，1993；Colasanti等，1993；John等，1993中综述)，编码CDC2激酶功能性同系物的cDNA已通过简化的严格杂交或丰余的聚合酶链反应从许多植物物种中分离到，包括豌豆(Feiler和Jacobs，1990)、苜蓿(Hirt等，1991，1993)、拟南芥(Ferreira等，1991；Hirayama等，1991)、大豆(Miao等，1993)、金鱼草(Fobert等，1994)和玉米(Colasanti等，1991)。从多种物种中分离到很多编码植物有丝分裂的具有A-或B-型特征的或具有混合的A-和B-型特征的细胞周期蛋白cDNA序列，包括胡萝卜(Hata等，1991)、大豆(Hata等，1991)、拟南芥(Hemerly等，1992；Day和Reddy，1994)、苜蓿(Hirt，1992)、金鱼草(Fobert等，1994)和玉米(Renaudin等，1994)。
Soni等(1995)通过缺失G1细胞周期蛋白的酵母株系互补从拟南芥中鉴定了一个三个相关细胞周期蛋白的新家族。这个家族的单个成员表现出组织特异性表达并且在其它植物物种中是保守的。它们形成了独特的植物细胞周期蛋白群并被命名为δ-型细胞周期蛋白以表明它们与哺乳动物D型细胞周期蛋白的相似性。δ和D细胞周期蛋白的序列关系包括N末端序列LxCxE。亮氨酸在具有酸性侧链氨基酸(D，E)的前1或2位。这个基序最初在某些病毒癌蛋白中鉴定的并且强烈地参与与成视网膜细胞瘤蛋白的结合。由于与哺乳动物细胞周期蛋白D相似，这些植物同系物可能调节生长和植物激素信号进入植物细胞周期。在这一方面已表明悬浮培养细胞一经再次刺激，细胞周期蛋白δ3被植物生长调节剂细胞分裂素迅速诱导，细胞周期蛋白δ2被碳源诱导。Renaudin等(1996)确定了这一群和植物细胞周期蛋白命名，δ-细胞周期蛋白现在被称为CycD细胞周期蛋白。
Dahl等(1995)鉴定了苜蓿中的与苜蓿δ3相关的细胞周期蛋白(cycMs4)。
最近，在植物中鉴定了Rb样蛋白。Xie等(1996)和Grafi等(1996)都描述了从玉米中对Rb类似物的分离和初步鉴定。
Doerner等(1996)描述了拟南芥中B型细胞周期蛋白(CyCl At来自拟南芥)在cdc2a基因启动子控制下的异位表达。强烈表达转基因的“cdc2a”转基因植物具有明显提高的根生长速度。而且，相对于对照植物而言，转基因植物经吲哚乙酸诱导后，侧根的生长和发育加速。
Hemerly等(1995)描述了表达在有丝分裂中起作用的野生型或显性突变激酶(CDC2a)的转基因烟草和拟南芥。据预测组成型过量产生野生型CDC2a或其突变形式的植物细胞周期加速但不表现出明显改变的发育。期望停滞细胞周期的CDC2a突变体当在拟南芥中表达时取消了细胞分裂。某些组成型产生后一种突变激酶的烟草被回复。这些植物含有相当少的但更大的细胞。
PCT专利公开“WO”92/09685描述了控制植物细胞生长的方法包括在某一时间和在足以控制细胞分裂的条件下调控植物中细胞周期蛋白的水平。在实施例中确定的优选蛋白是p34cdc2激酶或其在有丝分裂发挥作用的类似物。
WO93/12239描述的植物通过用来自诸如粟酒裂殖酵母的酵母的cdc25基因转化植物基因组，有高度改变和其它表型效应，尤其是早开花和花数目增多。
WO97/47647涉及分离和鉴定编码成视网膜细胞瘤蛋白的植物DNA序列，将其用于控制植物细胞、植物和/或植物病毒的生长以及通过基于植物或视网膜细胞瘤蛋白的控制途径的操作修饰的载体、植物或动物或动物细胞的用途。
美国专利5,514,571公开了细胞周期蛋白D1用作D哺乳动物细胞增殖的负调节剂。细胞周期蛋白D1的过量表达阻断了哺乳动物细胞生长，而阻断细胞周期蛋白D1表达促进细胞增殖。发明概述本发明提供的方法可得到生长特征或结构改变的植物，尤其是生长速度降低或提高的植物、需要较少时间开花的植物或每株植物花数目增加的植物或器官增大的植物，此方法包括步骤改变植物细胞内能够结合和/或磷酸化Rb样蛋白的细胞分裂调控蛋白的水平或其功能水平，优选的细胞分裂调控蛋白在蛋白N末端部分包括LxCxE结合基序或相关基序，具体的是D型细胞周期蛋白。
也提供了得到生长特征或结构改变的植物的方法，包括将嵌合基因整合到植物细胞基因组以改变细胞分裂调控蛋白水平或其功能水平，包括下列可调控连接的DNA片段a)植物可表达启动子区，具体的是CaMW35S启动子区，b)编码RNA或蛋白的可转录DNA区，当其表达时，提高或降低细胞分裂调控蛋白的水平或功能水平；并且最佳地c)在植物细胞中有功能的3′末端形成和多聚腺苷酸化信号。
根据本发明，转录的DNA区编码反义RNA、核酶或有义RNA链，当其被表达时降低、控制或阻碍细胞分裂调控蛋白，具体的是内源D型细胞周期蛋白的表达。
进一步地，根据本发明，转录的DNA编码能够与Rb样蛋白的口袋区结合的细胞分裂调控蛋白，优选地包含LxCxE结合基序的细胞分裂调控蛋白，更优选的是D型细胞周期蛋白，具体的是来自植物的D型细胞周期蛋白，更优选的是选自下列群体的D型细胞周期蛋白拟南芥CYCD1、拟南芥CYCD2、拟南芥CYCD3、烟草CYCD2；1、烟草CYCD3；1、烟草CYCD3；2、洋姜CYCD1；1、玉米CYCD2以及洋姜CYCD3；1。
根据本发明，转录的RNA编码蛋白或肽，当它表达时，提高所述的细胞分裂调控蛋白所述的功能水平，具体的是选自下列群体的蛋白或肽突变的D型细胞周期蛋白、D型细胞周期蛋白的部分、细胞周期蛋白盒有突变的D型细胞周期蛋白、第185位氨基酸或第155位氨基酸被替代的D2型细胞周期蛋白、有E185A或K155A突变的D2型细胞周期蛋白、PEST序列被去除的D型细胞周期蛋白、LxCxE结合基序被改变或删除的D型细胞周期白、LxCxE结合基序中的C残基被删除的D型细胞周期蛋白。
本发明的一个目标也提供这样的嵌合基因。
进一步提供的是包含本发明嵌合基因且生长特征和/或结构改变的植物细胞、植物及其种子。
本发明的另一个目标是提供利用能与Rb样蛋白的口袋区结合并/或能磷酸化Rb样蛋白的细胞分裂调控蛋白、特别是蛋白的N端含LxCxE结合基序的细胞分裂调控蛋白，更特别的是D-型细胞周期蛋白及编码它的基因改变植物的生长特征或结构。此细胞分裂调控蛋白优选地由整合到植物细胞基因组内的嵌合基因编码。发明详述此处植物“结构”指由植物的相对大小、位置和几部分的数量(即如但不限于器官叶、花序、诸如块茎的储存器官、根、茎或器官的部分如花瓣、萼片、花药、柱头、花柱、叶柄等)确实的总形态。因此“改变植物的结构”指由于改变了如器官或器官部分的数量、大小和位置导致的总形态的改变。很明显，改变一个器官或其部分或几个器官或几个器官的部分将导致植物结构改变。这可通过改变(即增强或降低)已有的分生组织和/或器官原基或从头产生分生组织实现。
此处的“共抑制”指以序列特异的方式转录和/或转录后抑制RNA积累的过程，抑制同源内源基因或转基因的表达。导入含与DNA区可操作连接的强启动子的转基因可抑制内源基因表达，由此产生的转录RNA是有义RNA，包含的核苷酸序列与表达被抑制的基因的编码或DNA转录序列(有义)有至少75％，优选的至少80％，特别地至少85％，更特别地至少90％，特别是至少95％。优选的，DNA转录区不编码功能蛋白。具体地，转录区不编码蛋白。
此处的“植物可表达启动子”指能驱动在植物细胞中转录的启动子。包含植物起源的任何启动子，也包括能指导植物细胞中转录的非植物起源的任何启动子，如某些病毒或细菌起源的启动子如CaMV35S或T-DNA基因启动子。
“基因表达指在可调控区，特别是启动子控制下的DNA区转录成有生物活性的RNA的过程，即，它能与另一个核酸或蛋白作用或能被翻译为有生物活性的多肽或蛋白。当基因表达终产物是有生物活性的DNA如反义RNA或核酶时，此基因编码RNA。当基因表达终产物是有生物活性的蛋白或多肽时，此基因编码蛋白质。
“基因”指包含在细胞中在适当的调控区，如植物表达启动子控制下转录成RNA分子(如，mRNA)的DNA区(“DNA转录区”)的任何DNA片段。因此基因包括几个可操作连接的DNA片段如启动子、5′前导序列、编码区和含多聚苷酸化位点的3′区。内源植物基因是在植物物种中天然存在的基因。嵌合基因是在植物物种中正常不存在的任何基因或，选择性地，其中的启动子不与DNA转录区的部分或全部或与其它的至少另一个调控区不天然相关的任何基因。
本发明基于意外发现，即包括编码能与Rb样蛋白结合的细胞分裂调控蛋白，特别是植物D型细胞周期蛋白的，在植物可表达启动子控制下的DNA能稳定整合到植物细胞基因组，没有有害效应，且植物细胞中这样的细胞分裂调控蛋白、特别是D型细胞周期蛋白导致转化植物生长速度和结构的特异性改变。
因此，本发明涉及优选地以稳定方式调节植物细胞内功能性细胞分裂调控蛋白的表达水平或活性改变转化植物和其后代的结构或生长速度或两者。方便地，细胞分裂调控蛋白的水平或功能水平是通过改变编码这些细胞分裂调控蛋白的基因的表达遗传控制的。遗传上提高细胞分裂调控蛋白的水平或功能水平可通过如操纵编码基因的拷贝数。改变编码基因的启动子区或操纵直接或间接地调节细胞分裂调控蛋白表达水平的基因实现的。选择性地，稳定编码细胞分裂调控蛋白的mRNA，或通过去除破坏基序或所谓的PEST序列稳定细胞分裂调控蛋白提高细胞分裂调控蛋白的水平。
通过技术如但不限于给细胞提供蛋白如与功能水平将要提高的细胞分裂调控蛋白相似的无活性细胞分裂调控蛋白或这样的细胞分裂调控蛋白的部分，但仍能与抑制剂或其它调节蛋白结合或仍能与依赖细胞周期蛋白的激酶结合的蛋白，降低细胞分裂促进蛋白拮抗剂或抑制剂的水平，细胞分裂调控蛋白的功能水平或活性可得到提高。改变或突变细胞分裂调控蛋白以降低或消除细胞分裂相关蛋白活性的拮抗剂或抑制剂的结合，细胞分裂调控蛋白的功能水平或活性也得到提高。
通过技术如但不限于反义RNA、核酶作用或共抑制，如降低可翻译的编码细胞分裂调控蛋白的mRNA库，可使细胞分裂调控蛋白的功能水平降低。选择性地，提高细胞分裂促进蛋白拮抗剂的水平可降低细胞分裂调控蛋白的功能水平。
对于本发明的目的而言，“细胞分裂调控蛋白”是调节真核细胞，优选的是植物细胞细胞周期进程必需的多肽或蛋白，或通过与调节细胞周期进程必需的蛋白直接作用影响细胞进入细胞周期或影响细胞周期进程的蛋白，或不是调节细胞周期必需的但具相当功能的多肽或蛋白。
适当的细胞分裂调控蛋白是能单独或与其它蛋白联合磷酸化Rb样蛋白，优选地在植物细胞G1→S过渡期磷酸化Rb样蛋白或能与成视网膜细胞瘤样(Rb样)蛋白，优选的在氨基酸序列内含有LxCxE结合基序或相关基序如LxSxE或FxCxE的蛋白口袋区结合的蛋白(结合基序以一个字母氨基酸密码代表，其中x代表任何氨基酸)。特别优选的是细胞周期蛋白，它们的N端含LxCxE结合基序(和/或相关基序)，优选地在前50个氨基酸残基内、特别是在前30个氨基酸内如D型细胞周期蛋白，特别是D型植物细胞周期蛋白，特别是选自由拟南芥CYCD1、拟南芥CYCD2、拟南芥CYCD3、烟草CYCD3；1、烟草CYCD2；1、烟草CYCD3；2、洋姜CYCD1；1，玉米CYCD2和洋姜CYCD3；1组成群体的细胞周期蛋白或有基本上相似蛋白序列的细胞周期蛋白。
所述的D型植物细胞周期蛋白通过下列核苷酸的DNA序列编码的氨基酸序列完全得到鉴定来自拟南芥CYCD1的第104-1108位核苷酸，EMBL注册号为N°X83369，来自拟南芥CYCD2的第195-1346位核苷酸，EMBL注册号为N°X83370，来自拟南芥CYCD3的第266-1396位核苷酸，EMBL注册号为N°X83371，来自烟草CYCD2；1的核苷酸序列SEQ ID N°的第182-1243位核苷酸，来自烟草CYCD3；1的核苷酸序列SEG ID N°2的第181-1299位核苷酸，来自烟草CYCD3；2的核苷酸序列SEQ ID N°3的第198-1298位核苷酸，来自洋姜CYCD1；1的核苷酸序列SEQ ID N°4的第165-1109位核苷酸，来自洋姜CYCD3；1的核苷酸序列SEQ ID N°5的第48-1118位核苷酸以及来自玉米CYCD2的核苷酸序列SEQ ID N°21的第316-1389位核苷酸。
据认为分别提高、降低细胞分裂调控蛋白的水平或功能水平或活性分别加速或延迟植物细胞G→S期过渡，或通过与Rb样蛋白作用影响Rb样蛋白使某些转录因子失活的能力从而提高或降低有分裂活性细胞的比例。进一步认为与Rb样蛋白相作用的细胞分裂调控蛋白的表达有效地使细胞起始分裂过程，相反G2/有丝分裂细胞周期蛋白(如B型细胞周期蛋白或cdc25基因产物)(过量)表达将导致已开始分裂的细胞更快通过细胞周期的G2/有丝分裂期。
就本发明目的而言，“Rb样蛋白”定义为选自下列群体的蛋白人Rb-1蛋白(Lee等，1987；注册号PO6400)、人p107(Ewen等，1991；注册号L14812)和人p130(Hannun等，1993；注册号A49370)、果蝇RBF(Du等，1996；编码基因的DNA注册号为X96975)、小鼠RB(Bernards等，1989；注册号P13405)、鸡RB(Boehmelt等，1994；注册号X72218)、非洲爪蟾Rb(Destree等，1992；注册号A44879)，玉米的ZmRb和Rb1(Xie等，1996；Grafi等，1996；编码基因的DNA录入注册号X98923；基因库U52099)以及与上述组的至少三个成员有至少25-30％氨基酸相似性(相同)并包含位于人Rb-1706位的或在其它Rb样蛋白的相当位置的保守半胱氨酸残基(见，如，Xie等，1996)。
Rb样蛋白是被称为“口袋蛋白”的小家族的成员。此述语来自保守的二分结构域，即所谓的“口袋结构域”，它是几种生长调控蛋白诸如转录因子E2F家族、D型细胞周期蛋白和病毒癌蛋白结合位点。口袋结构域的A和B亚结构域比蛋白的其它部分更保守(A和B亚结构域为约50-64％)且被非保守间隔区分开。口袋结构域位于人Rb的第451和766位氨基酸之间、人p107的321-811位氨基酸、人p130的第438-962位氨基酸、小鼠RB的445-758、鸡RB的44-758、非洲爪蟾Rb的440-767、玉米ZmRb的11-382、玉米Rb1的89-540。
就本发明目的而言，“与Rb样蛋白结合”或“与Rb样蛋白口袋结构域结合”可通过体外实验或一种体内实验或将二者联合进行分析。在体外实验中，结合分析是在标有35S-蛋氨酸的待检蛋白、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)融合蛋白和诸如人Rb的Rb样蛋白的口袋结构域之间进行的。与GST融合使得融合蛋白很容易在谷胱甘肽琼脂糖珠上纯合和固定。被测蛋白和Rb样蛋白间的作用和同一蛋白与GST和在相当于人Rb 706位保守半胱氨酸突变的Rb样蛋白，如人Rb C706F形成的融合蛋白之间的结合相比较。如Dowdy等(1993)和Ewen等(1993)描述过这样的实验。在这样实验的改变形式中，Rb样蛋白可在杆状病毒感染的昆虫细胞中表达(Dowdy等，1993)。在进一步的改变形式中，Rb样蛋白和Rb结合蛋白在昆虫细胞中同时表达，相关性通过凝胶过滤或共免疫沉淀检测(O′Reilly等，1992)。
用于测定蛋白与Rb样蛋白口袋结构域结合的体内实验是酵母双杂交系统(Fields和Song，1989)。这种分析依赖于从两个包含DNA结合结构域的分开的GAL4融合蛋白(GAL4BD)重建功能GAL4活性的能力以及分别与Rb样蛋白的口袋结构域和待检蛋白融合的活化结构域(GAL4AD)。将含编码这些融合蛋白嵌合基因的表达质粒导入编码适当的GAL4可诱导标记的酵母株系，如含GAL4可诱导的HIS3和LacZ标记的HF7c株系(Feilloter等，1994)和Y190株系(Harper等，1993)。与Rb样蛋白口袋结构域结合的蛋白在无组氨酸时生长。Durfee等(1993)描述了用酵母双杂交实验证明蛋白与Rb样蛋白之间的相互作用。
优选地，应包括适当的对照实验，如单独将表达质粒单独导入同一酵母株系或分别导入编码含DNA结合结构域(GAL4BD)和与Rb样蛋白的突变口袋结构域优选的，在C706或相当位置突变融合的活化结构域融合蛋白及被测蛋白的表达质粒。
测定蛋白与Rb样蛋白口袋结构域结合的体外实验的替代方法包括在植物细胞优选的土豆原生质体中瞬时表达两种蛋白，然后用针对两种蛋白之一的抗体免疫沉淀以检测另一种蛋白的共沉淀。
就本发明的目的而言，“磷酸化Rb样蛋白”可通过体外实验分析，如本领域熟知的，它依赖于用γ32P标记的腺苷三磷酸监测蛋白(或诸如细胞周期蛋白的蛋白与依赖细胞周期蛋白的激酶联合)将标记的磷酸基转至靶蛋白上的能力。
就本发明的目的而言，“细胞周期蛋白”定义为调控蛋白，包括约100个氨基酸的“细胞周期蛋白盒”的结构域。细胞周期蛋白盒是依赖细胞周期蛋白激酶的结合位点，使细胞周期蛋白行使对CDKs激酶活性的调节作用。
通过比较蛋白的氨基酸序列和已知的细胞周期蛋白盒可鉴定细胞周期蛋白盒，已知的细胞周期蛋白盒如拟南芥CYCD1的81-186位氨基酸、拟南芥CYCD2的96-201位、拟南芥CYCD3的86-196位、由Renaudin等(1994；1996)、Soni等(1995)和Hemerly等(1992)描述的细胞周期蛋白盒。通过序列比较鉴定的细胞周期蛋白盒氨基酸序列应在相当位置具有细胞周期蛋白活性必需的至少5个残基R(97)、D(126)、L(144)、K(155)、E(185)(依据拟南芥CYCD2序列定的位置)(见如Soni等(1995)和Renaudin等(1996)。
D型细胞周期蛋白(细胞周期蛋白D或CycD)是通过额外的特征序列存在鉴定的细胞周期蛋白，如在蛋白的N末端部分，优选地位于N末端和细胞周期蛋白盒之间，具体地位于前50个氨基酸内，更具体地位于起始蛋氨酸的前30个氨基酸内的LxCxE基序或相关基序。优选地，结合基序的亮氨酸位于含酸性侧链氨基酸(D、E)前1或2位。也可发现可选择的结合基序如LxSxE或FxCxE。事实上，phelps等(1992)已鉴定人乳头瘤病毒E7中结合基序LxCxE突变为LxSxE不会影响蛋白与Rb样蛋白结合的能力。根据序列同源性已鉴定了三组D型细胞周期蛋白CycD1(包括拟南芥CycD1和洋姜CYCD1；1)、CycD2(包括拟南芥CYCD2、烟草CYCD2；1、玉米CYCD2)、CycD3(包括拟南芥CYCD3、烟草CYCD3；1、烟草CYCD3；2和洋姜CYCD3；1)。
Renaudin等(1995)描述的不同类型和组的植物细胞周期蛋白包括D型细胞周期蛋白命名和保守序列，可用于根据新型细胞周期蛋白的氨基酸序列对它们分类。
就本发明目的而言，可将细胞分裂调控蛋白直接提供给细胞，如在细胞分裂调控蛋白的存在下，原生质体的电穿孔，或用编码待检蛋白的瞬时或稳定稳合到原生质体基因组的植物可表达嵌合基因转化植物细胞从而间接提供给细胞。
在本发明的一方面中，通过将包括下列可操作连接的DNA片段的嵌合基因整合到植物细胞基因组，提高能磷酸化RB样蛋白或与Rb样蛋白的口袋结构域结合的细胞分裂调控蛋白的水平或功能水平以得到生长速度或结构改变的植物a)植物可表达启动子区，具体的是CaMV35S启动子区，b)编码当表达时，提高细胞分裂调控蛋白水平或功能水平的DNA转录区；并且最佳地，c)在植物细胞中有功能的3′末端形成和聚腺苷酸化信号。
在本发明优选的实施方案中，将包含编码在植物可表达启动子控制下的细胞周期蛋白的DNA区的嵌合基因导入植物细胞基因组提高细胞周期蛋白D的表达水平。DNA转录区优选地选自下列群体的核苷酸序列EMBL注册号X83369的104-1108位核苷酸序列、EMBL注册号X83370的195-1346位核苷酸序列、EMBL注册号X83371的266-1396位核苷酸序列、SEQ ID N°1的182-1243位核苷酸序列、SEQ ID N°2的181-1299位核苷酸序列、SEQ ID N°3的198-1298位核苷酸序列、SEQ ID N°4的165-1109位核苷酸序列、SEQ ID N°5的48-1118位核苷酸序列或SEQ ID N°21的316-1389位核苷酸序列。
在特别优选的实施方案中，将包含编码CycD2型细胞周期蛋白的，在植物可表达启动子，优选的是组成型启动子，具体是CaMV35S启动子控制下的DNA转录区的“嵌合cycD2基因”如质粒pCECl的嵌合cycD2基因导入植物细胞基因组改变(即提高CycD2型细胞周期蛋白的表达水平从而改变转基因植物的形态、结构和生长特征，具体地是提高转基因植物的营养生长，更具体地改变转基因植物的生长速度。
就本发明目的而言，可测量表型性状的“提高”或“降低”定量为与一个转基因植物品系中不同植物的性状描述相关测量的平均值和野生型植物中该性状测量平均值的差除以野生型植物中该性状测量平均值，以百分数表示，而转基因和对照(野生型)植物在相同营养供应、光照、温度温度等条件下优选的在标准条件下栽培。优选的提高或降低水平有统计学意义，优选的在0.05置信水平，具体地在0.01置信水平如根据单向方差分析确定(如Snedecor和Cochran的统计学方法中描述的)。
转基因植物的营养生长优选地通过测量生长期干重的提高监测。干重的平均提高定义为转基因与野生型植物平均干重差乘以100然后除以野生型植物平均干重。本发明嵌合cycD2基因导入引起的干重，尤其是在生长早期，增加从至少约39％至约350％，具体地从约68％至约150％。
很明显，由本发明的嵌合基因导入引起的干重增加依所用的植物物种或嵌合基因而异，转基因植物干重任何明显的增加包含于本发明尤其是未转化对照植物干重至少约1.4倍至至少约4.5倍，具体地是未转化植物干重的至少约1.8倍至至少约2.7倍。在任何情况下，转基因植物的平均干重与未转化植物的平均干重在统计学上有明显的差异。
转基因植物的营养生长的增长可通过在任何时间点比较转基因植物上可见的叶数量与对照野生型植物的叶数量鉴定。生长中期转基因植物叶数目的差异预计为未转化植物的至少约1.1至至少约3倍，具体地为至少约1.5至至少约2倍。
转基因植物的营养生长提高也可通过测量生长期茎高(从土壤至生长点顶部)监测。茎高的平均增长定义为转基因植物与野生型植物平均茎高差乘以100除以野生型植物平均茎高。由于导入本发明的嵌合cycD2基因导致的茎高增长通常为从生长早期的至少约65％，到生长中期的至少20-30％到开花期的至少约10％，但可高达生长早期的约120％至约190％，生长中期的约40-50％至约75％以及开花期末期的约15-20％。
很明显，由于本发明的嵌合基因的导入导致的茎高增长依所用的植物物种或嵌合基因而异，转基因植物茎高任何明显的增长包含于本发明，尤其是未转化对照植物茎高的至少约1.1倍至至少约3倍，具体地是未转化植物茎高的至少约1.5倍至至少约2倍。
转基因植物和对照植物的茎高差异随着生长进行减小，因为开花植物的生长速度降低。转基因植物的最终高度可能与非转基因植物的最终高度相似。
与未转化植物相比，包含本发明cycD2嵌合基因的转基因植物生长速度增加导致达到给定干重或茎高所需时间减少。此处用的“生长速度”指每天植物或植物部分大小的增加，尤其是每天茎高的增加，这可通过计算包括许多天的起始和终止时植物或植物部分大小的差，具体地为6-8天除以天数确定。生长速度提高优选地根据可测量表型增长的一般定义表达，也可表达为相同时期相同条件下转基因植物和未转化对照植物生长速度的比率。
如上所述，由嵌合基因，具体地是本发明的嵌合cycD2基因导入引起的生长速率提高依所用的植物物种和嵌合基因而异，转基因植物生长速度任何明显的增长包含于本发明，尤其是从约4％至约85％，更具体地从约20％至约60％，尤其是从约30％至约50％生长速度的提高。
转基因植物营养生长的增加可通过在叶子仍扩张的生长阶段的不同时间点测量最大叶子的大小监测。可测量的表型是转基因植物成熟性提高的测量。由于本发明的嵌合基因导入得到的最大叶片的平均增长(定义为转基因植物和野生型植物最大叶片平均长度差乘以100除以野生型植物最大叶片平均长度)生长早期约7至31％(平均约17％)，至生长中期的约3-14％(平均约7％)。
同样，由于导入本发明嵌合基因导致的最大叶片大小增长依所用的植物物种或嵌合基因而异，且转基因植物叶生长或大小任何明显增加包含于本发明。
本发明的另一个目标是，嵌合细胞分裂调控基因，具体地是嵌合cycD2基因也可导入植物以提高根发育，尤其是提高平均根长。概括地说，根发育的提高与地上营养部分(茎、叶、花)的提高平行且从约40％至约70％，同样，这些提高可依所用的植物物种或嵌合基因而异，且根发育任何明显的提高，尤其是有统计学意义的提高包含于本发明。
本发明的另一个目标是，嵌合细胞分裂调控基因，具体是嵌合cycD2基因可导入植物以增加花的大小和数量，具体地是能育花的数量以及每个花中能育胚珠的数量。由于能育花的数量以及每个花中能育胚珠数量增加(通常导致每株植物种子数更多)，每株植物的种子产量也提高。很明显，花数量、每个花胚乳数以及种子产量的提高依转化本发明嵌合细胞分裂调控基因的植物物种或嵌合基因而异。由于导入了含CycD2DNA编码区的在CaMV35S启动子控制下的嵌合基因的花大小的通常的增加以至少约4％至至少约30％，具体地至少约10％至至少约20％。典型的花数量的增加为以约至少20％至至少约50％，具体地从约24％至约45％，种子数量植物(以干重为为基础)的增加从至少约5％至至少约55％，具体地以至少约10％至至少约30％，更具体地约25％。
在本发明的另一个实施方案中，嵌合细胞分裂调控基因，具体的是嵌合cycD2基因导入植物或其种子以加速发芽。已发现包含本发明嵌合cycD2基因的转基因种子比野生型对照至少早约8至16个小时发芽。
而且，提到的嵌合基因可导入植物以减少花序达到成熟所需的平均天数，因此有效地降低开始开花所需的时间。包含本发明嵌合cycD2基因的植物较早达到成熟，尤其是开花期，但有开花植物的正常大小。达到开花期所需时间的实际降低依所用的植物物种或嵌合基因而异。通常，含有在CaMV35S启动子控制下的编码CycD2的DNA区嵌合基因的转基因植开花所需时间降低了至少约3％至11-12％，具体地至少约4％至7％。
在另一个具体的优选实施方案中，包含在植物可表达启动子，优选的是组成型启动子，具体的是CaMV35S启动子控制下的编码CycD3的DNA转录区的嵌合基因，如包人pCRK9的嵌合cycD3基因的核苷酸序列的嵌合基因导入植物细胞获得的转基因植物有形态性状或结构改变，具体的是特定植物部分或器官改变，更具体的是花的大小和诸如花瓣增长和/或增大的花形态改变。转化了包含在植物可表达启动子控制下编码CycD3DNA区的嵌合基因的植物(和其后代)表现出花大小增加约31％至约44％。而且这些转基因植物比野生型植物开花晚，相应于开花时间增加约5％至约20％，具体的是约8％至约16％。
在本发明的另一个实施方案中，通过将包含下列可操作连接的DNA片段的嵌合基因整合到植物细胞基因组中，能磷酸化RB样蛋白或与Rb样蛋白的口袋区结合的细胞分裂调控蛋白，具体的是D型细胞周期蛋白的功能水平升高以得到生长速度或结构改变的植物a)植物可表达启动子区，具体的是CaMV35S启动子区，b)表达时，提高细胞分裂调控蛋白的功能水平的编码蛋白的DNA转录区，优选地，编码突变细胞分裂调控蛋白或突变细胞分裂调控蛋白部分，更优选地编码突变D型细胞周期蛋白或细胞周期蛋白部分，具体地编码细胞周期蛋白盒内有突变的D型细胞周期蛋白(十分具体的是D2型细胞周期蛋白185位或155位氨基酸替代，特别是E185A或K155A)或PEST序列被去除的D型细胞周期蛋白；具体地是C末端删除。以去除PEST序列，或LxCxE结合基序改变或删除的D型细胞周期蛋白，具体的是LxCxE结合基序中C残基被去除；并且最佳的c)在植物细胞中有功能的3′末端形成和聚腺苷酸化信号。
尽管不是有意将本发明限制为一种行为模式，据认为突变细胞分裂调控蛋白通过螯合正常的功能性细胞分裂调控蛋白的抑制剂或拮抗剂发挥作用。
很明显，以上述描述中可以看出，包含编码其它D型细胞周期蛋白，具体的植物来源的CycD群细胞周期蛋白的DNA转录区的嵌合基因可用于得到相似的效果。通过不同的方法包括用CycD1、CycD2或CycD3编码DNA作探针及降低的严格杂交条件进行杂交或用根据已知的D型细胞周期蛋白核苷酸基础上的寡核苷酸优选地，具有与编码保守氨基酸序列一致的核苷酸序列的寡核苷酸、具体地具有与编码每群细胞周期蛋白盒内保守氨基酸的序列一致的核苷酸序列的寡核苷为基础的聚合酶链反应，从其它植物物种或变种中得到这些基因。保守氨基酸序列可从已知的对比编码这样氨基酸序列的DNA推断到。特别优选的用于D1型植物细胞周期蛋白PCR扩增的寡核苷酸联合是选自具有SEQ IDN°7、SEQ ID N°8或SEQ ID N°9 DNA序列的寡核苷酸和选自具有SEQ ID N°10或SEQ ID N°11 DNA序列的寡核苷酸。
特别优选的用于植物D2型细胞周期蛋白的PCR扩增的寡核苷酸联合是选自具有SEQ ID N°12或SEQ ID N°13 DNA序列的寡核苷酸和选自具有SEQ ID N°14或SEQ ID N°15 DNA序列的寡核苷酸。特别优选的用于植物D3型细胞周期蛋白的PCR扩增的寡核苷酸联合是选自具有SEQ ID N°16、SEQ ID N°17或SEQ ID N°18 DNA序列的寡核苷酸和选自具有SEQ ID N°19或SEQ ID N°20 DNA序列的寡核苷酸。扩增的DNA片段用于筛选cDNA或基因组文库(在严格条件下)以分离全长克隆。
可选择地，可通过技术诸如但不限于，条件G1→S细胞周期蛋白缺陷酵母株的功能性补充得到编码植物来源的细胞周期蛋白的另外基因，如Soni等(1995)和Dahl等(1995)描述的或用酵母双杂交系统(Fields和Song，1989)分离上文所述的编码与Rb样蛋白口袋区结合的细胞周期蛋白的DNA序列。
已知某些植物包含一个以上的编码相同亚群D型细胞周期蛋白的基因(如，烟草包含至少两个CycD3亚群基因)并且很明显地，这些变异体可应于本发明范围内。
而且，具有与本发明中公开的细胞周期蛋白氨基酸序列基本上相似的D型细胞周期蛋白，如突变D型细胞周期蛋白可用于达到相同的效果。至于“氨基酸序列”基本相似指当两个相关序列对比时，百分序列相同性一即，具有相同氨基酸的位置数除以两个序列中较短的中的残基数—高于80％，优选地高于90％。两个氨基酸序列对比是用窗口大小20，一个单词长度为两个氨基酸和gap penalty 4的Wilbur和Lipmann算法(Wilbur和Lipmann，1983)进行的。序列数据的计算机辅助分析和解释，包括如上所述的序列对比通常用IntelligeneticsTMSuite程序(Intelli genetics.Inc，CA)进行。
很明显，编码细胞分裂调控蛋白，具体的是D型细胞周期蛋白的任何DNA序列可用于构建本发明的嵌合细胞分裂调控基因，特别是部分或完全人工合成的DNA序列。
同样明显的是，其它植物可表达启动子，具体的是组成型启动子，如土壤杆菌Ti或Ri质粒的冠瘿碱合酶启动子、具体地是胭脂碱合酶启动子可用以达到相似的效应，而且，借助于已存在的CaMV35S的变种形式；如本领域技术人员熟知的，通过使用，诸如Hull和Howell，病毒学86.第482页(1978)所述的替代性CaMV35S启动子同样达到本发明的目标。
本发明进一步的目标是通过用组织特异的或器官特异的启动子控制编码细胞分裂调控蛋白尤其是D型细胞周期蛋白的DNA的表达提供限制于特定器官或组织形态或结构改变的植物。这样的组织特异或器官特异的启动子在本领域是熟知的，包括但不限于种子特异的启动子(如WO89/03887)、器官原基特异的启动子(An等，1996)、茎特异的启动子(Keller等，1988)、叶特异的启动子(Hudspeth等，1989)，叶肉特异的启动子(如光诱导的Rubisco启动子)、根特异的启动子(Keller等，1989)、块茎特异的启动子(Keil等，1989)、维管组织特异的启动子(Peleman等，1989)、分生组织特异的启动子(如SHOOTMERISTEMLESS(STM)基因的启动子，Long等，1996)、原基特异的启动子(如金鱼草CycD3a基因的启动子；Doonan等，1998)等。
在本发明的另一个实施方案中，通过可操作地将编码细胞分裂调控蛋白的DNA区与表达受化学化合物诱导的启动子相连，如欧州专利公开“EP”0332104，公开的基因的启动子或WO90/08826中公开的基因的启动子，编码细胞分裂调控蛋白嵌合基因的表达可用合适的化学诱导剂任意控制。
在本发明的另一个实施方案中，用位点特异的重组酶及其相应的顺式作用序列控制编码细胞分裂调控蛋白嵌合基因的表达，如在植物可表达启动子和编码细胞分裂调控蛋白的转录区之间插入不相关的(优选的与转录和/或翻译终止信号)、两侧带有可被位点特异的重组酶识别的顺式作用序列(如，Iox和FRT位点)的核苷酸序列；前提是包含嵌合基因的植物细胞有位点特异的重组酶(如，Cre或FLP)从而插入的不相关核苷酸序列通过重组消除，允许嵌合细胞分裂调控基因表达。
据认为由于导入包含编码在植物可表达启动子控制下的细胞分裂蛋白，具体的是D型细胞周期蛋白DNA区嵌合基因提高了植物中细胞分裂调控蛋白；具体的是D型细胞周期蛋白表达得到的形态改变可通过PEST序列的去除、添加或灭活而加强。PEST序列是脯氨酸、谷氨酸或天冬氨酸和丝氨酸或苏氨酸丰富的氨基酸序列，它位于带正电荷的残基之间，涉及包含这样序列蛋白的快速转换(Tyers等，1992；Cross，1988；Wittenberg和Reed，1988；Salama等，1994)。酵母细胞周期蛋白中去除这些序列可在体内稳定细胞周期蛋白(Pines，1995)。用诸如PESTF IND的软件包通过计算机分析确定PEST区(Rogers等，1986；Rechsteiner，1990).用如Sambrook等(1989)描述的方法，本领域技术人员很容易突变编码具有改变PEST序列的细胞分裂调控蛋白的DNA。
进一步期望表型改变的数量效应可被调节—即，增强或抑制—通过将表达编码内源细胞分裂调控蛋白的嵌合基因，具体是编码内源CycD的嵌合基因作为用编码其它植物相似蛋白的外源基因的替代。优选地，选用外源基因，具体的外源基因编码的相似蛋白与内源细胞分裂调控蛋白有小于约65％、优选的小于约75％，更优选的小于65％氨基酸序列相同性。
在本发明的另一方面中，降低功能性细胞分裂调控蛋白，具体的是D型细胞周期蛋白的表达可改变植物的形态。这可用如反义RNA、核酶或共抑制技术实现。为了达到这个目的，将包含转录成RNA的DNA转录区、其产物降低、抑制或阻止植物细胞内细胞分裂调控蛋白、具体的是D型细胞周期蛋白的嵌合基因导入植物细胞、具体地稳定地整合植物细胞基因组内。
在这一方面的一个实施方案中，嵌合基因的DNA转录区编码至少与编码细胞分裂调控蛋白，具体的D型细胞周期蛋白的有义mRNA部分互补的反义RNA。因此，反义RNA包括与有义mRNA部分。优选的与其至少50碱基长，具体地至少100-200碱基长的连续区段。反义RNA可与mRNA序列的任何区段互补它可与近5′末端序列或帽子位点互补、与前导区的部分或全部互补、与有义前mRNA内含子或外显子区(或与桥接外显子和内含子的区域)互补、与桥接非编码和编码区的区域互补、与包括编码区3′末端的编码区的全部或部分互补和/或与3′末端或非转录尾区的全部或部分互补。反义RNA和编码细胞分裂调控蛋白有义RNA互补体的序列相似性为至少约75％至约100％。
在这一方面的另一个实施方案中，嵌合基因的DNA转录区编码能高特异地切割编码细胞分裂调控蛋白，具体地D型细胞周期蛋白的有义mRNA的特异性RNA酶或所谓的核酶(见如WO89/05852)。
在另一个实施方案中，表达包含编码蛋白或多肽DNA的嵌合基因，当它表达时降低细胞分裂调控蛋白，具体的是D型细胞周期蛋白或抑制细胞分裂调控蛋白，具体地D型细胞周期蛋白以降低功能性细胞分裂调控蛋白，具体地D型细胞周期蛋白从而在植物细胞内发挥其功能。优选地，嵌合基因编码与细胞分裂调控蛋白，具体地D型细胞周期蛋白结合的抗体。
降低包含本发明实施方案嵌合基因的转基因植物细胞内细胞分裂调控蛋白，具体的是D型细胞周期蛋白的水平或功能水平导致转基因植物比在相同条件下培养的未转化植物的茎高降低、生长速度降低或开花延迟等结构改变。得到的效应可依所用的植物物种或嵌合基因而异，对结构和/或生长速度的任何影响，具体地是茎高或生长速度降低、花序发育所需时间延长包含于本发明。
由于降低细胞分裂调控蛋白，优选的是D型细胞周期蛋白、具体的是CYCD2型细胞周期蛋白的水平导致的生长速度的降低从约30％至约60％，具体地从约35％至约50％。
由于降低细胞分裂调控蛋白，优选的是D型细胞周期蛋白、具体的是CYCD2型细胞周期蛋白的水平导致的茎高降低从约10％至约60％，具体地从约30％至约50％，更具体地在40％左右。
由于降低细胞分裂调控蛋白，优选的是D型细胞周期蛋白、具体的是CYCD2型细胞周期蛋白的水平导致的开花时间的延长从约30％至约40％，具体地以约15％至约38％。
嵌合细胞分裂调控基因可包括进一步的调控或其它序列，如前导序列[如来自矮牵牛的cab22L前导序列或来自TMV的ω前导序列)(Gallie等，1987)]，3′转录终止和聚腺苷酸化信号(如章鱼碱合酶基因的[De Greve等，1982]、胭脂碱合酶基因[Depicker等，1982]或T-DNA基因T的[Velten和Schell，1985]等[Guerineau等，1991；Proudfoot，1991；Safacon等，1991；Mogan等，1990；Munroe等，1990，Ballas等，1989；Joshi等，1987]，植物翻译起始保守序列[Joshi，1987]、内含子[Leuhrsen和Walbot，1991]等，可操作地与嵌合细胞分裂调控基因的核苷酸序列连接。
优选地，包含嵌合细胞分裂调控基因的重组DNA伴随有嵌合标记基因。嵌合标记基因包含标记DNA以其5′末端与植物可表达启动子，优选的组成型启动子如CaMV35S启动子或诸如编码Rubisw小亚基的基因启动子的光诱导启动子可操作连接；以其3′末端与适当的植物转录3′末端形成和聚腺苷酸化信号可操作连接。期望标记DNA的选择不是关键的，任何适当的标记DNA皆可以。例如，标记DNA可编码给转化植物细胞提供可区别颜色的蛋白，如A1基因(Meyer等，1987)，可给转化细胞提供除草剂抗性的蛋白如bar基因编码膦丝菌素抗性(EP0,242,246)，或给转化细胞提供抗菌素抗生，如aac(6′)基因，编码广大霉素抗性(WO94/01560)。
很明显，本发明基本上可用于所有植物物种和变种，本发明特别适合于改变具有商业价值的植物结构或提高其生长速度。期望营养生长的增长在未经历快速营养生长普遍育种和选择的植物中最为明显。本发明将具体地涉及在温室中栽培的植物，具体地涉及降低温室植物达到期望发育阶段所需的时间，如但不限于开花、座果或种子成形。本发明将进一步涉及提高树木的生长速度，具体的是软材如松树、杨树、桉树等。本发明另外重要的应用包括扩大有效面积，其中植物可通过降低达到有重要经济意义发育阶段所需时间栽培。本发明应用的具体优选的植物是玉米、油菜、亚麻、小麦、禾本科植物、苜蓿、豆科植物、白菜、蕃茄、莴苣、水稻、大麦、土豆、烟草、甜菜、向日葵以及装饰植物如康乃馨、菊花、玫瑰、郁金香等。
包含嵌合细胞分裂调控基因的重组DNA可稳定整合到植物细胞核基因组中。基因转移可用包含本发明嵌合基因无毒Ti-质粒的载体或土壤杆菌进行。转化可用如EP0,116,718中描述的方法进行。选择性地，任何类型的载体可用于转化植物细胞；用的方法如直接基因转移(如按EP0,233,247中描述的)、花粉介导的转化(如EP0,270,356，WO85/01856和美国4,684,611中描述的)、植物RNA病毒介导的转化(如EP0,067,553和美国4,407,956中描述的)、脂质体介导的转化(如美国4,536,475中描述的)等。
其它的方法，如Fromm等(1990)和Gordon-Kamm等(1990)描述的用于玉米的微粒轰击也适用。单子叶植物如主要谷物细胞的转化可用能形成致密胚发生愈伤组织的创伤和/或酶退化致密胚发生组织或退化未成熟胚胎按照WO92/09696中描述的进行。然后得到的转化植物细胞可用于以传统方式再生转化植物。
得到的转化植物可用于以传统育种方案产生更多的具有相同特征的转化植物或将本发明的嵌合细胞分裂调控基因导入相同植物变种或相关植物物种中。从转化植物得到的种子含有以稳定基因组插入物存在的本发明的嵌合细胞分裂调控基因。
下列非限制性实施例描述了嵌合细胞分裂调控基因的构建及用这样的基因修饰植物的结构和生长速度。除非在实施例中另外说明，所有的重组DNA技术根据Sambrook等(1989)分子克隆，实验室手册，第二版，冷泉港出版社，NY及Ausubel等(1994)现代分子生物学方法，现代方法，美国第1和2卷中描述的标准方法进行。植物分子工作的标准材料和方法在R.D.D.Croy的由BIOS Scientific PublicationLtd(Uk)和Blacknell Scientific Publications.UK联合发表的植物分子生物学labfax(1993)中描述。
在描述和实施例中，参照下列序列SEQ ID N°1编码烟草CYCD2；1的cDNASEQ ID N°2编码烟草CYCD3；1的cDNASEQ ID N°3编码烟草CYCD3；2的cDNASEQ ID N°4编码洋姜CYCD1；1的cDNASEQ ID N°5编码洋姜CYCD3；1的cDNASEQ ID N°6pGSV5的T-DNASEQ ID N°7PCR引物1SEQ ID N°8PCR引物2SEQ ID N°9PCR引物3SEQ ID N°10PCR引物4SEQ ID N°11PCR引物5SEQ ID N°12PCR引物6SEQ ID N°13PCR引物7SEQ ID N°14PCR引物8SEQ ID N°15PCR引物9SEQ ID N°16PCR引物10SEQ ID N°17PCR引物11SEQ ID N°18PCR引物12SEQ ID N°19PCR引物13SEQ ID N°20PCR引物14SDQ ID N°21编码玉米CYCD2的cDNA质粒pCEC1和pCRK9于1997年3月11日贮存于BelgianCoordinated Collections of Microorganisms(BCCM)Laboratorium voor Moleculaire Biologie-Plasmidecollectie(LMBP)Universiteit GentK.L.Ledeganckstraat 35B-9000 Gent，Belgium并分配下列贮存号MC1061(pCEC1)BCCM/LMBP3657DH5α(pCRK9)BCCM/LMBP3656质粒pBlueScript-ZM18于1998年3月19日以BCCM/LMBP3866贮存于Belgian Coordinated Collections of Microorganisms(BCCM)Laboratorium voor Moleculaire Biologie-Plasmidecollectie(LMBP)University GentK.L.Ledeganckstraat 35B-9000 Gent，Belgium实施例实施例1 嵌合基因的构建1.1包含于T-DNA载体中的CaMV35S-AthcycD2嵌合基因的构建用Klenow聚合酶处理包含编码来自拟南芥的CYCD2 DNA片段(EMBL注册号X83370从194-1332位核苷酸序列)使突出未端成为平端并将其连入用SmaI线性化的pART7(Gleave，1992)，产生质粒pCEC1。通过这种方法，构建了两侧带有NotI位点的嵌合基因，其中编码CYCD2的DNA与CabbB-J1分离物(Harpster等，1988)的CaMV35S启动子和3′ocs区(Mac Donald等，1991)可操作连接。然后将嵌合基因插入也包含可选择嵌合标记基因的T-DNA载体中的T-DNA边界序列之间。
为了达到这个目的，用NotI从pCEC1中切下嵌合cycD2基因并将其连入NotI线性化的pART27(Gleave，1992)中以制备pCEC5。pART27包含由下列可操作连接序列组成的嵌合可选择标记基因胭脂碱合酶基因启动子、neo编码区及胭脂碱基因的3′末端(An等，1988)。
选择性地，用适当的限制酶(如NotI)从pCEC1中切下嵌合cycD2基因并将它和可选择嵌合标记基因(pSSU-bar-3′ocs；De Almeida等，1989)导入T-DNA载体pGSV5 T-DNA边界序列间的多接头以产生pCEC5b。
pGSV5来自质粒pGSC1700(Cornelissen和Vandewiele，1989)但与后者的区别在于它不含β-内酰胺酶并且其T-DNA特征是SEQ IDNo.6的序列。1.2包含于T-DNA载体中的CaMV35S-AthcysD3嵌合基因的构建分离cycD3 cDNA的1335bp BslI-DraI片段，用Klenow聚合酶处理使其成为平端(具有EMBL注册号X83371的104-1439位核苷酸序列)并插入到pUC18的SmaI位点产生pRS14a。此克隆含有cycD3的全部编码序列，其翻译起始密码子位于pUC18SmaI切割位点之后与之紧密相邻，pUC18的SacI位点位于cyc3 cDNA的5′端而BamHI位点位于3′端。分离1.35Kb的pRS14a SacI-BamHI片段并将之与约266Kb的pSLJ94的SacI-BamHI片段连接(Jones等，1992)产生pCRK9。通过这种方式构建了嵌合基因，其中拟南芥的cycD3编码区的DNA与CaMV35S启动子和3′ocs区可操作连接。在pCRK9中嵌合基因位于T-DNA边界序列之间并伴随有嵌合的选择性neo基因(Jones等，1992)。
可选择地，用适当的限制酶从pRS14a上切下嵌合的cycD3基因并将它与选择性嵌合标记基因(pSSU-bar-3′ocs；De Almeida等，1989)共同导入T-DNA载体pGSV5的T-DNA边界序列间的多接头产生pCRK9b。实施例2土壤杆菌介导的用实施例1的T-DNA载体转化烟草根据Walkerpeach和Velten(1995)描述的用电穿孔将T-DNA载体pCEC5和pCRK9导入根瘤土壤杆菌LBA4404(Klapwijk等，1980)并分别用壮观霉素和四环素筛选转化子。
用三亲杂交(Ditta等，1980)将T-DNA载体pCEC5b和pCRK9b导入根瘤土壤杆菌C58C1RifR。
用An等(1985)描述的叶盘转化方法，用得到的土壤杆菌株转化烟草var Xanthi。
产生了8株转化了pCRK9的烟草(命名为1K9、2K9、3K9、4K9、8K9、10K9、17K9、19K9和28K9)及11株转化了pCEC5的烟草(命名为C8系1-3和5-12)。
用pRS14a的标记的cDNA插入物作探针通过Southern杂交分析转化了pCRK9T-DNA的植物中的插入的转基因的拷贝数。2K9、3K9和4K9每一个都有1拷贝的转基因，而1K9包含了拷贝转基因。
用从转化了pCEC5 T-DNA的植物中制备的BamHI消化的DNA以及标记的J22cDNA的0.7Kb NcoI-EcoRI片段(包含部分cycD2编码区；Soni等，1995)通过Southern杂交分析这些植物中插入的转基因拷贝数。株系C8-2、C8-3、C8-5、C8-8、C8-1、C8-9、C8-10、C8-11、C8-12都有1拷贝的转基因，株系C8-7有两个拷贝、株系C8-6有3个拷贝以及C8-1有4个拷贝转基因。
T0(原始转化子)自身受精并产生种子(T1种子)。从T1种子栽培的植物命名为C8-T1-X，X代表原始转化子的株系号。T1植物的种子称为T2种子；将从这样的种子栽培的植物命名为C8-T2-X，X同样代表原始转化子的品系数。若不损及代数，植物从T1种子栽培而来。
Narthern分析证实了转基因至少在品系C8-1、C8-3、C8-7、3K9、4K9和8K9中转录。实施例3转化烟草的表型分析3.1包含CaMV35S-AthCycD2嵌合基因的烟草原始转化子(T0植物)的种子在10％漂白剂中表面消毒10分钟并用无菌水彻底洗涤。表面消毒的种子在含有终浓度为100ug/ml卡那霉素的GM培养基上发牙。将平板上的种子于4℃放置5天(春化)然后移至23℃的生长室中。所有的时间点指放在生长室的天。移至生长室后18天(即总共23天后)，将卡那霉素抗性的幼小植物移植到含土的种子盘中并在生长室中18小时光周期下生长。再过10天后，将植物移至3英寸的植物盆中，再过15天后至8英寸植物盆中，一直到实验结束。3英寸和8英寸植物盆在补充了额外光照达到18小时光周期的温室中培养。将植物随机放在温室中。
两天后开始测量(即45天后或在土壤中27天后，指第一周)，合适时，每周重复一次共七周。每株系分析的植物数如下C8-122株、C8-2 7株、C8-3 22株、C8-5 8株、C8-6 6株、C8-7 22株、C8-8 5株、C8-9 6株 C8-10 4株、C8-11 6株、C8-12 5株、未转化对照(野生型)34株。
分析了下列参数；从土壤表面至最高点(即；生长锥；在表1中总结为平均高度土±标准差cm)的植物高度；在一定的时间最大叶的长度(表2中总结为平均长度±标准差cm)；肉眼可见花序分生组织(0.25cm和1cm花序)时间(在表3中总结为平均时间±标准差天)；花序分生组织可见的高度(在表3中总结为平均长度±标准差cm)；花瓣管的长度、花瓣管领的宽度(在表3中总结为平均长度和宽度±标准差mm)；每株植物粒荚(seed pod)的总数以及每株植物的平均种子产量(以重量为基础)。
从幼苗期表现出明显的生长速度增加的转基因植物产生大的平均基高(表1)。在3周时，所有的转基因品系明显地比未转化对照大(t-测验；置信水平95％)，而品系C8-1、C8-2、C8-3、C8-5、C8-11明显地比未转化对置大，置信水平99％。生长速度提高也导致在所指时间较大的叶子，与叶子扩展继续时期一致(表2)以及较大的花，其中转基因植物的花瓣管平均比未转化植物花的花瓣管长。
转基因植物的花数目、受精花数量增加导致了粒荚数量大及每株植物种子产量更大(数据总结于表4A)。而且，每粒荚中种子的数目在转基因植物的比野生型对照大。品系(8-T1-6偏离的种子产量由于高百分数花脱落的缘故。
可以推断，Ath CycD2编码DNA的组成型表达导致了每株植物粒荚数目和种子总产量的增加。
最后，比较了野生型幼苗和转基因幼苗根的发育(表4B)。将种子消毒，播种在无选择的GM培养平板上、春化后以垂直位置贮存于生长室中。春化后9天和13天测量根的长度并记录侧根的出现。使用了C8-T1-7和C8-T2-2(纯合的)的种子。品系C8-T1-7含两个在卡那霉素平板上以约15∶1分离的插入物。载培了这个品系的35株幼苗，其中的3株代表了野生型幼苗中观察到的生长速度。春化后9天单独记录了这些幼苗的数据。T-测验用于检测平均差异的意义，意义水平示于表中。ns代表样品之间无明显差异。由此看来根发育相等的增长平衡了顶端部分营养生长的增加。
表1包含CaMV35S-AtcycD2的转化烟草植物的平均高度(cm)
表2包含CaMV35S-AtcycD2的转化烟草植物最大叶片的平均叶长(cm)
<p>表3A.用CaMV3SAthCycD2转化的烟草中的花发育[到0.25cm或1cm花序的平均高度(cm)，nent of an达到0.25或1cm花序发育所需的平均时间(春化后天数)]<
<p>表3B用CaMV35SAthCycD2转化的烟草中的花发育[平均花大小即长度和宽度(mm)]。每株植物测定5朵花的长度和宽度并计算每个转基因株系的平均花长度或宽度。使用T测试将每个独立转基因株系的数值与野生型比较。表中揭示了概率水平，与野生型相比结果是统计学上显著的。ns指不显著
<p>表4A用CaMV35SAthCycD2转化的烟草中每株植物粒荚的平均数、六个粒荚种子内容物的平均重量(g)和每株植物的平均种子产量(g
表4B野生型和转基因幼苗中根发育的比较
3.2包含CaMV35S-AthCycD3嵌合基因的烟草植物从T1种子培养包含CaMV35S-AthCycD3的植物并如3.1中所述进行处理，萌发后49天时开始，以约7天的间隔进行测定。对每个株系分析以下数目的植物株系1K9为11株植物；株3K9为19株植物，株系4K9为20株植物，并且有18株植物用作非转化对照。
分析下列参数花瓣管长度和宽度(cm)以及至少75％的植物达到至少其中花序明显发育的阶段的时间(天)，总结在表5中。表5对包含CaMV35SAthCycD3嵌合基因的烟草植物的测定的总结
这些转基因植物有更大的花，其中转基因植物的花瓣管比非转基因植物的花瓣管平均更长，并且也需要更多的时间达到其中花序明显发育的阶段。实施例4来自其它植物的cyc-D同源基因的分离将从指数生长的烟草BY-2细胞制备的cDNA文库构建到λZapExpress载体(Stratagene)中。平板上长出大约7.5×105个文库克隆，使用Hybond N+尼龙膜(Amersham Int.)从每个平板制备复制印迹，然后通过在80℃烘2小时进行固定。用通过随机引物法α32PdCTP标记的cycD2或cycD3异源探针杂交膜。cycD3探针包含来自拟南芥的cycD3片段(405bp Hinc II-Kpn I片段，具有EMBL登记号X83371从核苷酸位557到核苷酸位962的核苷酸序列)。cycD2探针由来自拟南芥的cycD2的1298bp的NcoI-SacI片段组成(具有EMBL登记号X83370从核苷酸位194到核苷酸位1332的核苷酸序列)。cycD3杂交在55℃进行并且膜在2×SSC/0.1％SDS中洗2次各10分钟，然后在放射自显影前在0.1SSC/0.1％SDS中洗一次10分钟。cysD2杂交在48℃进行；膜在2×SSC/0.1％SDS中洗三次各10分钟。所有洗涤在室温进行。将分离的文库克隆切出(按厂商说明)以得到pBK-CMV噬菌粒(Stratagene)中的亚克隆，并且按标准方法对DNA序列进行测定。使用GCG(genetic Computer Group)软件(1994)分析序列信息。来自烟草的cycD2；1，cycD3；1和cycD3；2 cDNA序列分别用SEQ ID NO.1，SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3表示。
从洋姜的块茎、根和叶子分离的多腺苷酸化RNA制备另一cDNA文库。从寡脱氧胸苷酸[oligo(dT)]引物合成cDNA并将其连接入λZAPII载体的EcoRI位点。
平板上长出约1.25×106个克隆，如上所述制备复制噬菌斑印迹并如上所述用标记的探针杂交。另外用包含拟南芥的cycD1基因的401bp的XbaI-AvaI片段的cycD1(具有EMBL登记号X83369从核苷酸位312到核苷酸位713的核苷酸序列)探针筛选印迹。如上分析分离的克隆。来自洋姜的cycD1；1和cycD3；1基因分别用SEQ ID NO.4和SEQ IDNO.5表示。
从玉米(Pa91×H99)×H99的愈伤组织材料分离的多聚腺苷酸化RNA制备另一cDNA文库。从寡脱氧胸苷酸引物合成cDNA并将其连入λZAPII载体的EcoRI位点。平板上长出的1.25×106个克隆并如上所述制备复制噬菌斑印迹并如上述使用标记的探针杂交。如上分析分离的克隆。来自玉米的cycD2 cDNA的序列在SEQ ID NO.21中表示。实施例5反义嵌合基因的构建和烟草的转化包含编码来自拟南芥的CYCD2的DNA的1298bp NcoI-SacI片段(具有EMBL登记号X83370从核苷酸位194到核苷酸位1332的核苷酸序列)用Klenow聚合酶处理以进行突出末端补平并与SmaI切开的pART7(Gleave，1992)连接。筛选其中插入的DNA片段以编码CYCD2的DNA以反向导入CabbB-J1分离物(Harpster等，1998)的CaMV35S启动子和3′ocs区域(MacDonald等，1991)之间的方向的质粒，使得一旦表达得到反义RNA。
然后将嵌合反义基因插入也包含可选择的嵌合标记基因的T-DNA载体的T-DNA边界之间。为此，使用NotI从pCEC2切出嵌合cycD2基因，并与NotI切开的pART27(Gleave等，1992)连接以得到pCEC6。
如实施例2中所述用此嵌合基因转化烟草植物。实施例6转化子的分析如实施例3.1中所述处理实施例5中的用嵌合基因转化的植物并分析下列数目的植物株系C9-2为7株植物，并且株系C9-7为6株植物。
分析下列参数从土壤表面到最高点的植物高度(总结于表6中，作为以cm表示的平均长度±标准偏差)；在特定时间的最大叶片的长度(总结在表7中，作为以cm表示的平均长度±标准偏差)；花序分生组组用裸眼可见的时间(总结于表8中，作为以天表示的平均时间±标准偏差)，花序分生组织可见时的高度(总结于表8中，作为以cm表示的平均高度±标准偏差)。
转基因植物从苗期明显表现下降的生长率，导致更小的平均茎高度(表6)。降低的生长率也导致在表示的时间叶子平均更小，这与叶片伸展持续时期一致(表7)。表6包含CaMV35S反义cycD2的转化烟草植物的平均高度(cm
<p>表7包含CaMV35S反义cycD2的转化烟草植物最大叶片的平均长度和非转化烟草植物最大叶片的平均长度的不同
实施例7用实施例1的T-DNA和相似载体转化油籽油菜并分析转化的植物基本上按De Block等(1989)所述获得、培养和转化油籽油菜的胚轴外植体，除了以下修饰-胚轴外植体在A2培养基上[MS，0.5g/l Mes(pH5.7)，1.2％葡萄糖0.5％琼脂，1mg/l 2，4-D，0.25mg/l萘乙酸(NAA)和1mg/l 6-苯甲基氨基嘌呤(BAP)]预培养1天。-侵染培养基A3是MS，0.5g/l Mes(pH5.7)，1.2％葡萄糖，0.1mg/LNAA，0.75mg/l BAP和0.01mg/l赤霉酸(GA3)。-选择培养基A5G是MS，0.5g/l Mes(pH5.7)，1.2％葡萄糖，40mg/l硫硫酸腺嘌呤，0.5g/l聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，0.5％琼脂，0.1mg/l NAA，0.75mg/l BAP，0.01mg/l GA3，250mg/l羧苄青霉素，250mg/ltriacillin，5mg/l AgNO3，培养三周。之后在A5J培养基(与A5G相同但加有3％蔗糖)上继续进行选择。-再生培养基A6是MS，0.5g/l Mes(pH5.7)，2％蔗糖，40mg/l硫酸腺嘌呤，0.5g/l PVP，0.5％琼脂，0.0025mg/l BAP和250mg/ltriacillin。-将健康芽转至生根培养基A9半浓度MS，每升容器中1.5％蔗糖(pH5.8)，100mg/l triacillin，0.6％agar。MS标准Murashige和Skoog培养基(Murashige和Skoog，1962)。
用根瘤土壤杆菌菌株C58ClRifR侵染胚轴外植体，菌株C58ClRifR携带辅助Fi质粒如PGV4000，PGV4000是通过将与T-DNA载体pGV5有同源性的2.5Kb片段连接的细菌氯霉素抗性基因插入pMP90(Koncz和Schell，1986)得到的pMP90的衍生物，而从PGSV5衍生的T-DNA载体在T-DNA边界之间包含实施例1的嵌合基因和嵌合标记基因(pCE C5b和pCRK96)。
包含本发明嵌合基因的转基因油籽油菜植物表现加速的营养程序(增加的生长率)、达到开花阶段所需的时间减少、增加的开花数和增加的每株植物种子产量。实施例8 用实施例1的载体和相似载体转化玉米植物以及转化植物的分析按照WO92/09696用实施例1的载体转化玉米植物。包含本发明嵌合基因的转基因玉米植物表现加速的营养程序(增加的生长率)、达到开花阶段所需的时间减少、增加的开花数和增加的每株植物种子产量。实施例9 用实施例1的载体和相似载体转化烟草植物以及转化植物的分析按照De Block等(1987)用实施例1的载体转化烟草植物，包含本发明的嵌合基因的转基因烟草植物表现加速的营养程序(增加的生长率)、达到开花阶段所需的时间减少、增加的开花数和增加的每株植物种子产量。实施例10 用实施例1的载体和相似载体转化莴苣植物以及转化植物的分析按照Micheimore等(1987)用实施例1的载体转化莴苣植物，包含本发明的嵌合基因的转基因莴苣植物表现加速的营养程序(增加的生长率)、达到开花阶段所需的时间减少、增加的开花数和增加的每株植物种子产量。实施例11对用实施例3的CaMV35SAthCycD2构建体转化的转基因烟草株系的子代分离和非分离种群的进一步表型分析。
对来自用CaMV35SAthCycD2构建体转化的两个转基因株系(实施例3的株系2和株系5)的植物子代种群(分离或非分离的)分析至花开花的时间长度并通过测定茎的平均长度或植物的平均干重分析营养生长的增加。
通过建立对卡那霉素的抗体监测转基因的分离。对于分离种群，分析32株植物，而对于非分离种群，分析12株植物。非转化种群也由12株植物组成。
使用下列种群分离种群株系2
C8-T1-2[来自C8-2原始转化子的T1种子；对于T-DNA是3∶1分离]C8-T2-2[来自C8-T1-2植物#3自交的T2种子，是半合的，因此种子对于T-DNA是3∶1分离]C8-T2-2[来自C8-T1-2植株#3与野生型植物杂交的T2种子，使用野生型作为花粉亲本。此种子对于T-DNA是1∶1分离，并且所有含有T-DNA的植物是半合的]株系5C8-T1-5[来自C8-5原始转化子的T1种子；对于T-DNA是3∶1分离]C8-T2-5[来自C8-T1-5植株#304自交的T2种子，是半合的，并且因此种子对于T-DNA是3∶1分离]非分离种群株系2C8-T2-2[来自C8-T1-2植株#302自交的T2种子，对于T-DNA是纯合的]株系5C8-T2-5[来自C8-T1-5植株#121与野生型植物杂交的T2种子，使用野生型作为花粉亲本。植物#121对于T-DNA是纯合的并且所有T2种子对于T-DNA是半合的]C8-T2-5[来自C8-T1-5植株#121自交的T2种子。植物#121对于T-DNA是纯合的，并且所有T2种子对于T-DNA是纯合的]测定CycD2过量表达对转基因烟草中到达起始花序发育的时间的影响并且使用t测试将其与对野生型对照种群测定的相同参数值进行统计学比较，其中假定野生型和转基因种群的方差相同。记录每株植物发育0.5cm花序的时间长度并计算春化后天数的平均数。使用t测试，将每一转基因种群的数值与野生型种群的数值比较。对于分离株系的数据，将卡那霉素抗性种群和卡那霉素敏感种群的数据分开。对于卡那霉素抗性种群的数据也分开表示纯合卡那霉素抗性亚种群(不再分离)和半合卡那霉素抗性亚种群(进一步3∶1分离)。在表9中总结了这些数据。表10总结了与野生型种群相比，转基因非分离株系在春化后不同时间茎高的平均值。小于0.5的显著水平被认为是每一转基因株系的平均长度和对照的平均长度之间有高度显著差异。ns表示种群间没有显著差异。另外，将早期营养生长过程中来自所述非分离种群的幼苗生物质与野生型幼苗比较。幼苗在春化后所示天数收获并在70°干燥两天前后称重。计算幼苗的平均干重和标准偏差并且结果表示在表11中。表9转基因烟草中CycD2对到起始花序发育时间的长度的影响
表10 包含CaMV 35SAthCycD2的转基因烟草与野生型对照的茎高的统计学比较<
表11从春化后不同点的过量表达Cyc D2的转基因幼苗的非分离种群和野生型(WT)幼苗得到的干重测量值总结。在所有情况中，T测试表明在每一转基因株系的平均生物质和对照的平均生物质之有高度显著差异。
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序列表(1)基本信息(i)申请人(A)名称Cambrige University technical service Ltd.
(B)街道The Old Schools Trinity Lane(C)城市Cambrige(E)国家United Kingdom(F)邮政编号(zip)CB21T5(G)电话44-1223334755(H)传真44-1223332797(ii)发明名称生长得到改造的植物(iii)序列数21(iv)计算机可读形式(A)介质类型软盘(B)计算机IBM PC兼容机(C)操作系统PC-DOS/MS-DOS(D)软件PatentIn Release#1.0，版本#1.30(EPO)(2)关于SEQ ID NO1的信息(i)序列特征(A)长度1284个碱基对(B)类型核酸(C)链型双链(D)拓扑结构线型(ii)分子类型cDNA至mRNA(iii)假设否(iii)反义否(vi)原始来源
(A)生物烟草(ix)特征(A)名称/关键-(B)位置182..1243(xi)序列描述SEQ ID NO1CAAATTTTTC TCCCTTCTAT AGTCTCTTTC CTGTTCTCTT AAAAATCCTT AAAAATTTAT 60TTTTTTTAAC AATCTCATGT AAATGGGATT AAATTTTGTA AAAATATAAG ATTTTGATAA 120AGGGGGTTTA ATTATAACAT AGTAAATTAA GATTTTTTTT TTGCTTTGCT AGTTTGCTTT 180AATGGCAGCT GATAACATTT ATGATTTTGT AGCCTCAAAT CTTTTATGTA CAGAAACAAA 240AAGTCTTTGT TTTGATGATG TTGATTCTTT GACTATAAGT CAACAGAACA TTGAAACTAA 300GAGTAAAGAC TTGAGCTTTA ACAATGGTAT TAGATCAGAG CCATTGATTG ATTTGCCAAG 360TTTAAGTGAA GAATGCTTGA GTTTTATGGT GCAAAGGGAA ATGGAGTTTT TGCCTAAAGA 420TGATTATGTC GAGAGATTGA GAAGTGGAGA TTTGGATTTG AGTGTGAGAA AAGAGGCTCT 480TGATTGGATT TTGAAGGCTC ATATGCACTA TGGATTTGGA GAGCTGAGTT TTTGTTTGTC 540GATAAATTAC TTGGATCGAT TTCTATCTCT GTATGAATTG CCAAGAAGTA AAACTTGGAC 600AGTGCAATTG TTAGCTGTGG CCTGTCTATC ACTTGCAGCC AAAATGGAAG AAATTAATGT 660TCCTTTGACT GTTGATTTAC AGGTAGGGGA TCCCAAATTT GTATTTGAAG GCAAAACTAT 720ACAAAGAATG GAACTTTTGG TATTAAGCAC ATTGAAGTGG AGAATGCAAG CTTATACACC 780TTACACATTC ATAGATTATT TTATGAGAAA GATGAATGGT GATCAAATCC CATCTCGGCC 840GTTGATTTCT GGATCAATGC AACTGATATT AAGCATAATA AGAAGTATTG ATTTCTTGGA 900ATTCAGGTCT TCTGAAATTG CAGCATCAGT GGCAATGTCT GTTTCAGGGG AAATACAAGC 960AAAAGACATT GATAAGGCAA TGCCTTGCTT CTTCATACAC TTAGACAAGG GTAGAGTGCA1020GAAGTGTGTT GAACTGATTC AAGATTTGAC AACTGCTACT ATTACTACTG CTGCTGCTGC1080CTCATTAGTA CCTCAAAGTC CTATTGGAGT GTTGGAAGCA GCAGCATGCT TGAGCTACAA1140AAGTGGTGAT GAGAGAACAG TTGGATCATG TACAACTTCT TCACATACTA AAAGGAGAAA1200ACTTGACACA TCATCTTTAG AGCATGGGAC TTCAGAAAAG TTGTGAATCT GAATTTTCCC1260TTTTTAAAAAAAAAAAAAA AAAA 1284(2)关于SEQ ID NO2的信息(i)序列特征(A)长度1679个碱基对(B)类型核酸(C)链型双链(D)拓扑结构线型(ii)分子类型cDNA至mRNA(iii)假设否(iii)反义否(vi)原始来源(A)生物烟草(ix)特征(A)名称/关键-(B)位置182..1299(C)其它信息/备注＝“编码细胞周期蛋白CYCD3；1的cDNA”(xi)序列描述SEQ ID NO2AAACGAGTCT CTGTGTACTC CTCCTCCTAT AGCTTTTCTC TCTTCTTCTC TTCACACCTC60CCACAACACA CAATCAGACA AAATAGAGAG GAAAATGAGT ATGGTGAAAA AGCTTTGTTT 120TGTATAATGA GAAAAAGAGA TTTATATACA TCTCTTCTTC TACTTCCTTC TTACTAGAAG 180ATGGCAATAG AACACAATGA GCAACAAGAA CTATCTCAAT CTTTTCTTTT AGATGCTCTT 240TACTGTGAAG AAGAAGAAGA AAAATGGGGA GATTTAGTAG ATGATGAGAC TATTATTACA 300CCACTCTCTT CAGAAGTAAC AACAACAACA ACAACAACAA CAAAGCCTAA TTCTTTATTA 360CCTTTGCTTT TGTTGGAACA AGATTTATTT TGGGAAGATG AAGAGCTTCT TTCACTTTTC 420TCTAAAGAAA AAGAAACCCA TTGTTGGTTT AACAGTTTTC AAGATGACTC TTTACTCTGT 480TCTGCCCGTG TTGATTCTGT GGAATGGATT TTAAAAGTGA ATGGTTATTA TGGTTTCTCT 540GCTTTGACTG CCGTTTTAGC CATAAATTAC TTTGACAGGT TTCTGACTAG TCTTCATTAT 600CAGAAAGATA AACCTTGGAT GATTCAACTT GCTGCTGTTA CTTGTCTTTC TTTAGCTGCT 660AAAGTTGAAG AAACTCAAGT TCCTCTTCTT TTAGATTTTC AAGTGGAGGA TGCTAAATAT 720GTGTTTGAGG CAAAAACTAT TCAAAGAATG GAGCTTTTAG TGTTGTCTTC ACTAAAATGG 780AGGATGAATC CAGTGACCCC ACTTTCATTT CTTGATCATA TTATAAGGAG GCTTGGGCTA840AGAAATAATA TTCACTGGGA ATTTCTTAGA AGATGTGAAA ATCTCCTCCT CTCTATTATG900GCTGATTGTA GATTCGTACG TTATATGCCG TCTGTATTGG CCACTGCAAT TATGCTTCAC960GTTATTCATC AAGTTGAGCC TTGTAATTCT GTTGACTACC AAAATCAACT TCTTGGGGTT 1020CTCAAAATTA ACAAGGAGAA AGTGAATAAT TGCTTTGAAC TCATATCAGA AGTGTGTTCT 1080AAGCCCATTT CACACAAACG CAAATATGAG AATCCTAGTC ATAGCCCAAG TGGTGTAATT 1140GATCCAATTT ACAGTTCAGA AAGTTCAAAT GATTCATGGG ATTTGGAGTC AACATCTTCA 1200TATTTTCCTG TTTTCAAGAA AAGCAGAGTA CAAGAACAGC AAATGAAATT GGCATCTTCA 1260ATTAGCAGAG TTTTTGTGGA AGCTGTTGGT AGTCCTCATT AAAATCAATC ACCTGATTTA 1320TCTCTTTTCT TTCTTATTAC CAACTATGGT GGTAATAATA TTTATTGATA TTCAGAAGTA 1380TTTACCTTTA ATGTCATTTT CAAAAATTAC ATGAAAATGG AAAAAAAGAA AAGAAGAGCT 1440TAGCTGGTGG TTGCAGTTGG CAGAGAAGAG GACTGGCTTT TTTTTGCAGG AGTGTAGTCT 1500ACTACTACTG GAAAGCAGAG ATAGAGAGAG GAGAAAAGAC AGAAAATCTG CACTATTTGT 1560TTTTTCTCTA TTCATATCAA TTCTCTCTTA GGTCCTTTTC ATGCATGCAT ACTTTTGATG 1620GACATATTTT ATATATTTAC TATAATCATA AATTCTTGAA TAAAAAAAAA AAAAAAAAA1679(2)关于SEQ ID NO3的信息(i)序列特征(A)长度1431个碱基对(B)类型核酸(C)链型双链(D)拓扑结构线型(ii)分子类型cDNA至mRNA(iii)假设否(iii)反义否(vi)原始来源(A)生物烟草(ix)特征(A)名称/关键-(B)位置198..1298
(C)其它信息/备注＝“编码细胞周期蛋白CYCD3；2的cDNA”(xi)序列描述SEQ ID NO3CACCTTTACT CTCTTCTCCT TTTTGGCTCT TCCCATTCTC TCCTTCTCTT TCTTTATTTT 60CTGTCCTGTA GAGAGAGAGA GAAAGTATAA GCAAAGCAGC AGATATGTTA CTGGGTCCAA 120GATTGAGTTT TGGCTTACCT TGAAGATAAT GAGTAGAGCC TCCATTGTCT TCTTCCGTCA 180AGAAGAAGAA GAAGAAGATG GTTTTCCCTT TAGATACTCA GCTCCTAAAT CCAATCTTTG 240ATGTCCTTTA CTGTGAGGAA GATCGATTCT TGGACGATGA TGATTTAGGA GAATGGTCTA 300GTACTTTAGA ACAAGTAGGA AATAATGTGA AAAAGACTCT ACCTTTATTA GAATGTGACA 360TGTTTTGGGA AGATGACCAG CTTGTCACTC TTTTAACTAA GGAAAAAGAG TCTCATTTGG 420GTTTTGATTG TTTAATCTCA GATGGAGATG GGTTTTTAGT GGAGGTTAGA AAAGAGGCAT 480TGGATTGGAT GTTGAGAGTC ATTGCTCACT ATGGTTTCAC TGCTATGACT GCTGTTTTAG 540CTGTGAATTA TTTTGATAGG TTTGTATCTG GACTCTGCTT TCAGAAAGAT AAGCCTTGGA 600TGAGTCAACT TGCTGCTGTG GCTTGTCTTT CTATTGCTGC TAAAGTGGAA GAGACCCAAG 660TCCCCCTTCT CTTAGACCTC CAAGTGGCTG ATTCAAGATT TGTGTTTGAG GCAAAGACTA 720TTCAGAGAAT GGAACTCTTG GTGCTCTCCA CTCTTAAGTG GAAAATGAAT CCAGTGACAC 780CACTATCTTT CATTGATCAT ATCATGAGGA GATTTGGATT CATGACCAAT CTACATTTGG 840ATTTTCTTAG GAGATGTGAA CGCCTCATTC TTGGTATTAT CACTGATTCT AGGCTCTTGC 900ATTATCCTCC ATCTGTTATT GCAACTGCAG TAGTGTATTT CGTGATCAAT GAGATTGAGC 960CTTGCAATGC AATGGAATAC CAGAATCAGC TCATGACTGT TCTTAAAGTC AAACAGGATA1020GTTTTGAAGA ATGCCATGAT CTTATTCTAG AGCTAATGGG CACTTCTGGC TACAATATCT1080GCCAAAGCCT CAAGCGCAAA CATCAATCTG TACCTGGCAG TCCAAGTGGA GTTATCGATG1140CATATTTTAG TTGCGACAGC TCTAATGATT CGTGGTCGGT AGCATCTTCA ATTTCATCGT1200CACCAGAACC TCAGTATAAG AGGATCAAAA CTCAGGATCA GACAATGACA CTGGCTCCAC1260TGAGTTCTGT TTCTGTCGTT GTGGGCAGTA GTCCTCGTTG ATCAGTATCT CATTCTCTAG1320ATTATCTAGT ATTACGGCTA TGGTTACTAT ATGATCTCTC TTTTTTGGTA TGTTCTCTTA1380AACTGCAGTT GCACAATGCT CTGATGTTCC ATTAAAAAAA AAAAAAAAAA A 1431(2)关于SEQ ID NO4的信息(i)序列特征(A)长度1788个碱基对(B)类型核酸
(C)链型单链(D)拓扑结构线型(ii)分子类型cDNA至mRNA(iii)假设否(iii)反义否(vi)原始来源(A)生物洋姜(ix)特征(A)名称/关键-(B)位置165..1109(C)其它信息/备注＝“编码细胞周期蛋白CYCD1；1的cDNA”(xi)序列描述SEQ ID NO4CACAACAATC ACTTCTACTC ACTATTCACT ACTTACTAAT CACTGCAACT TCTCCGGCCA 60CTTTTCACCT CAAACCGCCG GAACTCCGCC GCTCCGGTCG ACGGTGAATC ACTGAATCTT 120AGCAATTATG TTCACAACAG TATGAACAAT CAACACCGGT CATCATGTCA ATCTCGTGCT 180CTGACTGCTT CTCCGACTTA CTCTGCTGCG AGGACTCCGG CATATTATCC GGCGACGACC 240GGCCGGAGTG CTCCTATGAT TTCGAATATT CCGGCGACTT TGATGATTCG ATCGCGGAGT 300TTATAGAACA GGAGAGAAAG TTCGTTCCAG GAATCGATTA CGTCGAGCGA TTTCAATCGC 360AAGTTCTCGA TGCTTCTGCT AGAGAAGAAT CGGTTGCCTG GATCCTTAAG GTGCAACGGT 420TTTACGGATT TCAGCCGTTG ACGGCGTACC TCTCCGTTAA CTATCTGGAT CGTTTCATCT 480ATTGCCGTGG CTTCCCGGTG GCAAATGGGT GGCCCTTGCA ACTCTTATCT GTAGCATGCT 540TGTCTTTAGC TGCTAAAATG GAGGAAACCC TTATTCCTTC TATTCTTGAT CTCCAGGTTG 600AAGGTGCAAA ATATATTTTC GAGCCGAAAA CAATCCGAAG AATGGAGTTT CTTGTGCTTA 660GTGTTTTGGA TTGGAGACTA AGATCCGTTA CACCGTTTAG CTTTATCGGC TTCTTTTCGC 720ACAAAATCGA TCCATCTGGA ATGTATACGG GTTTCCTTAT CTCAAGGGCA ACACAAATTA 780TCCTCTCAAA TATTCAAGAA GCTAGTTTAC TTGAGTATTG GCCATCATGT ATTGCTGCTG 840CAACAATACT TTGTGCAGCA AGTGATCTTT CTAAATTCTC ACTTATCAAT GCTGATCATG 900CTGAATCATG GTGTGATGGC CTTAGCAAAG AGAAGATCAC AAAATGTTAC AGACTTGTAC 960AATCTCCAAA GATATTGCCG GTACATGTTC GAGTCATGAC GGCTCGAGTG AGTACTGAGT 1020CAGGTGACTC ATCGTCGTCG TCTTCTTCGC CATCGCCTTA CAAAAAGAGG AAACTAAATA 1080ACTACTCATG GATAGAGGAG GACAAAAGAT GAAAATAAGG AGACAAAATA AATAAATAAA 1140TCCGGATTCC TCTCTATATT TTTTAAAGGA ATCAACAAAT ATATATAAAA AAAAAAAATG 1200GAGTCAGGAA AAGCAACGAA AGCCGCCGGA GGAAGAAAAG GCGCCGGAGC GAGGAAGAAG 1260TCCGTCACAA AGTCCGTCAA AGCCGGTCTC CAGTTCCCCG TCGGAAGAAT CGCTAGGTTT 1320CTAAAAAAAG GCCGATACGC TCAACGTACC GGATCCGGAG CTCCGATCTA CCTTGCTGCT 1380GTTCTAGAAT ACCTTGCTGC TGAGGTTTTG GAGTTGGCGG GAAATGCAGC GAGAGATAAC 1440AAGAAGACAA GGATAAACCC TAGGCACTTG CTATTGGCTG TTAGGAACGA TGAGGAATTG 1500GGGAAATTGC TTGCTGGTGT TACTATTGCT AGTGGAGGTG TGTTGCCCAA TATCAATCCG 1560GTTCTTTTGC CCAAGAAGTC TTCTTCTTCT TCTGCTGCTG AGAAGACCCC CAAATCTAAA 1620AAGTCGCCTA AAAAGGCTGC TTAGATAGAT GTTTCTGGTT ATAGTTGGTT AGATTAAGTT 1680GAAGCAAAAC AGTCTCTTTT GTTCAATTAG TCGTCTGGCA ATGTAACTAT TTTGGTCGTC 1740TTCAAAATGT TAATTGGATA CTATCTTCTT TAAAAAAAAA AAAAAAAA 1788(2)关于SEQ ID NO5的信息(i)序列特征(A)长度1414个碱基对(B)类型双酸(C)链型单链(D)拓扑结构线型(ii)分子类型cDNA至mRNA(iii)假设否(iii)反义否(vi)原始来源(A)生物洋姜(ix)特征(A)名称/关键-(B)位置48..1118(C)其它信息/备注＝“编码细胞周期蛋白CYCD3；1的cDNA”(xi)序列描述SEQ ID NO5TTGAACCTTC ATTTCTTTTC TTTTCTTCTT TCTAATCACC AACCCCAATG GCCATTTTAT 60CACCATATTC ATCTTCTTTC TTAGACACAC TCTTTTGCAA TGAACAACAA GATCATGAAT 120ATCATGAATA TGAGTATGAA GATGAATTTA CACAAACCAC CCTCACAGAT TCATCTGATC 180TCCATCTTCC CCCCCTGGAC CAACTAGATT TGTCATGGGA ACATGAAGAG CTTGTGTCCT 240TGTTCACAAA AGAACAAGAG CAGCAAAAAC AAACCCCTTG TACTCTCTCT TTTGGCAAAA 300CTAGTCCCTC AGTTTTTGCT GCTCGTAAAG AGGCTGTAGA TTGGATCCTT AAGGTCAAAA 360GTTGTTATGG ATTCACACCT CTTACAGCCA TTTTAGCCAT CAATTATCTT GATAGGTTTC 420TTTCTAGCCT CCATTTTCAA GAAGATAAAC CTTGGATGAT TCAACTTGTT GCTGTTAGTT 480GTCTCTCTTT AGCTGCTAAA GTTGAAGAAA CTCAAGTGCC ACTCTTACTA GATCTTCAAG 540TAGAGGACAC TAAGTACTTG TTTGAGGCTA AAAACATACA AAAAATGGAG CTTTTGGTGA 600TGTCAACTTT GAAATGGAGG ATGAACCCAG TGACACCAAT CTCATTTCTT GATCACATTG 660TAAGAAGGCT TGGATTAACT GATCATGTTC ATTGGGATTT TTTCAAGAAA TGTGAAGCTA 720TGATCCTTTG TTTAGTTTCA GATTCAAGAT TCGTGTGTTA TAAACCATCC GTGTTGGCCA 780CAGCTACAAT GCTTCACGTT GTAGATGAAA TTGATCCTCC CAATTGTATT GACTACAAAA 840GTCAACTTCT GGATCTTCTC AAAACCACTA AGGACGACAT AAACGAGTGT TACGAGCTCA 900TTGTCGAGCT AGCTTACGAT CATCACAACA AACGAAAACA TGATGCAAAC GAGACAACAA 960CCAATCCGGT TAGTCCAGCT GGCGTGATCG ATTTCACTTG TGATGAAAGT TCAAATGAGT 1020CATGGGAACT TAATGCTCAT CATTTCCGCG AGCCTTCATT CAAGAAAACA AGAATGGATT 1080CAACAATTCG GGTTCGGGTT TGGTTCACTT ATAAGCTTTA ATCGAGGGTA GTTGTAAACA 1140TGTAATCCGC ATGCACGCTA TTAATCCTAC GGTCCACTAC TACATATAAT CGGCCTATAA 1200AATTATAGGT TAAGATGACC AGTCGTAGGC GTCGAGATGT CCTTATGGTT GGTCAATTTC 1260TCTATGGTTT TAGGTCGTTT TTAATGTGAG ATAAATTAAA TTCGGTATGT TAAGTCTTTA 1320TCAAGCAATG GACGTTATAT TTATTGTTTG ATATTGAGAA TTAAATTCCA TGGGAAAAAA 1380AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAA 1414(2)关于SEQ ID NO6的信息(i)序列特征(A)长度100个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线型(ii)分子类型其它核酸(A)描述/desc＝PGSV5的T-DNA的DNA序列(iii)假设否(iii)反义否(ix)特征(A)名称/关键-(B)位置1..25(C)其它信息/标记＝RB/备注＝“来自PGSV5的T-DNA的右边界序列”(ix)特征(A)名称/关键-(B)位置26..75(C)其它信息/标记＝MCS/备注＝“多克隆位点”(ix)特征(A)名称/关键-(B)位置76..100(C)其它信息/标记＝RB/备注＝“来自PGSV5的T-DNA的左边界序列”(xi)序列描述SEQ ID NO6AATTACAACG GTATATATCC TGCCAGTACT CGGCCGTCGA CCGCGGTACC CGGGGAAGCT 60TAGATCCATG GAGCCATTTA CAATTGAATA TATCCTGCCG 100(2)关于SEQ ID NO7的信息(i)序列特征(A)长度17个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线型(ii)分子类型其它核酸(A)描述/desc＝用于PCR的引物1(xi)序列描述SEQ ID N07GCMTGGATYC TYAAGGT 17(2)关于SEQ ID NO8的信息(i)序列特征(A)长度17个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线型(ii)分子类型其它核酸(A)描述/desc＝用于PCR的引物2(xi)序列描述SEQ ID NO8TGCTTGTCWT TAGCTGC17(2)关于SEQ ID NO9的信息(i)序列特征(A)长度18个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线型(ii)分子类型其它核酸(A)描述/desc＝用于PCR的引物3(xi)序列描述SEQ ID NO9AAGAATGGAR YTTCTTGT 18(2)关于SEQ ID NO10的信息(i)序列特征
(A)长度19个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线型(ii)分子类型其它核酸(A)描述/desc＝用于PCR的引物4(xi)序列描述SEQ ID NO10ARAGNATYCY KGCWGCAGC 19(2)关于SEQ ID NO11的信息(i)序列特征(A)长度19个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线型(ii)分子类型其它核酸(A)描述/desc＝用于PCR的引物5(xi)序列描述SEQ ID NO11CCRTCACACC AWGNYTCAG19(2)关于SEQ ID NO12的信息(i)序列特征(A)长度16个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线型(ii)分子类型其它核酸(A)描述/desc＝用于PCR的引物6(xi)序列描述SEQ ID NO12TGGWGATTTG GATTTG16(2)关于SEQ ID NO13的信息(i)序列特征(A)长度17个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线型(ii)分子类型其它核酸(A)描述/desc＝用于PCR的引物7(xi)序列描述SEQ ID NO13ATNAANTACT TGGATCG17(2)关于SEQ ID NO14的信息(i)序列特征(A)长度19个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线型(ii)分子类型其它核酸(A)描述/desc＝用于PCR的引物8(xi)序列描述SEQ ID NO14AGCTTGCANT CTCCANTTC 19(2)关于SEQ ID NO15的信息(i)序列特征(A)长度17个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链
(D)拓扑结构线型(ii)分子类型其它核酸(A)描述/desc＝用于PCR的引物9(xi)序列描述SEQ ID NO15TCAGAAGNCC TGAANTC17(2)关于SEQ ID NO16的信息(i)序列特征(A)长度17个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线型(ii)分子类型其它核酸(A)描述/desc＝用于PCR的引物10(xi)序列描述SEQ ID NO16GANTGGATNY TNAARGT17(2)关于SEQ ID NO17的信息(i)序列特征(A)长度17个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线型(ii)分子类型其它核酸(A)描述/desc＝用于PCR的引物11(xi)序列描述SEQ ID NO17AAGABAARCC WTGGATG17(2)关于SEQ ID NO18的信息(i)序列特征(A)长度20个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线型(ii)分子类型其它核酸(A)描述/desc＝用于PCR的引物12(xi)序列描述SEQ ID NO18GTKGAAGARA CTCAAGTBCC 20(2)关于SEQ ID NO19的信息(i)序列特征(A)长度24个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线型(ii)分子类型其它核酸(A)描述/desc＝用于PCR的引物13(xi)序列描述SEQ ID NO19TGGNGTNACW GGNTKCATYY TCCA 24(2)关于SEQ ID NO20的信息(i)序列特征(A)长度20个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线型(ii)分子类型其它核酸(A)描述/desc＝用于PCR的引物PR14(xi)序列描述SEQ ID NO20GCWGNNGCNA NNNCAGANGG20(2)关于SEQ ID NO21的信息(i)序列特征(A)长度1846个碱基对(B)类型核酸(C)链型双链(D)拓扑结构线型(ii)分子类型cDNA至mRNA(iii)假设否(iii)反义否(vi)原始来源(A)生物玉米(ix)特征(A)名称/关键-(B)位置316..1389(C)其它信息/备注＝“编码CYCD2的cDNA”(xi)序列描述SEQ ID NO21CTGCAGTGGC CTAGCCGGCG TCGTCCTCCC CCTCTCHCGC TCCTCTGTCC TCCCCTCTCC60ACTTGAGAAG AACACAATTA GGAAAAAAAG GCAAAAAACA TTTACCTTTT TTCTATCTGT 120ATATTATCTG AATAAATCAA GAGGAGGAAG AGGGGAGGGA GCGAGGGAGG GGGAGGAGTA 180GCAAATCCAG ACTCCATAGC AACCAGCTCG CGAGAAGGGG AAAAGGGGGA GGAAGAGCTT 240CGCTTGTGTA TTGATTGCTC GCTGCTCCAG TCCCTGCATT CGTGCCGTTT TTGGCAAGTA 300GGTGGCGTGG CAAGCATGGT GCCGGGCTAT GACTGCGCCG CCTCCGTGCT GCTGTGCGCG 360GAGGACAACG CTGCTATTCT CGGCCTGGAC GACGATGGGG AGGAGTCCTC CTGGGCGGCC 420GCCGCTACGC CGCCACGTGA CACCGTCGCC GCCGCCGCCG CCACCGGGGT CGCCGTCGAT 480GGGATTTTGA CGGAGTTCCC CTTGCTCTCG GATGACTGCG TTGCGACGCT CGTGGAGAAG 540GAGGTGGAGC ACATGCCCGC GGAGGGGTAC CTCCAGAAGC TGCAGCGACG GCATGGGGAC 600CTGGATTTGG CCGCCGTCAG GAAGGACGCC ATCGATTGGA TTTGGAAGGT CATTGAGCAT 660TACAATTTCG CACCGTTGAC TGCCGTTTTG TCTGTGAACT ACCTCGATAG ATTCCTCTCC 720ACGTATGAGT TCCCTGAAGG CAGAGCTTGG ATGACTCAGC TCTTGGCAGT GGCTTGCTTG 780TCTTTGGCTT CGAAAATCGA AGAGACTTTT GTGCCACTCC CCTTGGATTT GCAGGTAGCG 840GAGGCAAAGT TTGTTTTTGA GGGAAGGACC ATAAAAAGGA TGGAGCTTCT GGTGCTAAGC 900ACCTTAAAGT GGAGGATGCA TGCTGTTACT GCTTGCTCAT TTGTTGAATA CTTTCTTCAT 960AAATTGAGTG ATCATGGTGC ACCCTCCTTG CTTGCACGCT CTCGCTCTTC GGACCTTGTC1020TTGAGCACCG CTAAAGGTGC TGAATTCGTG GTATTCAGAC CCTCCGAGAT TGCTGCCAGT1080GTTGCACTTG CTGCTATCGG CGAATGCAGG AGTTCTGTAA TTGAGAGAGC TGCTAGTAGC1140TGCAAATATT TGGACAAGGA GAGGGTTTTA AGATGCCATG AAATGATTCA AGAGAAGATT1200ACTGCGGGAA GCATTGTCCT AAAGTCTGCT GGATCATCAA TCTCCTCTGT GCCACAAAGC1260CCAATAGGTG TCCTGGACGC TGCAGCCTGT CTGAGTCAAC AAAGCGATGA CGCTACTGTC1320GGGTCTCCTG CAGTATGTTA CCATAGTTCT TCCACAAGCA AGAGGAGAAG GATCACTAGA1380CGTCTACTCT AATTGTGGTA CGCTTCAGGT GTGCTCCTCA CCGCTCTAGG AGTTTTTGAT1440TGGTTCAAAC ATCTTAAATT TAGTTTGGCC GCTGGAGGAT TATGGTTTAG TCAAGTAGTT1500GCTGAATGGA CAACAAAACA CGCACACTAC TTGGTCCATA AAGACAAGAA AATAACTGGC1560AGCGTCCCGC GAGCCAGCGC TGCAATCCAG TTCATGCAAG ACCCTAGAGT CCAGGGGGGG1620TGCTGGTGTA GGTAGAGAGG GAACAAGGCA TTCACATACG CCGTAGAGAT GAGAGAGCCT1680CTCGTATGTT TTGTACTTTT GCTCCTTCAG TTTGCAATGA ACTATATAAA CAAGGATTGC1740CTTGGGGCAG TGAACATTTG TCGGATGAAA AGAATCAAAA AGGATGGGGG TCGGCAGAGG1800AATAGAACAA TTTGATATAT TTCCATAAAC TAAAAAAAAA AAAAAA 184
权利要求
1.一种得到具有改变的生长特征或结构的植物的方法，该方法包括改变植物细胞内细胞分裂调控蛋白的水平或功能水平的步骤，其中所述细胞分裂调控蛋白能结合Rb样蛋白或使其磷酸化。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述的细胞分裂调控蛋白在蛋白的N末端部分包含Rb样蛋白结合基序。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述的Rb样蛋白结合基序是LxCxE。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述的细胞分裂调控蛋白是D型细胞周期蛋白。
5.根据权利要求1-4中的任意一项所述的方法，其中所述细胞分裂调控蛋白的所述水平或功能水平是通过在所述植物的所述细胞中表达包含下列可操作连接的DNA片段的嵌合基因改变的a)植物可表达的启动子区b)编码RNA或蛋白的、表达时提高或降低所述细胞分裂调控蛋白的水平或功能水平的DNA转录区；并且最佳地c)在植物细胞中有功能的3’末端形成和聚腺苷酸化信号。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述的DNA转录区编码反义RNA、核酶或有义RNA链，当它表达时，降低、抑制或防止该细胞分裂调控蛋白的表达。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述的DNA转录区编码反义RNA，当它表达时，降低、抑制或防止该细胞分裂调控蛋白的表达。
8.根据权利要求5所述的方法，其中所述的DNA转录区编码能结合Rb样蛋白或使其磷酸化的细胞分裂调控蛋白。
9.根据权利要求5所述的方法，其中所述的DNA转录区编码包含Rb样蛋白结合基序的细胞分裂调控蛋白。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述的结合基序是LxCxE。
11.根据权利要求5所述的方法，其中所述的DNA转录区编码D型细胞周期蛋白。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述的D型细胞周期蛋白是来自植物的D型细胞周期蛋白。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述的D型细胞周期蛋白选自拟南芥CYCD1、拟南芥CYCD2、拟南芥CYCD3、烟草CYCD3；1、烟草CYCD2；1、烟草CYCD3；2、洋姜CYCD1；1、玉米CYCD2和洋姜CYCD3。
14.根据权利要求12所述的方法，其中所述的DNA转录区包括选自下列序列的核苷酸序列EMBL注册号X83369的104-1108位核苷酸序列、EMBL注册号X83370的195-1346位核苷酸序列、EMBL注册号X83371的266-1396位核苷酸序列、SEQ ID N°1的182-1243位核苷酸序列、SEQ ID N°2的181-1299位核苷酸序列、SEQ ID N°3的198-1298位核苷酸序列、SEQ ID N°4的165-1109位核苷酸序列、SEQ ID N°5的48-1118位核苷酸序列或SEQ ID N°21的316-1389位核苷酸序列。
15.根据权利要求5所述的方法，其中所述的DNA转录区编码表达时提高或降低所述细胞分裂调控蛋白的所述功能水平的蛋白或肽。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述的DNA转录区编码的蛋白或肽选自突变的D型细胞周期蛋白、D型细胞周期蛋白的部分、细胞周期蛋白盒内有突变的D型细胞周期蛋白、具有185或155位氨基酸置换的D2型细胞周期蛋白、具有突变E185A或K155A的D2型细胞周期蛋白、其中去除PEST序列的D型细胞周期蛋白、其中已改变或删除了LxCxE结合基序的D型细胞周期蛋白或其中已删除LxCxE结合基序中的C残基的D型细胞周期蛋白。
17.根据权利要求5-16中的任意一项所述的方法，其中所述的植物可表达启动子是CaMV35S启动子区。
18.根据权利要求6或7所述的方法，其中所述改变的生长特征包括降低的生长速度。
19.根据权利要求8-17中的任意一项所述的方法，其中所述改变的生长特征包括提高的生长速度。
20.根据权利要求8-17中的任意一项所述的方法，其中所述改变的生长特征包括更快发芽。
21.根据权利要求8-17中的任意一项所述的方法，其中所述改变的生长特征包括开花所需时间的减少。
22.根据权利要求8-17中的任意一项所述的方法，其中所述改变的结构包括每株植物花数量的增加或每株植物种子数量的增加或每株植物果实数量的增加。
23.根据权利要求5-17中的任意一项所述的嵌合基因。
24.一种植物细胞，包含权利要求23所述的嵌合基因。
25.一种植物，基本上由权利要求24所述的植物细胞组成。
26.根据权利要求25所述的植物，是温室栽培的植物。
27.根据权利要求23所述的植物，选自松树、杨树、桉树、苜蓿、豆科植物、禾本科植物、玉米、油籽油菜、亚麻、小麦、芸苔属蔬菜、番茄、莴苣、水稻、大麦、土豆、烟草、甜菜、向日葵、康乃馨、菊花、玫瑰或郁金香。
28.根据权利要求25-27中的任意一项所述植物的种子，包含权利要求23所述的嵌合基因。
29.包含SEQ ID N°1的182-1243位核苷酸序列的分离的DNA片段。
30.包含SEQ ID N°2的181-1299位核苷酸序列的分离的DNA片段。
31.包含SEQ ID N°3的198-1298位核苷酸序列的分离的DNA片段。
32.包含SEQ ID N°4的165-1109位核苷酸序列的分离的DNA片段。
33.包含SEQ ID N°5的48-1118位核苷酸序列的分离的DNA片段。
34.包含SEQ ID N°21的316-1389位核苷酸序列的分离的DNA片段。
35.细胞分裂调控蛋白的用途，能结合Rb样蛋白的口袋或能使Rb样蛋白磷酸化以改变植物的生长特征或结构。
36.根据权利要求35所述的用途，其中所述的细胞分裂调控蛋白在蛋白的N末端部分包含LxCxE结合基序。
37.根据权利要求36所述的用途，其中所述的细胞分裂调控蛋白是D型细胞周期蛋白。
38.根据权利要求35所述的用途，其中所述的细胞分裂调控蛋白是D型细胞周期蛋白，选自拟南芥CYCD1、拟南芥CYCD2、拟南芥CYCD3、烟草CYCD3；1、烟草CYCD2；1、烟草CYCD3；2、洋姜CYCD1；1、玉米CYCD2和洋姜CYCD3。
39.根据权利要求34-47中的任意一项所述的用途，其中所述的细胞分裂调控蛋白由整合到植物细胞基因组中的嵌合基因编码。
40.编码能结合Rb样蛋白或使其磷酸化以改变植物的生长特征或结构的细胞分裂调控蛋白的DNA的用途。
41.根据权利要求40所述的用途，其中所述的细胞分裂调控蛋白是D型细胞周期蛋白。
42.根据权利要求41所述的用途，其中所述的DNA包括选自下列序列的核苷酸序列EMBL注册号X83369的104-1108位核苷酸序列、EMBL注册号X83370的195-1346位核苷酸序列、EMBL注册号X83371的266-1396位核苷酸序列、SEQ ID N°1的182-1243位核苷酸序列、SEQ ID N°2的181-1299位核苷酸序列、SEQ ID N°3的198-1298位核苷酸序列、SEQ ID N°4的165-1109位核苷酸序列、SEQID N°5的48-1118位核苷酸序列或SEQ ID N°21的316-1389位核苷酸序列。
全文摘要
本发明提供了通过改变植物细胞内细胞分裂调控蛋白,优选地结合成视网膜细胞瘤样蛋白或使其磷酸化的细胞分裂调控蛋白,更优选地细胞周期蛋白尤其是D型细胞周期蛋白的水平或其功能水平而改造植物生长或结构的方法。本发明也提供了含有编码RNA或蛋白的DNA转录区的、当表达时提高或降低细胞分裂调控蛋白水平或其功能水平的嵌合基因以及表达这样的嵌合基因的植物细胞和植物。
文档编号C12N15/09GK1251136SQ98803681
公开日2000年4月19日 申请日期1998年3月24日 优先权日1997年3月26日
发明者J·A·H·默里 申请人:剑桥大学技术服务有限公司